張帝，夏天，羅永祥，王兮

湖南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，長(zhǎng)沙 410082

目前本科基礎(chǔ)有機(jī)化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容主要由教科書中經(jīng)典的有機(jī)反應(yīng)組成，重點(diǎn)操作包含加熱回流、趁熱過濾、重結(jié)晶、薄層色譜、柱色譜、蒸餾等操作。然而有機(jī)化學(xué)是一門快速發(fā)展的學(xué)科，近年來有機(jī)合成的機(jī)理研究和合成技術(shù)已有很大進(jìn)步，但這些新興的技術(shù)在基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的推廣普及較為滯后，尤其較少涉及光促進(jìn)的反應(yīng)?，F(xiàn)代有機(jī)合成已普遍采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、核磁共振等手段進(jìn)行合成和表征，這些方法應(yīng)當(dāng)成為化學(xué)專業(yè)學(xué)生的基本技能。本實(shí)驗(yàn)從自由基環(huán)合反應(yīng)中獲得靈感，將光促進(jìn)的自由基型香豆素合成方法設(shè)計(jì)為本科教學(xué)實(shí)驗(yàn)，增加了光反應(yīng)、Schlenk技術(shù)、流動(dòng)相技術(shù)等操作練習(xí)，使本科教學(xué)與科技前沿接軌。

1 實(shí)驗(yàn)背景

1.1 香豆素合成方法的比較

香豆素是香豆酸的內(nèi)酯，其衍生物廣泛分布在自然界中。香豆素衍生物具有很好的生物活性，大量存在于抗腫瘤、抗菌、抗凝血等藥物中[1]。其中，含有香豆素骨架的分子(+)-calanolide A是一種高效的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，已被美國(guó)FDA批準(zhǔn)進(jìn)入三期臨床實(shí)驗(yàn)(圖1)。此外，香豆素類化合物還被廣泛應(yīng)用于生物熒光探針領(lǐng)域[2–4]，具有重要的研究?jī)r(jià)值和廣闊的市場(chǎng)前景。

圖1 含有香豆素骨架的功能分子

目前已有的香豆素合成方法包括：Perkin反應(yīng)、Knoevengle反應(yīng)、Wittig反應(yīng)、Pechmann反應(yīng)等(圖2)[5]，這些方法在工業(yè)合成上得到了應(yīng)用，但也存在一些局限性，例如：反應(yīng)條件劇烈、副反應(yīng)多、官能團(tuán)兼容性不好等。

圖2 香豆素結(jié)構(gòu)的傳統(tǒng)合成方法

本方案將前沿的有機(jī)合成方法和技術(shù)應(yīng)用到本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)中[6]。反應(yīng)使用了廉價(jià)的起始原料E型肉桂酸和光敏催化劑維生素B2，在405 nm的可見光照射下，利用常壓氧氣作為氧化劑，反應(yīng)條件溫和，官能團(tuán)兼容性好，且綠色環(huán)保，一定程度彌補(bǔ)了傳統(tǒng)合成方法的不足[7–18]。反應(yīng)涉及《基礎(chǔ)有機(jī)化學(xué)》教材中的烯烴順反異構(gòu)等知識(shí)點(diǎn)，也包含光促進(jìn)反應(yīng)、自由基環(huán)化、仿生催化、碳?xì)滏I直接官能團(tuán)化等有機(jī)化學(xué)前沿知識(shí)。

1.2 香豆素類化合物的分析方法

目前香豆素的定量檢測(cè)方法主要有氣相和液相色譜法等，這些方法有檢測(cè)限低、分辨率高、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，但儀器相對(duì)比較昂貴。此外，氣相色譜法因儀器本身的特點(diǎn)無法適用于高沸點(diǎn)或熱穩(wěn)定性差的香豆素類衍生物的定量分析，液相色譜儀則有儀器本身和HPLC級(jí)的溶劑耗材價(jià)格相對(duì)比較昂貴等特點(diǎn)?；诖?，本方案設(shè)計(jì)了一種操作簡(jiǎn)單且兼具準(zhǔn)確性和高靈敏度的香豆素類化合物的定量分析方法。該方法利用香豆素在堿性條件下與鹽酸羥胺反應(yīng)開環(huán)生成苯酚酰基羥胺[9]，進(jìn)一步與三氯化鐵絡(luò)合生成深紅色的配合物，對(duì)該配合物使用分光光度法定量分析[10]。

2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

2.1 實(shí)驗(yàn)原理

可見光促進(jìn)下氧氣參與的E型肉桂酸C(sp2)―H鍵氧化環(huán)內(nèi)酯化反應(yīng)見圖3?？赡艿姆磻?yīng)機(jī)理見圖4。

圖3 反應(yīng)示意圖

第一步為E型肉桂酸的碳碳雙鍵的順反異構(gòu)反應(yīng)形成Z型肉桂酸。在光敏催化劑存在下，可見光促進(jìn)烯烴雙鍵斷開，形成雙自由基中間體I1，此時(shí)的碳碳單鍵可以自由旋轉(zhuǎn)，重構(gòu)碳碳雙鍵形成Z型烯烴。本項(xiàng)目針對(duì)反應(yīng)基于計(jì)算化學(xué)手段得到R = CH3的E型到Z型烯烴轉(zhuǎn)化的能量差為6.7 kJ·mol-1(圖5)，該計(jì)算過程可在普通筆記本電腦上完成。

圖5 烯烴順反異構(gòu)

第二步為經(jīng)由自由基過程的C(sp2)―H鍵氧化環(huán)內(nèi)酯化。如圖4中機(jī)理所示，光敏催化劑維生素B2攫取羧酸的質(zhì)子形成RFH+和羧酸負(fù)離子I2，再被可見光激發(fā)到具有強(qiáng)氧化性的激發(fā)RFH+*，RFH+*將羧酸單電子氧化成羧基自由基I3時(shí)得到RFH*。所得到的羧基自由基發(fā)生對(duì)芳環(huán)的自由基加成，得到中間體I4，I4經(jīng)由HAT (Hydrogen Atom Transfer)過程得到香豆素最終產(chǎn)物。在HAT過程中RFH*得到氫原子形成RFH2，最后經(jīng)由氧氣氧化回到光敏催化劑的初始狀態(tài)RF完成催化循環(huán)。

本方案中香豆素類衍生物的定量分析是基于香豆素在堿性條件下與鹽酸羥胺反應(yīng)開環(huán)再與三氯化鐵配位形成有深紅色的配合物的反應(yīng)特性，以及分光光度法對(duì)一系列濃度梯度的該配合物作標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合出吸光度與產(chǎn)物濃度的定量關(guān)系(圖6)。

圖6 異羥肟酸鐵顯色反應(yīng)

2.2 試劑或材料

實(shí)驗(yàn)中所用主要試劑見表1。

表1 化學(xué)試劑信息

市售的分析純甲醇和乙腈含有少量的水、氧氣以及雜質(zhì)，為了使反應(yīng)有更好的重復(fù)性，甲醇和乙腈根據(jù)溶劑處理手冊(cè)重蒸純化處理[18]。

薄層色譜的高錳酸鉀顯色劑配制方法：將1.5 g高錳酸鉀和5.0 g碳酸氫鈉溶解于400 mL水中，攪拌均勻。

三氯化鐵溶液配制方法：5 g無水氯化鐵，溶解于10 mL濃鹽酸，再加入90 mL去離子水稀釋。

其他儀器和耗材：移液管(0.2 mL、0.5 mL、1 mL、2 mL)，容量瓶，磁力攪拌器，聚四氟乙烯攪拌磁子，薄層層析板，薄層層析板專用玻璃缸，稱量紙，藥匙，量筒，層析柱，毛細(xì)管，試管，錐形瓶，磨口圓底燒瓶，試劑瓶，注射器(2 mL)，滴管，乳膠氣球等。

2.3 儀器和表征方法

反應(yīng)在Schlenk體系中進(jìn)行。1H NMR和13C NMR用JEOL JNM-ECZ400S/L1核磁共振儀測(cè)定(400 MHz，室溫，溶劑為氘代氯仿)，化學(xué)位移基準(zhǔn)(δ)由氘代氯仿的參考值給出：δ7.26 (1H NMR)，δ77.16(13C NMR)。405 nm LED光反應(yīng)器(自制，光宏1.0 W 405 nm LED燈珠20粒，如圖7)。TLC顯色紫外燈(254 nm，ZF-I型三用紫外分析儀，上海光豪)。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國(guó)海道夫，Hei-VAP Core ML/G3)。紫外-可見光分光光度計(jì)(日本島津，UV-1900I)。

圖7 實(shí)驗(yàn)裝置

2.4 實(shí)驗(yàn)步驟與方法

用分析天平稱取E型肉桂酸(75.0 mg, 0.500 mmol, 1.0 equiv)，維生素B2 (10.0 mg, 0.0250 mmol,5% (x))，無水硫酸鎂(0.300 g, 2.50 mmol, 5.0 equiv)，加入到干燥的Schlenk反應(yīng)管中。將反應(yīng)管抽真空，再充入氧氣，反復(fù)3次，保障反應(yīng)在氧氣氛下進(jìn)行，然后插上一個(gè)常壓氧氣球。用注射器向Schlenk管中加入無水甲醇(2 mL)和無水乙腈(2 mL)。將Schlenk反應(yīng)管置入光反應(yīng)器中，在405 nm可見光照射下通風(fēng)攪拌6 h，期間用薄層色譜法監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)度。反應(yīng)結(jié)束后，過濾除去不溶物，用乙酸乙酯(15 mL)洗滌沉淀，合并濾液和洗滌液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去溶劑，柱層析(V石油醚:V乙酸乙酯=8 : 1)得到最終產(chǎn)物(圖8)。產(chǎn)物溶解于氘代氯仿，利用核磁氫譜和碳譜表征。

圖8 (a) 光促進(jìn)的反應(yīng)過程；(b) 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀移除溶劑；(c) 薄層色譜點(diǎn)板情況(堿性高錳酸鉀顯色)

配制標(biāo)準(zhǔn)溶液：利用萬分之一分析天平稱量和100 mL的容量瓶定容，配制香豆素的乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.05 mol·L-1)，鹽酸羥胺的乙醇溶液(0.5 mol·L-1)，稀鹽酸溶液(1.0 mol·L-1)，氫氧化鉀的水溶液(6.0 mol·L-1)，三氯化鐵的水溶液(5.0% (w))。本文中標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)應(yīng)的香豆素乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液配制時(shí)的實(shí)際稱量質(zhì)量為0.7291 g。

用移液管分別向6支試管中精確加入鹽酸羥胺的乙醇溶液(1.000 mL)和氫氧化鉀水溶液(0.200 mL)，然后用移液管分別往上述6支試管中精確加入香豆素乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.500 mL，0.600 mL，0.700 mL，0.800 mL，0.900 mL，1.000 mL)，加熱至沸騰5 min。冷卻后，用移液管加入稀鹽酸溶液(2.000 mL)和氯化鐵的水溶液(0.300 mL)，后定容至10 mL，振蕩搖晃使其均勻。在最佳吸收波長(zhǎng)處(450 nm)，先進(jìn)行空白實(shí)驗(yàn)掃描基線，然后分別測(cè)量各樣品的吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

配制待測(cè)溶液：用容量瓶定容，將產(chǎn)物精確配制成乙醇溶液(10 mL)。

用移液管向測(cè)試樣品的試管中精確加入鹽酸羥胺的乙醇溶液(1.000 mL)和氫氧化鉀水溶液(0.200 mL)，然后精確加入待測(cè)的香豆素乙醇溶液(1.000 mL)，加熱至沸騰約5 min。冷卻后，用移液管加入稀鹽酸溶液(2.000 mL)和氯化鐵的水溶液(0.300 mL)，后定容至10 mL，搖晃均勻。測(cè)量其吸光度值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合出的方程，計(jì)算待測(cè)產(chǎn)物中的香豆素含量。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 產(chǎn)率

為滿足本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)要求，需要將原始文獻(xiàn)中所報(bào)道的反應(yīng)規(guī)模0.1 mmol放大至0.5 mmol，且保證反應(yīng)產(chǎn)率和反應(yīng)重復(fù)性以及控制反應(yīng)時(shí)間。本方案中分別從光的輻射強(qiáng)度、溫度、催化劑、反應(yīng)氣體氛圍、溶劑等方面進(jìn)行了一系列優(yōu)化(表2)，經(jīng)不同實(shí)驗(yàn)人員多次重復(fù)，反應(yīng)產(chǎn)率穩(wěn)定在75% ± 2%，無明顯副反應(yīng)。

表2 反應(yīng)條件優(yōu)化

3.2 結(jié)構(gòu)表征結(jié)果

測(cè)得目標(biāo)產(chǎn)物的核磁共振氫譜和碳譜(圖9)，與已知文獻(xiàn)譜圖[5]比對(duì)，確定其結(jié)構(gòu)。核磁數(shù)據(jù)如下：

圖9 核磁共振氫譜(上)與碳譜(下)

3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量分析結(jié)果

對(duì)6組不同濃度的樣品每組平行測(cè)量3次其吸光度，取平均值得到平均吸光度(表3)，進(jìn)行線性擬合(圖10)，線性方程為y= 0.0264x+ 0.0703，相關(guān)系數(shù)r= 0.999，符合非常好的線性關(guān)系。

圖10 香豆素含量與吸光度之間的線性關(guān)系

表3 異羥肟酸鐵在不同濃度下的吸光度

3.4 條件優(yōu)化思路

自制的405 nm可見光光反應(yīng)器，使用了雙排LED燈珠相對(duì)照射，(每個(gè)燈珠1 W，20個(gè)燈珠，共20 W)，相較于普通臺(tái)燈反應(yīng)效率(產(chǎn)率45%)有明顯提升，且反應(yīng)器內(nèi)裝有風(fēng)扇通風(fēng)，保證了反應(yīng)體系溫度不會(huì)因長(zhǎng)時(shí)間燈光照射而過熱，使體系接近環(huán)境溫度，且無光泄露污染，完全滿足實(shí)驗(yàn)教學(xué)安全性要求。

反應(yīng)需要充足的氧氣源，對(duì)比15 mL的Schlenk管中充入氧氣后封管反應(yīng)，因氧氣量不夠，導(dǎo)致產(chǎn)率下降。外加常壓氧氣氣球，一方面可以補(bǔ)充氧氣源，另一方面可以穩(wěn)定反應(yīng)體系內(nèi)的壓力。

3.5 拓展與放大(連續(xù)流動(dòng)相反應(yīng)，Continuous Flow Synthesis)

本方案中在Schlenk反應(yīng)管中的反應(yīng)規(guī)模為0.5 mmol，分離收率為78%，可以作為半微量實(shí)驗(yàn)應(yīng)用于本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)中。但如果直接在Schlenk反應(yīng)瓶中將反應(yīng)規(guī)模放大10倍到5.0 mmol，因?yàn)楣鈱?duì)溶液的輻射面積和穿透性均有限，造成分離收率急劇下降到25%。本方案利用前沿的連續(xù)流動(dòng)相技術(shù)，結(jié)合本反應(yīng)需要光照以及氧氣參與等特點(diǎn)，設(shè)計(jì)了一套簡(jiǎn)單、廉價(jià)、實(shí)用的連續(xù)流動(dòng)相的光輻射氣體反應(yīng)裝置(圖11)。其部件包括：光反應(yīng)器、石英螺旋管、可控流速的蠕動(dòng)泵、氣球等。將螺旋管置于光反應(yīng)器內(nèi)，增大光照面積、提高光輻射效率，蠕動(dòng)泵可帶動(dòng)封閉體系內(nèi)溶液循環(huán)流動(dòng)，并增加溶液與氧氣的接觸。因?yàn)橛袡C(jī)溶劑持續(xù)流動(dòng)造成體系內(nèi)壓力變化，氧氣氣球同時(shí)也可以起到緩沖作用穩(wěn)定體系內(nèi)壓力。利用這套裝置可將反應(yīng)規(guī)模放大到5.0 mmol，使用10% (x)的光敏催化劑，控制流速為41.5 mL·min-1，反應(yīng)24 h，以72%的分離收率得到最終目標(biāo)產(chǎn)物，且無其他副反應(yīng)，該連續(xù)流動(dòng)相方案可以作為學(xué)生實(shí)驗(yàn)中的另一種選擇方案進(jìn)行大規(guī)模反應(yīng)嘗試。

圖11 連續(xù)流動(dòng)相光反應(yīng)裝置示意圖

本裝置在提高反應(yīng)實(shí)用性的同時(shí)，為本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)提供了更多樣化的選擇，讓學(xué)生對(duì)反應(yīng)的合成應(yīng)用和工業(yè)生產(chǎn)有了更進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)。反應(yīng)裝置的搭建也讓學(xué)生從多角度思考影響反應(yīng)效率的因素，提高學(xué)生多方面動(dòng)手和思維能力，體驗(yàn)化學(xué)實(shí)驗(yàn)的趣味性。

4 結(jié)語

本項(xiàng)目包括有機(jī)合成反應(yīng)，產(chǎn)物純化和表征，定量分析三個(gè)部分。合成反應(yīng)具有安全高效，條件溫和，起始原料廉價(jià)易得，無明顯副反應(yīng)，操作簡(jiǎn)單，環(huán)境友好，重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。其作為一項(xiàng)本科教學(xué)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，可以很好地起到鞏固有機(jī)化學(xué)基礎(chǔ)知識(shí)和訓(xùn)練有機(jī)實(shí)驗(yàn)操作的作用，同時(shí)多學(xué)科交叉，有利于學(xué)生對(duì)多學(xué)科知識(shí)的融會(huì)貫通。由于剩余原料肉桂酸和香豆素的Rf值相差很大，因此純化過程簡(jiǎn)單。利用分光光度法定量分析化合物確定其純度是本科分析化學(xué)教學(xué)的重要內(nèi)容。異羥肟酸鐵的顯色反應(yīng)一般被應(yīng)用于定性鑒定酯類化合物，本方案將該特異性反應(yīng)結(jié)合分光光度法應(yīng)用于香豆素產(chǎn)物的定量表征。實(shí)驗(yàn)操作涉及移液、定容、絡(luò)合物顯色，紫外-可見分光光度計(jì)的使用，以及連續(xù)流動(dòng)相光輻射氣體反應(yīng)裝置的搭建等一系列操作。

本方案通過學(xué)科交叉的綜合性實(shí)驗(yàn)，對(duì)學(xué)生的基礎(chǔ)知識(shí)和實(shí)驗(yàn)技能進(jìn)行了全面系統(tǒng)的訓(xùn)練。既培養(yǎng)學(xué)生了解化學(xué)前沿知識(shí)也注重學(xué)生基礎(chǔ)知識(shí)的鞏固。本實(shí)驗(yàn)歷時(shí)約10 h，具有內(nèi)容涵蓋廣泛、安全、重復(fù)性好等特點(diǎn)，非常適合于本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)[19–21]?？刹捎梅纸M合作完成實(shí)驗(yàn)的模式，提高學(xué)生團(tuán)隊(duì)精神和協(xié)作能力。