甄大衛(wèi)， 徐玉霞， 張晨萍，2， 張 玲， 謝建春,*， 孫寶國

(1.北京工商大學(xué) 輕工科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 北京 100048； 2.忻州師范學(xué)院， 山西 忻州 034000)

脂肪受熱氧化可產(chǎn)生人們喜愛的風(fēng)味[1]，脂肪氧化對不同種動物肉特征風(fēng)味的形成有貢獻(xiàn)[2-3]。脂肪調(diào)控氧化，指在控制通空氣量及加熱溫度的條件下將脂肪氧化到某個(gè)程度。調(diào)控氧化脂肪與蛋白酶解物、氨基酸、還原糖進(jìn)行熱反應(yīng)，即“脂肪調(diào)控氧化- 熱反應(yīng)”兩步法，制備的肉味香精具有肉香濃郁、動物肉的特征香味突出的優(yōu)點(diǎn)[4-5]。脂肪氧化遵循自由基反應(yīng)歷程，氧化過程極其復(fù)雜，氧化時(shí)可產(chǎn)生烴類、醛類、酮類、酸類、酯類、呋喃類等揮發(fā)性化合物[1]。脂肪氧化產(chǎn)生的羰基化合物易于參與美拉德反應(yīng)，形成帶烷基鏈的雜環(huán)化合物，如在“半胱氨酸- 還原糖”美拉德反應(yīng)體系中，(E,E)-2,4-癸二烯醛可分別與氨、硫化氫反應(yīng)，生成2-戊基吡嗪、2-戊基噻吩[5-6]。脂肪醛還可與美拉德反應(yīng)中產(chǎn)生的二氫吡嗪反應(yīng)，生成帶烷基鏈的吡嗪[7]。

由于揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)(香氣物質(zhì))的強(qiáng)親脂性，脂肪中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)較難分離。研究者們曾采用吹掃- 冷阱捕集[8-11]、超臨界CO2萃取[12-13]、同時(shí)蒸餾萃取[14]、頂空固相微萃取[14-15]等方法結(jié)合氣- 質(zhì)聯(lián)機(jī)(gas chromatography and mass spectrometry，GC- MS)分析脂肪氧化產(chǎn)生的香氣物質(zhì)。吹掃- 冷阱捕集法收集揮發(fā)性組分損失大，超臨界CO2萃取法需專用設(shè)備，同時(shí)蒸餾萃取法熱敏感性成分可能被破壞。頂空固相微萃取法，操作簡單，但萃取量小，對痕量組分檢測靈敏度不理想[15]。在食品風(fēng)味分析中，GC- MS給出的為揮發(fā)性化合物信息，要獲知哪些成分對總體香氣有貢獻(xiàn)，還須采用氣相色譜- 嗅聞法(gas chromatography-olfactometry，GC- O)對樣品中的香氣活性成分進(jìn)行分析[16-17]。GC- O分析時(shí)常采用芳香提取物稀釋分析(aroma extract dilution analysis，AEDA)法檢測，化合物的稀釋因子(flavor dilution, FD)越大，表示該化合物對總體香氣的貢獻(xiàn)越大。

有關(guān)脂肪調(diào)控氧化工藝研究人們已進(jìn)行了較多報(bào)道，脂肪調(diào)控氧化產(chǎn)物往往采用過氧化值、酸值指標(biāo)進(jìn)行表征[4-5]，但脂肪調(diào)控氧化到不同程度(即氧化指標(biāo)不同時(shí))所具有的香氣物質(zhì)構(gòu)成及差異尚不清楚。本研究隨氧化時(shí)間延長獲得3個(gè)具有不同氧化程度且感官氣味具有代表性的調(diào)控氧化豬脂樣品，然后利用溶劑輔助蒸發(fā)(solvent assistant flavor evaporation，SAFE) 裝置具有的高真空蒸餾并液氮冷凝優(yōu)勢，直接蒸餾收集揮發(fā)性組分，再采用GC- MS和AEDA/GC- O法分析香氣物質(zhì)構(gòu)成。我國是豬肉生產(chǎn)及消費(fèi)大國，豬肉風(fēng)味深受大眾喜愛。研究結(jié)果對于進(jìn)一步了解脂肪調(diào)控氧化機(jī)制及完善“脂肪調(diào)控氧化- 熱反應(yīng)”兩步法制備豬肉味香精的工藝具有指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

精煉豬脂，安徽牧羊油脂有限公司。

冰醋酸(分析純)、乙醇(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%)、乙醚(分析純)、三氯甲烷(分析純)、碘化鉀(分析純)、硫代硫酸鈉(分析純)、可溶性淀粉(化學(xué)純)、酚酞(化學(xué)純)、氫氧化鉀(化學(xué)純)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司；鄰二氯苯(分析純)，北京化學(xué)試劑公司；二氯甲烷(色譜純)、C5～C30正構(gòu)烷烴(色譜純)、甲醇(色譜純)，迪馬科技有限公司；乙醛(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%，以下標(biāo)準(zhǔn)品括號內(nèi)均為質(zhì)量分?jǐn)?shù))、丙醛(95%)、丁醛(95%)、丁醇(95%)、1-戊烯-3-醇(95%)、戊醛(98%)、戊醇(95%)、己醛(95%)、(E)-2-己烯醛(95%)、2-庚酮(95%)、庚醛(95%)、2-庚醇(95%)、(E)-2-庚烯醛(95%)、1-辛烯-3-醇(95%)、2-辛酮(95%)、2-戊基呋喃(95%)、辛醛(98%)、(E,E)-2,4-庚二烯醛(95%)、(E)-3-辛烯-2-酮(95%)、(E)-2-辛烯醛(95%)、辛醇(95%)、2-壬酮(95%)、壬醛(95%)、(E,Z)-2,6-壬二烯醛(95%)、(E)-2-壬烯醛(98%)、壬醇(95%)、(E,E)-2,4-壬二烯醛(95%)、(E)-2-癸烯醛(95%)、(E,E)-2,4-癸二烯醛(95%)、(E)-2-十一烯醛(95%)、(E)-2-十二烯醛(95%)、2-十三酮(95%)、(E)-3-壬烯-2-酮(95%)，百靈威科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

溶劑輔助蒸發(fā)裝置，莘縣玻璃儀器有限公司定制；XDS5型復(fù)合分子渦輪泵，英國Edwards公司；DF2101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，河南省予華儀器有限公司；D- 8403型電動攪拌器，天津市華興科學(xué)儀器廠；7890A- 5975C型氣相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用儀(配有電子轟擊離子源)、7890A型氣相色譜(配有FID檢測器)，美國Agilent公司；DATU2000型嗅聞儀，美國DATU Inc公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1豬脂的氧化

在裝有電動攪拌器、溫度計(jì)和回流冷凝管的2 000 mL五口燒瓶中加入500 g精煉豬脂，加熱使其熔化，當(dāng)溫度上升到130 ℃，開始通空氣攪拌，并計(jì)時(shí)，空氣流速1.2 L/min，轉(zhuǎn)速為450～500 r/min，在氧化時(shí)間為1、3、4 h取樣，參照文獻(xiàn)[4]測過氧化值和酸值。

1.3.2揮發(fā)性組分分離

溶劑輔助蒸發(fā)裝置見圖1。超級恒溫水浴為50 ℃，液氮冷凝，系統(tǒng)壓力為5×10-4Pa。將1.3.1節(jié)所得氧化豬脂全部蒸餾處理，蒸餾完畢，將收集液冷凍離心10 min(4 ℃，12 000 r/min)，取上層油狀液體加無水硫酸鈉干燥，將液體小心傾倒出并用0.45 μm膜過濾。量取液體樣品體積，然后待GC- MS及GC- O分析。

1.滴液漏斗；2.超級恒溫水槽；3.蒸餾瓶；4.蒸餾頭；5.冷阱；6.收集燒瓶；7.保溫瓶。

1.3.3氣相色譜-質(zhì)譜分析

1.3.2節(jié)所得樣品加入內(nèi)標(biāo)鄰二氯苯， 內(nèi)標(biāo)在樣品中的質(zhì)量濃度為60 μg/mL(溶于二氯甲烷后添加)，GC- MS分析的色譜柱為DB- WAX(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，升溫程序：起始40 ℃，以2.5 ℃/min升至180 ℃，再以10 ℃/min升至230 ℃，230 ℃運(yùn)行2 min。載氣為He，流速1 mL/min。進(jìn)樣品溫度為250 ℃，分流比為30∶1，進(jìn)樣量為0.2 μL。

電子轟擊離子源，電子能量70 eV；輔助加熱線溫度230 ℃；離子源溫度230 ℃，四級桿溫度150 ℃，全掃描模式，質(zhì)量掃描范圍m/z40～450。

1.3.4氣相色譜-嗅聞分析

色譜柱為HP- 5毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；升溫程序：起始溫度40 ℃，以5 ℃/min升到280 ℃，保持3 min；進(jìn)樣口溫度250 ℃，載氣N2，流速1 mL/min，進(jìn)樣0.2 μL。

3名評價(jià)員(2男、1女)，平均年齡23歲，事先采用香料標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行培訓(xùn)。對1.3.2節(jié)所得樣品用溶劑二氯甲烷按照2的倍數(shù)逐級稀釋，并進(jìn)行GC- O分析，直到嗅聞不到氣味時(shí)停止，每種化合物的最高稀釋倍數(shù)記為其稀釋因子(flavor dilution, FD)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

氣- 質(zhì)聯(lián)機(jī)分析采用檢索NIST 2010質(zhì)譜庫、保留指數(shù)及標(biāo)品鑒定化合物，化合物含量按照式(1)計(jì)算，取兩個(gè)平行樣品的均值。嗅聞分析基于GC- MS分析結(jié)果、保留指數(shù)、嗅聞的氣味及標(biāo)準(zhǔn)品鑒定化合物，將3名評價(jià)員均嗅聞到的化合物作為結(jié)果，稀釋因子為3名評價(jià)員的均值。

(1)

式(1)中，Wi為化合物的質(zhì)量比，ng/g脂肪；Ai為化合物的峰面積；As為內(nèi)標(biāo)的峰面積；Cs為內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量濃度，μg/mL；V為所得蒸餾液體積，mL；m為氧化脂肪的質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 3個(gè)不同氧化程度豬脂樣品信息

隨反應(yīng)時(shí)間延長，獲得的3個(gè)具有不同氧化程度且感官氣味有代表性樣品的信息，見表1。

表1 3個(gè)不同氧化程度豬脂樣品的氧化指標(biāo)和氣味特征

在脂肪調(diào)控氧化過程中，隨氧化時(shí)間的延長及氧化程度的升高，氧化脂肪的主要?dú)馕蹲兓癁椤皫嗖菹? 濃油脂香- 有刺激氣味”。在氧化時(shí)間1、3、4 h取出表示上述氣味特征變化的3個(gè)代表性樣品，標(biāo)為1號、2號、3號，樣品的氧化程度用過氧化值、酸值表示。由表1可知，1號樣品稍帶青草香，而隨著氧化時(shí)間延長，氧化程度的升高，2號樣品則為濃油脂香，3號樣品則有刺激性氣味。

2.2 3個(gè)不同氧化程度豬脂樣品揮發(fā)性成分GC- MS分析結(jié)果

3個(gè)氧化豬脂樣品的揮發(fā)性成分GC- MS分析結(jié)果，見表2。3個(gè)樣品中共鑒定出91個(gè)化合物，包括醛類20個(gè)，酮類9個(gè)，醇類12個(gè)，酸類17個(gè)，呋喃類4個(gè)，酯類11個(gè)，烷烴類18個(gè)。3個(gè)樣品均是醛類個(gè)數(shù)最多且含量最高，分別為19、19、20個(gè)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)占46.23%、54.24%、67.11%；其次是酸類，分別占24.32%、13.10%、12.61%。3個(gè)樣品中含量高的前5個(gè)化合物均是己醛、(E)-2-庚烯醛、(E)-2-辛烯醛、1-辛烯-3-醇和己酸。史亞靜等[18]采用吹掃捕集- GC- MS研究豬油風(fēng)味物質(zhì),檢測到較高含量的己醛、(E)-2-辛烯醛。徐永霞等[19]采用SPME- GC- MS在氧化豬脂肪中檢測較高含量的(E)-2-庚烯醛、(E)-2-辛烯醛、1-辛烯-3-醇和己酸。比較3個(gè)樣品，1號樣品中鑒定出84個(gè)揮發(fā)性化合物；2號樣品中鑒定出揮發(fā)性化合物個(gè)數(shù)最多，為87個(gè)；3號樣品中鑒定出揮發(fā)性化合物個(gè)數(shù)最少，為76個(gè)。比較單個(gè)揮發(fā)性化合物的質(zhì)量比以及所有揮發(fā)性化合物的質(zhì)量比和，也是隨氧化程度升高，為先升高后降低，總體上2號樣品中揮發(fā)性化合物的質(zhì)量比最高。3號樣品的氧化程度高于2號樣品，其鑒定出的揮發(fā)性化合物總量反而減少，這可能與氧化時(shí)間長及氧化程度高時(shí)，體系內(nèi)有些揮發(fā)性化合物發(fā)生復(fù)雜的二次反應(yīng)(如醛類化合物之間發(fā)生羥醛縮合反應(yīng))甚至聚合反應(yīng)變成不揮發(fā)性化合物有關(guān)[20]。脂肪在空氣中受熱氧化為復(fù)雜的自由基反應(yīng)，通常條件下，脂肪中的不飽和脂肪酸易于氧化[20]。前期研究表明：動物脂肪的調(diào)控氧化為溫和氧化，主要為其所含油酸、亞油酸氧化成氫過氧化物[21]，氫過氧化物降解則產(chǎn)生揮發(fā)性化合物。檢測到的辛醛、壬醛、2-癸烯醛，可由油酸氧化降解產(chǎn)生；檢測到的戊醛、己醛、(E)-2-辛烯醛、(E)-2-壬烯醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛、(E,Z)-2,4-癸二烯醛、1-辛烯-3-醇、戊醇，可由亞油酸氧化降解產(chǎn)生；檢測到的丙醛、丁醛、(E)-2-丁烯醛、(E)-2-戊烯醛、(E)-2-己烯醛，可由亞麻酸氧化降解產(chǎn)生[20]。脂肪氧化產(chǎn)生的醛進(jìn)一步氧化可產(chǎn)生酸，酸與醇反應(yīng)可產(chǎn)生酯[22]。

表2 3個(gè)不同氧化程度豬脂樣品的SAFE- GC- MS分析結(jié)果

續(xù)表2

續(xù)表2

早期動物油常作為食品煎炸油使用，因而相關(guān)文獻(xiàn)較多地報(bào)道了豬脂高溫加熱下(如190 ℃)產(chǎn)生的揮發(fā)性成分[9-11]。經(jīng)比較，本研究檢測的化合物在這些文獻(xiàn)中幾乎均有報(bào)道。但本實(shí)驗(yàn)鑒定出的醛類化合物數(shù)量遠(yuǎn)多于Song等[3]、Ramirez等[23]采用頂空固相微萃取/氣- 質(zhì)聯(lián)機(jī)分析脂肪氧化產(chǎn)物或煎脂肪的結(jié)果。這除了與樣品不同有關(guān)外，很可能還與本研究先采用SAFE裝置高真空蒸餾得到揮發(fā)性樣品，然后進(jìn)行分析，從而提高了GC- MS檢測靈敏度有關(guān)。

2.3 3個(gè)不同氧化程度豬脂樣品香氣成分GC- O分析結(jié)果

3個(gè)氧化豬脂樣品香氣成分的AEDA/GC- O分析結(jié)果, 見表3。Young等[24]曾采用吹掃捕集/GC- O分析100 ℃加熱牛脂肪的香氣成分，鑒定出16個(gè)化合物。但總體而言，文獻(xiàn)報(bào)道的關(guān)于加熱脂肪風(fēng)味的分析，多數(shù)僅采用氣- 質(zhì)聯(lián)機(jī)分析了揮發(fā)性成分，而并未采用GC- O分析“香氣活性”成分。本實(shí)驗(yàn)GC- O分析中，檢測到的氣味類型包括青香、油脂香、蘑菇香、甜香、奶香、水果香等，其中以“青香”“脂肪香(油脂香)”出現(xiàn)的頻率高。GC- O分析共鑒定出39個(gè)化合物，包括22個(gè)醛、7個(gè)酮、6個(gè)醇、2個(gè)酯，以及2-戊基呋喃和(E)-6-十二烯，即鑒定出的多數(shù)化合物為脂肪醛，表明脂肪醛為脂肪調(diào)控氧化產(chǎn)生的主要風(fēng)味物質(zhì)。值得注意的是，GC- MS檢測到的烴類、酸類化合物(見表2)，GC- O均未檢測到，這與烴類、酸類化合物往往具有較高氣味閾值有關(guān)。GC- MS檢測到的酯類化合物，僅有2種GC- O檢測有氣味活性，這除了與氣味閾值有關(guān)外，還與多數(shù)酯的含量較低有關(guān)。

表3 3個(gè)不同氧化程度豬脂樣品的SAFE- GC- O分析結(jié)果

續(xù)表3

將表3結(jié)果繪制成圖2，對3個(gè)樣品的GC- O結(jié)果進(jìn)行比較。由圖2可知，與GC- MS分析結(jié)果一致，2號樣品GC- O檢測出的香氣活性化合物數(shù)量最多。3號樣品中檢測到的香氣活性化合物不僅數(shù)量少，且稀釋因子均較低，這可能是造成3號樣品的油脂香氣較2號樣品弱的原因，而與2號樣品相比，3號樣品中短鏈醛(如戊醛)的數(shù)量占比例大。短鏈醛一般有尖刺氣味，這可能是造成3號樣品有刺激性氣味的原因。與2號樣品不同，1號樣品有青草香氣，可能因1號樣品含有的油脂香氣化合物的數(shù)量稍少于2號(例如，1號樣品未檢測到辛醇、壬醛)或稀釋因子低于2號樣品中[如1號樣品中的(E,E)-2,4-癸二烯醛稀釋因子低于2號樣品]造成。

化合物編號對應(yīng)表3中化合物名稱。

由圖2和表3可知，2號樣品中稀釋因子高(log2FD≥11)的為1-辛烯-3-醇(編號26)、己醛(編號6)、(E)-2-辛烯醛(編號11)、(E)-2-壬烯醛(編號13)、(E,E)-2,4-癸二烯醛(編號20)、(E)-2-十二烯醛(編號22)、戊醛(編號4)、庚醛(編號7)、2-戊基呋喃(編號39)；1號樣品中稀釋因子高(Log2FD≥10)的為(E)-2-十二烯醛(編號22)、1-辛烯-3-醇(編號26)、己醛(編號6)、戊醛(編號4)、(E)-2-辛烯醛(編號11)、(E)-2-壬烯醛(編號13)、(E,E)-2,4-癸二烯醛(編號20)、(E,E)-2,4-壬二烯醛(編號17)、(E)-2-庚烯醛(編號8)、2-壬酮(編號33)；3號樣品中稀釋因子高(log2FD≥4)的為己醛(編號6)、(E)-2-庚烯醛(編號8)、(E)-2-辛烯醛(編號11)、1-辛烯-3-醇(編號26)、(E,E)-2,4-癸二烯醛(編號20)、(E,E)-2,4-壬二烯醛(編號17)、(E)-2-壬烯醛(編號13)、戊醛(編號4)、庚醛(編號7)、2-壬酮(編號33)。稀釋嗅聞法中，化合物的稀釋因子越大，表明其對總體香氣貢獻(xiàn)越大。因而上述這些稀釋因子大的化合物對各自樣品的總體香氣有重要貢獻(xiàn)。其中上述的3個(gè)代表性樣品共有的重要化合物為：1-辛烯-3-醇(編號26)、己醛(編號6)、(E)-2-辛烯醛(編號11)、(E)-2-壬烯醛(編號13)、(E,E)-2,4-癸二烯醛(編號20)、戊醛(編號4)，故認(rèn)為它們是不同氧化程度調(diào)控氧化豬脂樣品中均存在的重要香氣成分。而這幾個(gè)化合物在對豬肉的風(fēng)味分析中常檢測到。例如，Wang等[25]利用SAFE- AEDA/GC- O分析不同加工方式的4種豬肉湯檢測到了己醛。Timon等[26]采用吹掃捕集及頻率法GC- O分析炸豬里脊肉，鑒定出戊醛、己醛、1-辛烯-3-醇，且這3種化合物的檢測頻率都很高。Zhao等[27]分析燉煮黑豬肉湯，檢測出戊醛、己醛、(E)-2-壬烯醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛、1-辛烯-3-醇，其中(E)-2-壬烯醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛有較高的稀釋因子；肖群飛等[22]在豬五花肉燉煮肉湯中鑒定出33個(gè)香氣化合物，己醛、(E)-2-辛烯醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛、1-辛烯-3-醇也具有較高稀釋因子。徐永霞等[28]報(bào)道清燉肉湯中己醛、(E,E)-2,4-壬二烯醛、1-辛烯-3-醇是關(guān)鍵香味化合物。Xie等[29]在小香豬烤肉中鑒定出戊醛、己醛、(E)-2-壬烯醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛，其中戊醛、己醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛的檢測頻率高，對小香豬烤肉的香氣有重要貢獻(xiàn)。

3 結(jié) 論

隨反應(yīng)時(shí)間取樣獲得3個(gè)不同氧化程度且感官氣味有代表性的氧化豬脂樣品，采用GC- MS分析共鑒定出91個(gè)揮發(fā)性化合物，以醛類數(shù)量最大及含量最高。隨著氧化程度升高，樣品氣味特征從有青草味、到典型油脂味、再到有刺激性氣味變化，樣品的揮發(fā)性化合物數(shù)量和含量呈現(xiàn)先增大后減少的趨勢，其中的氧化程度適中的樣品鑒定出的化合物數(shù)量最多且含量最高。采用GC- O分析共鑒定出39個(gè)香氣化合物，仍以醛類化合物數(shù)量最多，且仍是氧化程度適中樣品中鑒定出的香氣化合物數(shù)量最多。氧化程度過高的樣品(過氧化值271.5 mmol/kg、酸值3.10 mg KOH/kg)鑒定出的香氣化合物數(shù)量反而少，可能與氧化時(shí)間長時(shí)，氧化反應(yīng)復(fù)雜化有關(guān)。綜合3個(gè)樣品的GC- O分析結(jié)果，得出豬脂調(diào)控氧化不同程度均具有的重要香氣成分為1-辛烯-3-醇、己醛、(E)-2-辛烯醛、(E)-2-壬烯醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛、戊醛。