亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        非人靈長類動物口鼻式氣溶膠暴露系統(tǒng)運行效果評價

        2022-08-01 06:03:16李慶妮陳云豐劉元浪唐定華婉璐張瑞安盧李新國
        中國比較醫(yī)學雜志 2022年6期
        關(guān)鍵詞:評價

        李慶妮陳云豐劉元浪唐 定華婉璐張瑞安盧 佳*李新國*

        (1.武漢生物制品研究所有限責任公司新發(fā)傳染病研究室,武漢 430207;2.武漢生物制品研究所有限責任公司生物安全三級實驗室,武漢 430207)

        對于呼吸道病原微生物而言,氣溶膠吸入是其感染宿主的重要途徑[1-2]。 鑒于非人靈長類動物(non-human primates,NHP)與人類密切的基因相關(guān)性,因此在候選疫苗、治療性藥物的臨床前研究中,NHP 具有獨特而重要的作用[3-9]。 非人靈長類動物口鼻式氣溶膠暴露系統(tǒng)可以通過裝有細菌、病毒等病原微生物懸浮液的霧化器霧化產(chǎn)生微生物氣溶膠,NHP 吸入氣溶膠后,在感染過程中避免了消化道、皮膚等其他暴露途徑感染,可以模擬呼吸道病原自然感染途徑,為致病性病原微生物吸入感染、疫苗氣溶膠免疫、肺給藥、氣溶膠攻毒評價疫苗或藥物效果的研究提供了良好的評價技術(shù)平臺[10]。本研究選擇流感病毒作為模式病毒,在生物安全三級實驗室中使用非人靈長類動物口鼻式氣溶膠暴露系統(tǒng)裝置產(chǎn)生病毒氣溶膠,評價了病毒氣溶膠粒徑、氣溶膠輸出均一性、穩(wěn)定性、氣密性等重要參數(shù),以及裝置的消毒效果驗證,為將來建立SARSCoV-2 及其它病毒氣溶膠感染NHP 模型奠定基礎。

        1 材料和方法

        1.1 實驗材料

        1.1.1 細胞

        MDCK 細胞由武漢生物制品研究所有限責任公司國家聯(lián)合疫苗工程技術(shù)研究中心提供。

        1.1.2 病毒株

        流感病毒B/Phuket/3073/2013(B/Yamagata lineage)由武漢生物制品研究所有限責任公司國家聯(lián)合疫苗工程技術(shù)研究中心提供。

        流感病毒B/Phuket/3073/2013 (B/Yamagata lineage)是WHO 推薦并經(jīng)國家藥品監(jiān)督管理部門批準的乙型流行性感冒病毒的疫苗株,屬于《人間傳染的病原微生物名錄》中的第三類病原微生物,不屬于高致病性病原。 由于其致病性較弱,屬囊膜病毒,對消毒劑較敏感,易于在三級生物安全實驗室操作,其細胞培養(yǎng)物病毒滴度較高可達108CCID50/mL,可滿足實驗需要,因此被本研究選作SARS-CoV-2 的代替病毒。

        1.2 主要試劑與儀器

        DMEM 培養(yǎng)基(美國Gibco 公司);新生牛血清(杭州四季青公司);青鏈霉素(美國HyClone 公司);TPCK-胰酶(美國Sigma 公司);1%雞紅血球(自制)。

        非人靈長類動物口鼻式氣溶膠暴露系統(tǒng)(北京慧榮和科技有限公司);TSI 3321 氣溶膠粒徑分析儀(美國TSI 公司);B2 生物安全柜(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司);二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo 公司);汽化過氧化氫滅菌器(杭州美卓生物科技有限公司)。

        1.3 實驗方法

        1.3.1 非人靈長類動物口鼻式氣溶膠暴露系統(tǒng)

        非人靈長類動物口鼻式氣溶膠暴露系統(tǒng)如圖1所示,主要由氣溶膠發(fā)生模塊(過濾器、流量控制器、Collison 氣溶膠發(fā)生器、正交稀釋器)、染毒模塊(口鼻罩、頭罩、猴椅)、分析模塊(AGI-30 采樣器)、控制模塊(調(diào)節(jié)閥、流量控制器)、廢氣處理模塊(過濾器)組成。 整體采用分布式動態(tài)氣溶膠口鼻暴露技術(shù)。 實驗室的潔凈壓縮空氣進入系統(tǒng)后分成兩路,一路經(jīng)過流量控制器后進入氣溶膠發(fā)生器用于氣溶膠發(fā)生,然后進入正交稀釋器,另一路經(jīng)過流量控制器后作為稀釋氣流直接進入正交稀釋器。兩路氣流經(jīng)過渦旋混合后形成特定濃度的氣溶膠進入氣溶膠靜壓腔,并經(jīng)過頂部的6 路分流管路分別輸送到6 個實驗猴口鼻罩的進氣口處,實驗猴吸入后產(chǎn)生的廢氣經(jīng)口鼻罩出氣口處排出,匯流過濾后經(jīng)過流量控制器由抽氣泵排出。

        圖1 非人靈長類動物口鼻式氣溶膠暴露系統(tǒng)示意圖Figure 1 Schematic figure of the oral and nasal aerosol exposure system in non-human primates

        1.3.2 流感病毒滴度測定

        使用微量細胞病變法進行病毒滴度的測定,胰酶消化MDCK 細胞制備細胞懸液,接種至96 孔細胞培養(yǎng)板中,每毫升2.0×104~3.0×104個,每孔100 μL。 將流感病毒樣本10 倍系列梯度稀釋后接種至96 孔板中,每個稀釋度8 個復孔,33℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d。 觀察出現(xiàn)細胞病變的孔數(shù),使用Kaber 法計算病毒滴度。

        1.3.3 氣溶膠發(fā)生參數(shù)和采樣參數(shù)設定

        將20 mL 一定濃度的流感病毒加入六孔Collison 氣溶膠發(fā)生器中,設置氣溶膠發(fā)生流量為12 L/min,稀釋流量為40 L/min,抽氣流量為55 L/min,維持頭罩負壓,氣溶膠穩(wěn)定發(fā)生5 min 后使用AGI-30 液體沖擊式采樣器連接頭罩采樣口采樣,采樣溶液為30 mL 的DMEM 培養(yǎng)基,采樣流量為10 L/min,采樣時間5 min。

        1.3.4 氣溶膠粒徑大小、均一性和穩(wěn)定性評價

        將30 mL 氣溶膠發(fā)生液加入六孔Collison 氣溶膠發(fā)生器中,按照1.3.3 設定氣溶膠發(fā)生參數(shù),分別在靜壓腔和頭罩采樣處接入TSI 3321 氣溶膠粒徑分析儀檢測氣溶膠總粒子的中值直徑,檢測時間點分別為氣溶膠發(fā)生后5、10、20、30 和40 min,評價氣溶膠粒徑大小、均一性和穩(wěn)定性。

        1.3.5 流感病毒氣溶膠達到頭罩評價

        將20 mL 3.5×106CCID50/mL 流感病毒液加入到六孔Collison 氣溶膠發(fā)生器中產(chǎn)生氣溶膠,將AGI-30 液體沖擊式采樣器連接至頭罩采樣口處進行采樣,測定樣品中流感病毒滴度,評價氣溶膠是否能到達供氣靜壓腔和頭罩。

        1.3.6 流感病毒氣溶膠頭罩分布均一性評價

        非人靈長類動物口鼻式氣溶膠暴露系統(tǒng)染毒模塊共包含6 個頭罩,分別向六孔Collison 氣溶膠發(fā)生器中分別加入20 mL 低濃度(3.5×106CCID50/mL)和高濃度(7.1×107CCID50/mL)流感病毒液產(chǎn)生氣溶膠,并將AGI-30 液體沖擊式采樣器連接頭罩采樣口進行采樣,測定樣品中流感病毒滴度,評價不同病毒濃度的氣溶膠發(fā)生液產(chǎn)生的氣溶膠能否均勻分布達到至6 個頭罩。

        1.3.7 流感病毒的耐霧化能力評價

        向六孔Collison 氣溶膠發(fā)生器中加入20 mL 7.1×107CCID50/mL 的流感病毒液產(chǎn)生氣溶膠,分別在氣溶膠發(fā)生0、3、5、8、10、15、20、25、30、35 和40 min 時采集發(fā)生器中流感病毒樣品,測定樣品中流感病毒滴度,測定氣溶膠發(fā)生狀態(tài)下流感病毒存活率。

        1.3.8 氣溶膠發(fā)生器和采樣器中流感病毒濃度的線性關(guān)系

        將1.3×107CCID50/mL 的流感病毒液10 倍系列梯度稀釋,分別取1.3×107CCID50/mL、1.3×106CCID50/mL、1.3×105CCID50/mL、1.3×104CCID50/mL 各20 mL 加入到六孔Collison 氣溶膠發(fā)生器中產(chǎn)生氣溶膠,用AGI-30 液體沖擊式采樣器采集頭罩處的氣溶膠樣品,測定樣品中流感病毒滴度,評價Collison 發(fā)生器(Input) 和Impinger 采樣器(Output)中流感病毒濃度的線性關(guān)系。

        1.3.9 裝置氣密性評價

        在1.3.6 中使用高滴度流感病毒作為氣溶膠發(fā)生液產(chǎn)生氣溶膠時,在非人靈長類動物口鼻式氣溶膠暴露系統(tǒng)易發(fā)泄露的管道連接處(如氣溶膠發(fā)生器出口、靜壓腔入口、6 個口鼻罩出口、預實驗采樣器進口、預實驗采樣器出口、采樣器進氣口、采樣器出氣口)使用拭子涂抹采樣30 s,將采樣拭子放入2 mL DMEM 培養(yǎng)基中,充分混勻后,加入到生長致密的MDCK 細胞中,33℃二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h,觀察是否發(fā)生細胞病變,評價裝置在運行過程中是否發(fā)生氣溶膠泄露。

        1.3.10 裝置消毒效果評價

        采用35%過氧化氫及氣體發(fā)生器分批次對氣溶膠暴露系統(tǒng)管道及負壓柜腔體進行消毒,使用嗜熱脂肪芽孢桿菌菌片(ATCC 7953,菌種濃度為每片5×105~5×106cfu)作為生物指示劑。 消毒前,分別在管道和負壓柜腔體布置生物指示劑。 消毒完成后,及時取出指示劑,放入加有0.5%中和劑硫代硫酸鈉的溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中,56℃培養(yǎng)7 d 后進行結(jié)果判定。

        1.4 統(tǒng)計學方法

        本研究數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 9.0.0 統(tǒng)計分析軟件,對結(jié)果進行t檢驗和方差分析,P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義,P<0.01 為差異有顯著統(tǒng)計學意義,P<0.001 為差異有極顯著統(tǒng)計學意義。

        2 結(jié)果

        2.1 氣溶膠粒徑大小、均一性和穩(wěn)定性評價

        氣溶膠發(fā)生后,使用TSI 3321 氣溶膠粒徑分析儀在不同時間點分別檢測靜壓腔和頭罩處的氣溶膠總粒子的中值直徑,結(jié)果如表1 所示,非人靈長類動物口鼻式氣溶膠暴露系統(tǒng)產(chǎn)生的氣溶膠顆粒中值直徑為(1.04±0.03)μm,對應安德森采樣器的6 級(0.65~1.1)μm,氣溶膠發(fā)生后40 min 內(nèi),靜壓腔和頭罩處的氣溶膠的中值直徑的均一性和穩(wěn)定性良好。

        表1 氣溶膠粒子中值直徑、均一性和穩(wěn)定性Table 1 Median diameter, uniformity and stability of aerosol particles

        2.2 流感病毒氣溶膠達到頭罩評價

        使用AGI-30 沖擊式采樣器采集靜壓腔和頭罩處的氣溶膠,通過微量細胞病變法檢測靜壓腔和頭罩處病毒氣溶膠濃度,結(jié)果如圖2 所示,靜壓腔和頭罩中都能檢測到一定滴度的流感病毒,表明該裝置能正常運行并能產(chǎn)生病毒氣溶膠,產(chǎn)生的氣溶膠能經(jīng)靜壓腔途徑管道到達頭罩處,且傳遞過程中氣溶膠濃度無顯著差異(P>0.05)。

        圖2 采樣器采集靜壓腔和頭罩處的氣溶膠濃度Figure 2 Aerosol concentrations of samplers which collect in the static pressure chamber and the hood

        2.3 流感病毒氣溶膠頭罩分布均一性評價

        分別使用低濃度(3.5×106CCID50/mL)和高濃度(7.1×107CCID50/mL)流感病毒進行氣溶膠發(fā)生,使用AGI-30 沖擊式采樣器收集6 個頭罩氣溶膠并進行病毒滴度檢測,結(jié)果見圖3 所示。 實驗結(jié)果表明同一滴度流感病毒產(chǎn)生的氣溶膠在6 個頭罩的濃度無顯著差異(P>0.05),說明氣溶膠在6 個頭罩分布均勻,且氣溶膠濃度與發(fā)生器病毒滴度有關(guān)。

        圖3 不同頭罩處的流感病毒氣溶膠濃度Figure 3 Aerosol concentrations of samplers which collect in the six hoods

        2.4 流感病毒的耐霧化能力評價

        為評價氣溶膠發(fā)生過程中流感病毒的耐霧化能力,分別檢測氣溶膠發(fā)生3、5、8、10、15,20、25、30、35 和40 min 時氣溶膠發(fā)生器中流感病毒存活率,見圖4。 實驗結(jié)果表明氣溶膠發(fā)生0~5 min,流感病毒存活率迅速下降,5~30 min 流感病毒存活率較為穩(wěn)定,存活率高于50%,30 min 后流感病毒活性繼續(xù)迅速下降。 根據(jù)上述結(jié)果,氣溶膠發(fā)生后5~30 min 可作為NHP 感染的窗口期,約為25 min。

        圖4 流感病毒的耐霧化能力Figure 4 Atomization resistance of influenza virus

        2.5 發(fā)生器和采樣器中流感病毒氣溶膠濃度的線性關(guān)系

        根據(jù)“2.3 流感病毒氣溶膠頭罩分布均一性評價”實驗結(jié)果,流感病毒氣溶膠濃度和氣溶膠發(fā)生器中流感病毒滴度有關(guān)。 為進一步確定二者之間的關(guān)系,在氣溶膠發(fā)生器中加入不同滴度的流感病毒溶液,檢測對應流感病毒氣溶膠濃度,結(jié)果如圖5所示,實驗結(jié)果表明流感病毒氣溶膠濃度與發(fā)生器病毒滴度的對數(shù)值具有良好的線性關(guān)系,標準曲線方程為y=0.8625x-2.4173(R2=0.9989)。

        圖5 流感病毒Input(Collison)和Output(Impinger)的線性關(guān)系Figure 5 Correlation between input (Collison) and output (Impinger) virus titres of influenza virus when aerosolized using the oral and nasal aerosol exposure system for non-human primates

        2.6 裝置氣密性評價

        使用拭子在非人靈長類動物口鼻式氣溶膠暴露系統(tǒng)中病毒氣溶膠易發(fā)生泄露部位(氣溶膠發(fā)生器出口、靜壓腔入口、6 個頭罩出口、預實驗采樣器進口、預實驗采樣器出口、采樣器進氣口和采樣器出氣口)涂抹采樣,將采集樣本接種到MDCK 細胞中,培養(yǎng)后12 個采樣點樣本接種的細胞均未發(fā)生病變。 提示非人靈長類動物口鼻式氣溶膠暴露系統(tǒng)在氣溶膠發(fā)生過程中未發(fā)生氣溶膠泄露,裝置氣密性良好。

        2.7 裝置消毒效果評價

        嗜熱脂肪芽孢桿菌生物指示劑培養(yǎng)7 d 后,對指示劑逐支進行檢查,實驗組接種生物指示劑的培養(yǎng)基均未變色(呈現(xiàn)紫色),陽性對照培養(yǎng)基顏色變色(紫色變黃色),陰性對照培養(yǎng)基未變色(呈現(xiàn)紫色)。 實驗結(jié)果表明使用35%過氧化氫采用汽化方式對非人靈長類動物口鼻式氣溶膠暴露系統(tǒng)可以進行有效地消毒,消毒效果完全。

        3 討論

        非人靈長類動物口鼻式氣溶膠暴露系統(tǒng)能正常運行,產(chǎn)生具有感染性的氣溶膠顆粒,氣溶膠顆粒的中值直徑為(1.04±0.03)μm,顆粒大小可直接進入肺泡。

        在氣溶膠暴露感染實驗動物時,基于動物的氧氣消耗,推薦氣溶膠氣體流量為每分鐘呼吸體積的1.5 倍,使用動物呼吸量2.5~4 倍的氣溶膠氣體流量可將氣溶膠濃度保持在目標濃度的90%[11]。 2~4 歲恒河猴呼吸量為1.5~3.8 L/min[12]。 美國陸軍傳染病醫(yī)學研究所和匹茲堡大學疫苗研究中心進行不同種類的NHP 氣溶膠暴露感染時,提供給每只NHP 的氣體流量為7.5 L/min 左右[13-14]。 本系統(tǒng)裝置可同時進行6 只NHP 的氣溶膠暴露感染,在本研究中使用6 孔Collison 氣溶膠發(fā)生器,將氣溶膠流量設為12 L/min,稀釋流量設為40 L/min,提供給每只試驗猴的氣溶膠氣體流量為8.7 L/min 左右,為恒河猴呼吸量的2.3~5.8 倍,同時本生物安全三級實驗室前期進行恒河猴適應性模擬氣溶膠感染時,采用此染毒程序參數(shù)進行氣溶膠感染,恒河猴在整個20 min 感染過程中呼吸均勻狀態(tài)良好。

        Collison 氣溶膠發(fā)生器使用壓縮空氣使液體霧化產(chǎn)生氣溶膠顆粒,霧化過程由于剪切力、撞擊力、濃縮作用等的影響,會導致部分微生物衰亡或失去活性[15];同時AGI-30 液體撞擊式采樣器在采樣過程中存在微生物粒子撞擊時的損傷、逃逸及再次氣溶膠化等問題[16],因此本研究中采集到的氣溶膠中流感病毒滴度比氣溶膠發(fā)生液中滴度低2.4 log10CCID50。 采用Collison 發(fā)生器(Input)發(fā)生SARSCoV-2 氣溶膠或東方馬腦炎病毒,采用AGI-30 液體撞擊式采樣器(Output)采集病毒氣溶膠,Input 和Output 病毒滴度之間具有良好的線性關(guān)系,分別損失2 log10pfu[17]和3.4 log10pfu[18],這與本研究的實驗結(jié)果相一致。

        本研究中,在氣溶膠發(fā)生30 min 內(nèi),Collison 氣溶膠發(fā)生器中流感病毒的存活率高于50%,這與噬菌體D29 的存活率基本相符[19],Mainelis 等[20]也報道了熒光假單胞菌經(jīng)Collison 氣溶膠發(fā)生器霧化90 min 后,活力損傷了50%,然而Hermann 等[21]指出病毒在機械上比細菌更容易霧化,Ibrahim 等[22]研究顯示用Collison 氣溶膠發(fā)生器連續(xù)霧化60 min 的過程中,H1N1 流感病毒活力出現(xiàn)輕微的損失,Kim等[23]報道有囊膜的冠狀病毒在霧化30 min 后,病毒存活率僅下降了15%。 高致病性禽流感、SARSCoV-2、尼帕病毒、埃博拉病毒等重大呼吸道病毒性傳染病有可能通過氣溶膠傳播,SARS-CoV-2 氣溶膠吸入暴露劑量在3.7~4.2 log10pfu 可以感染非洲綠猴[17],2.6~4.7 log10pfu 的埃博拉病毒可以通過氣溶膠感染恒河猴[24],2.0~3.0 log10pfu 的尼帕病毒可以通過氣溶膠感染非洲綠猴[25],這些呼吸道病毒對NHP 的氣溶膠暴露劑量在2.0~4.7 log10pfu 即可成功建立感染模型,因此盡管本研究中使用的我國自主研發(fā)的氣溶膠暴露系統(tǒng)在氣溶膠發(fā)生過程中流感病毒存活率方面與先進國際水平相比仍然存在較大差距,但若使用高濃度(107CCID50/mL 以上)病毒發(fā)生液產(chǎn)生氣溶膠時,在5~30 min 的感染窗口期內(nèi),實驗猴吸入氣溶膠10~20 min,可以達到104CCID50左右的感染劑量,理論上可以成功建立病毒氣溶膠NHP 感染模型。

        使用高濃度流感病毒液產(chǎn)生氣溶膠進行裝置氣密性測試評價時,未檢測到具有感染性的流感病毒,表明該暴露裝置沒有發(fā)生氣溶膠泄露,對生物安全三級實驗室保護良好。 嗜熱脂肪芽孢桿菌對各種消毒方式具有較強的抵抗力,可以作為消毒效果驗證的直接指標[26]。 以嗜熱脂肪芽孢桿菌作為消毒指示菌的效果驗證,表明使用35%過氧化氫采用汽化方式可對該系統(tǒng)進行有效地消毒,消毒效果完全。

        綜上所述,本研究在生物安全三級實驗室中以流感病毒評價了非人靈長類動物口鼻式氣溶膠暴露系統(tǒng)運行中病毒氣溶膠的重要參數(shù),包括氣溶膠粒徑、氣溶膠輸出氣密性、均一性、穩(wěn)定性等。 這些廣泛的基礎性數(shù)據(jù)使我們能夠?qū)Ψ侨遂`長類動物口鼻式氣溶膠暴露系統(tǒng)的基本情況有客觀深入的認識,并為有效地利用這一系統(tǒng)建立SARA-CoV-2和其它病毒氣溶膠感染NHP 模型提供了可能。

        猜你喜歡
        評價
        SBR改性瀝青的穩(wěn)定性評價
        石油瀝青(2021年4期)2021-10-14 08:50:44
        中藥治療室性早搏系統(tǒng)評價再評價
        自制C肽質(zhì)控品及其性能評價
        寫作交流與評價:詞的欣賞
        中學語文(2015年21期)2015-03-01 03:52:11
        基于Moodle的學習評價
        關(guān)于項目后評價中“專項”后評價的探討
        HBV-DNA提取液I的配制和應用評價
        有效評價讓每朵花兒都綻放
        模糊數(shù)學評價法在水質(zhì)評價中的應用
        治淮(2013年1期)2013-03-11 20:05:18
        保加利亞轉(zhuǎn)軌20年評價
        精品人妻系列无码人妻漫画 | 亚洲日韩欧美一区二区三区| 久久麻豆精亚洲av品国产精品| 亚洲av成人一区二区三区| 91三级在线观看免费| 精品亚洲人伦一区二区三区| 窝窝影院午夜看片| 国产又猛又黄又爽| 人妻少妇中文字幕,久久精品| 国产自产拍精品视频免费看| 精品丝袜人妻久久久久久| 亚洲av综合永久无码精品天堂| 国产一区二区三区色哟哟| 亚洲视频综合在线第一页 | 久久天天躁夜夜躁狠狠| 国产高清精品一区二区| 一亚洲一区二区中文字幕| 无码毛片高潮一级一免费| 97久久精品午夜一区二区| 国产精品久久久久高潮| av色一区二区三区精品| 精品一区二区三区老熟女少妇| 亚洲电影一区二区| 99久久精品自在自看国产| 麻豆成人精品国产免费| 人妻精品久久久久中文字幕69| 狼人伊人影院在线观看国产| 久久综合加勒比东京热| 国产AV无码无遮挡毛片| 永久无码在线观看| 人妻被黑人粗大的猛烈进出| 欧美亚洲色综久久精品国产| 国产情侣真实露脸在线| 日本区一区二区三视频| 隔壁的日本人妻bd高清中字| 久久精品这里就是精品| 99久久久精品免费| 无码国产精品一区二区免费97| 76少妇精品导航| 精品人妻va出轨中文字幕| 国产日产精品一区二区三区四区的特点 |