唐 定張瑞安盧 佳李新國

(武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司生物安全三級實驗室,武漢 430207)

一種被命名為SARS-CoV-2 的新型冠狀病毒爆發(fā),導(dǎo)致呼吸系統(tǒng)疾病,病死率約為2.2%[1]。 我國將SARS-CoV-2 按照第二類病原微生物進行管理,涉及病毒培養(yǎng)和動物感染實驗則必須在生物安全三級或以上級別實驗室進行[2-3]。 盡管人類患者的數(shù)量非常的龐大,但SARS-CoV-2 某些方面的發(fā)病機制和疫苗的前期評估只能在動物感染模型中才能夠?qū)崿F(xiàn)反復(fù)采樣和病理解剖。 因為非人靈長類動物(non-human primates,NHP)在親緣關(guān)系上與人類非常接近,并且生理結(jié)構(gòu)和解剖病理結(jié)構(gòu)等都與人類十分類似,所以疫苗或藥物一般會選擇NHP 進行臨床前研究[4-5]。 在非人靈長類動物新冠病毒感染模型研究中發(fā)現(xiàn),SARS-CoV-2 能夠?qū)е潞愫雍锏暮粑到y(tǒng)疾病,但NHP 感染新冠病毒后大多表現(xiàn)為輕度到中度的臨床癥狀,并且在感染后1 周左右開始恢復(fù)[6]。 因此,單一的評價指標(biāo)難以準(zhǔn)確判斷實驗猴的感染階段和感染模型的建立是否成功,正確選擇能觀察或檢測表現(xiàn)疾病關(guān)鍵特征性的指標(biāo)不僅能夠節(jié)省人力、物力和時間,也更能保證實驗結(jié)果的有效性。 新冠病毒非人靈長類動物感染模型關(guān)鍵特征性評價指標(biāo)包括臨床表現(xiàn)指標(biāo)、影像學(xué)診斷、血液學(xué)指標(biāo)、病原學(xué)指標(biāo)、病理學(xué)指標(biāo)、免疫學(xué)指標(biāo)等,結(jié)合這些指標(biāo)綜合判斷動物感染模型的建立是否成功對后續(xù)實驗結(jié)果的分析至關(guān)重要[7-8]。

1 臨床表現(xiàn)指標(biāo)

臨床評分是對實驗動物的一些主要癥狀、體征和生理參數(shù)等進行加權(quán)或賦值,從而量化評價疾病的嚴(yán)重程度,預(yù)測后續(xù)發(fā)展,也能控制研究時的組間可比性[9]。 實驗表明,非人靈長類動物在感染新冠病毒后會產(chǎn)生與人類患者相似的臨床癥狀,主要表現(xiàn)為呼吸模式的變化、弓背姿勢、體表蒼白、脫水、食欲下降、偶爾咳嗽和體溫變化等[6]。 對NHP感染新冠病毒后的臨床癥狀進行賦值,建立臨床評分標(biāo)準(zhǔn),再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)對實驗猴進行臨床評分,其結(jié)果可以有效評估實驗猴的感染階段,有助于判斷實驗進程和實驗終點(見表1)[6]。

2 影像學(xué)診斷

計算機斷層掃描(CT)和X 射線檢查是影像學(xué)檢查中非常重要的檢查方法。 在新冠病毒感染早期,實時熒光定量PCR(Real-time PCR)方法很容易出現(xiàn)假陰性[10],因此,識別該病的早期影像表現(xiàn)及臨床特征在新冠肺炎診斷方面具有重要意義。 臨床診斷結(jié)果也證明使用CT 或胸部X 射線檢查能對新冠病毒患者進行有效診斷,其中CT 通常會產(chǎn)生更準(zhǔn)確的結(jié)果。 人類患者的影像特征包括單發(fā)或散在磨玻璃密度陰影,病變部位主要分布在胸膜下緣或肺中央,伴隨征象包括胸腔積液、縱隔及肺門區(qū)淋巴結(jié)增大等[11]。 通過制定新冠病毒非人靈長類動物感染模型的肺部CT 評分方法,能夠半定量分析肺內(nèi)病變程度,評分標(biāo)準(zhǔn)為:無異常密度影,0分;存在少量異常密度影,累及面積＜5%,1 分;累及面積＜25%,2 分;累及面積＜50%,3 分;累及面積＜75%,4 分;累及面積＞75%,5 分[12]。 根據(jù)CT 評分結(jié)果能夠客觀的評價實驗猴的感染階段,及時調(diào)整實驗方案,取得更加理想的實驗結(jié)果。

3 血液學(xué)指標(biāo)

3.1 血常規(guī)檢驗

血常規(guī)是臨床檢測中應(yīng)用最普遍的檢測項目,其中外周白細(xì)胞計數(shù)、中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞比率(NLR)、衍生 NLR 比率(d-NLR,中性粒細(xì)胞計數(shù)除以白細(xì)胞計數(shù)減去中性粒細(xì)胞計數(shù)的結(jié)果)、血小板與淋巴細(xì)胞比率(PLR)和淋巴細(xì)胞與單核細(xì)胞比率(LMR)是炎癥反應(yīng)的指標(biāo)[13]。 對動物感染模型臨床檢查中收集的血液進行血常規(guī)分析顯示,大多數(shù)實驗猴的單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞計數(shù)都在感染后短暫上升,然后恢復(fù)到基線水平;淋巴細(xì)胞則短暫下降再恢復(fù);所有動物都觀察到紅血細(xì)胞壓積、紅細(xì)胞計數(shù)和血紅蛋白下降,網(wǎng)織紅細(xì)胞的百分比和計數(shù)也有所下降[6]。 淋巴細(xì)胞數(shù)量的下降與COVID-19 感染的嚴(yán)重程度成正比,并且該疾病的存活率與淋巴細(xì)胞尤其是T 淋巴細(xì)胞的更新能力有關(guān),這對摧毀受感染的細(xì)胞至關(guān)重要[14]。 近年來,有研究表明平均血小板體積(MPV)可能是預(yù)測肺炎患者病情發(fā)展及預(yù)后的一個指標(biāo)[15]。 研究發(fā)現(xiàn)NLR 也可用作評估COVID-19 患者的預(yù)后情況和臨床癥狀的嚴(yán)重程度,NLR 與COVID-19 的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[12]。

3.2 血液生化檢測

通過對臨床病例分析發(fā)現(xiàn),部分新冠患者的肝功能指標(biāo)出現(xiàn)異常,主要表現(xiàn)為谷草轉(zhuǎn)氨酶升高,谷丙轉(zhuǎn)氨酶升高,谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶比例異常,乳酸脫氫酶升高;但這不是普遍現(xiàn)象,與感染的毒株和患者年齡有較大關(guān)系[16]。 血尿素氮和血清肌酐都是腎損傷的常規(guī)指標(biāo),現(xiàn)有數(shù)據(jù)表明,新冠患者中急性腎損傷(AKI)的患病率相對較低,各項研究結(jié)果顯示在0.5%～19.1%之間[17]。 但是,在新冠病毒非人靈長類動物感染模型中,生化指標(biāo)的變化較小,腎功能和肝功能的標(biāo)志物基本保持不變[18]。

4 病原學(xué)指標(biāo)

Real-time PCR 是世界衛(wèi)生組織(WHO)、中國國家衛(wèi)生健康委員會等單位推薦的新冠肺炎確診的標(biāo)準(zhǔn)之一,能夠高效處理較大數(shù)量樣本[19]。 在恒河猴的新冠感染模型中,鼻拭子、咽拭子和支氣管肺泡灌洗液中的病毒載量都很高,并且能夠從感染早期的鼻拭子、咽拭子和肺泡灌洗液中分離出新冠病毒,也能從肺組織勻漿上清中分離出新冠病毒[6];在呼吸系統(tǒng)及其附近的淋巴結(jié)中不僅檢測到了高病毒載量,還檢測到了新冠病毒的mRNA,這表明新冠病毒在呼吸系統(tǒng)中有較高的復(fù)制活性[20-21]。通過新冠病毒的核酸檢測,可以有效指示新冠病毒能夠侵入的組織器官以及在其中的病毒載量,這對疫苗的免疫保護力評價、病毒感染模型的構(gòu)建和其它相關(guān)生物或化學(xué)制劑的作用研究都至關(guān)重要。

5 病理學(xué)指標(biāo)

常用的病理學(xué)技術(shù)有蘇木精-伊紅(HE)染色和免疫組化技術(shù),HE 染色可以觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)、組織層次,對組織器官的病理學(xué)診斷非常重要;免疫組化染色技術(shù)能對新冠病毒抗原進行定位、定性及相對定量的研究[22-23]。 迄今為止描述的COVID-19 肺組織病理學(xué)表現(xiàn)在很大程度上是非特異性的,包括水腫、蛋白質(zhì)滲出物、伴有透明膜形成的彌漫性肺泡損傷 (DAD)、反應(yīng)性肺細(xì)胞增生、以淋巴細(xì)胞為主的間質(zhì)單核炎性浸潤和多核巨細(xì)胞,通常沒有出現(xiàn)病毒致細(xì)胞病變的變化或特性核內(nèi)或胞漿內(nèi)病毒包涵體[24-30]。 然而, 血管血栓形成似乎在COVID-19 患者的肺中更為常見[31]。 研究發(fā)現(xiàn),非人靈長類動物新冠病毒感染模型中的病理學(xué)變化主要表現(xiàn)為以淋巴細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞浸潤,形成間質(zhì)性肺炎;同時在多個組織器官中檢測到新冠病毒抗原,包括整個呼吸道、扁桃體、縱膈淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)、頸部淋巴結(jié)、胃腸道,在部分實驗動物的心臟中也檢測到了新冠病毒抗原[6,20]。

6 免疫學(xué)指標(biāo)

6.1 細(xì)胞免疫

細(xì)胞因子風(fēng)暴被認(rèn)為是急性呼吸窘迫綜合征和多器官衰竭的主要原因之一,它在疾病加重過程中起著重要的作用。 臨床研究已經(jīng)證實COVID-19的危重癥患者體內(nèi)存在細(xì)胞因子風(fēng)暴[32]。 研究發(fā)現(xiàn),與非重癥患者相比,重癥監(jiān)護病房患者血漿中IL-2、IL-7、IL-10、GCSF、IP-10、MCP-1、MIP-1a 和TNF-α 的水平更高,提示重癥患者體內(nèi)可能存在細(xì)胞因子風(fēng)暴[33-34]。 盡管呼吸道中的病毒滴度相似,但感染SARS-CoV-2 的老年非人靈長類動物比受感染的年輕非人靈長類動物更容易出現(xiàn)免疫失調(diào),導(dǎo)致更嚴(yán)重的臨床癥狀,可能是過度的炎癥反應(yīng)而不是高病毒滴度導(dǎo)致老年非人靈長類動物的死亡[35-38]。 以上研究結(jié)果表明,細(xì)胞因子風(fēng)暴與疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān),因此在新冠病毒非人靈長類動物感染模型建立過程中監(jiān)測實驗猴的細(xì)胞因子水平有助于判斷感染情況和疾病發(fā)展階段。

6.2 體液免疫

大多數(shù)COVID-19 患者在出現(xiàn)癥狀后1～2 周內(nèi)可檢測到抗體反應(yīng)[39]。 具體而言,在出現(xiàn)臨床癥狀的第2 天能夠檢測到IgA 抗體,在臨床癥狀出現(xiàn)后的第5 天能夠檢測到IgM 和IgG 抗體[40-43]。 最近的研究表明,中和抗體水平與COVID-19 患者的嚴(yán)重程度密切相關(guān),并且抗體反應(yīng)在感染后數(shù)周內(nèi)消退[44]。 此外,與有癥狀的個體相比,無癥狀個體的中和抗體水平下降得更快,并且水平較低[45]。 在新冠病毒恒河猴感染模型中,血清中IgG 抗體水平在感染后第7 天快速上升,在感染后第14 天達到峰值;中和抗體水平在感染后第10 天開始迅速上升,在感染后第15 天左右達到峰值[6]。 監(jiān)測實驗動物血清中抗體水平的變化有助于判斷其感染階段和評估疫苗的免疫保護力。

6.3 固有免疫

固有免疫,即非特異性免疫,包括皮膚、粘膜、血腦屏障、固有免疫細(xì)胞等。 作為基礎(chǔ)保護屏障,雖然不存在病原特異性,但穩(wěn)定性強,同時涉及到的免疫細(xì)胞種類繁多,因此同樣具有重要的檢測意義。 采集黏膜拭子是對固有免疫系統(tǒng)指標(biāo)監(jiān)測的最常見途徑,同時對相關(guān)免疫細(xì)胞,如單核-巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等的變化趨勢檢測也尤為重要。 研究發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2 能夠侵入大腦并感染腦血管內(nèi)皮細(xì)胞,導(dǎo)致動物模型中的腦損傷,但是病毒如何進入大腦的機制尚未可知[46]。

7 總結(jié)

非人靈長類動物對大多數(shù)人類致病性病毒都具有易感性,可以很好地模擬人類感染病毒后的臨床癥狀和病理變化等,非人靈長類動物感染模型對研究疾病的發(fā)病機制,疫苗、藥物的評價都發(fā)揮著非常重要的作用。 但是非人靈長類動物繁殖周期長,資源比較稀缺,并且成本高昂,所以選擇合適的評價指標(biāo)以正確評估動物模型是否成功建立,從而獲得準(zhǔn)確、有效的實驗結(jié)果才能減少不必要的重復(fù)實驗。 臨床表現(xiàn)指標(biāo)、影像學(xué)診斷、血液學(xué)指標(biāo)、病原學(xué)指標(biāo)、病理學(xué)指標(biāo)、免疫學(xué)指標(biāo)對評價新冠病毒非人靈長類動物感染模型的建立具有重要作用。