計鈺亮，朱婷婷，楊君寅

肝性腦?。℉E）是由于各種急慢性肝病導(dǎo)致的肝功能障礙或門體分流異常所引發(fā)，常伴有不同程度的代謝紊亂和神經(jīng)精神異常癥狀，是各種肝病發(fā)展至終末期常見的并發(fā)癥，也是導(dǎo)致終末期肝病患者死亡的主要原因[1]。HE 患者可表現(xiàn)為不同程度的性格改變、行為異常等，隨著疾病進展甚至出現(xiàn)譫妄、嗜睡及昏迷等意識障礙，加劇患者的肝病進程，對患者的預(yù)后造成不利影響[2]。關(guān)于HE的發(fā)病機制至今尚未完全闡明，目前國內(nèi)外較為公認(rèn)的機制包括較為經(jīng)典的氨中毒學(xué)說、神經(jīng)遞質(zhì)的改變、大腦星形膠質(zhì)細(xì)胞早衰以及血腦屏障通透性的改變等[3-4]。近年隨著研究的深入，免疫因素、炎性應(yīng)激反應(yīng)等機制也被認(rèn)為與HE 的發(fā)生和發(fā)展關(guān)系密切[5]。輔助型T 淋巴細(xì)胞（Th17）和調(diào)節(jié)型T 細(xì)胞（Treg）是CD4+T 淋巴細(xì)胞的分化表型，其在機體免疫調(diào)節(jié)中起著重要作用，并參與機體炎癥的發(fā)生及發(fā)展。有研究表明，高氨血癥與炎癥反應(yīng)可相互作用，誘導(dǎo)HE的發(fā)生和發(fā)展，Th17/Treg失衡反映患者免疫功能失調(diào)，而且患者血氨水平升高可誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞活化，進一步釋放腦源性炎性因子，引發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)炎癥[6]。為進一步明確HE 患者Th17/Treg失衡與病情的關(guān)系，本研究將對HE 患者Th17/Treg 水平和肝功能指標(biāo)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）和血氨的關(guān)系進行分析，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2019年4月至2021年7月中國人民武裝警察部隊海警總隊醫(yī)院收治的肝病患者179例。HE診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《中國肝性腦病診治共識意見》[7]中的標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）代謝性腦??；（2）神經(jīng)系統(tǒng)其他病變；（3）精神障礙患者；（4）血管性癡呆及腦萎縮等。按照是否發(fā)生HE 分為HE 組（n=79）和無HE 組（n=100）。HE 組男45例，女34例；年齡49 ～71歲，平均（60.1±8.4）歲；病程8 ～17年，平均（12.61±3.35）年；病因：酒精性肝硬化36例，肝炎后肝硬化43例；HE分級[8]：輕度23例，中度27例，重度29例。無HE 組共100例，其中男69例，女31例；年齡48 ～72歲，平均（60.9±8.8）歲；病程8 ～19年，平均（13.02±3.64）年；病因：酒精性肝硬化47例，肝炎后肝硬化53例。兩組一般差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）。本研究患者家屬知情同意且簽署知情告知同意書，本研究通過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批。

1.2 方法

1.2.1 Th17/Treg 水平檢測 采集患者晨起空腹12 h 外周靜脈血10 ml，血液中加入Hank’s 緩沖液和淋巴細(xì)胞分離液，經(jīng)2 000 r/min離心處理20 min，將細(xì)胞分層后吸取最上層的淋巴細(xì)胞層得到外周血中單個核細(xì)胞；使用PBS 緩沖液洗滌細(xì)胞2 次，每管加入2 ml permeabilization buffer，室溫避光孵育15 min，離心處理后棄上清液；繼續(xù)加入100 l permeabilization buffer 室溫孵育15 min，室溫下避光反應(yīng)30 min，使用PBS 溶液洗滌2 次，1 000 r/min 離心處理5 min 棄上清液；加入2 ml 流式染色液將細(xì)胞沉淀重懸，于30 min 內(nèi)使用流式細(xì)胞檢測儀（賽默飛Attune NxT 流式細(xì)胞儀）分別測定Th17 和Treg 水平，并計算Th17/Treg。檢測過程中使用的細(xì)胞表面染色熒光標(biāo)記的單抗試劑盒由美國eBioscience 公司生產(chǎn)，嚴(yán)格按照試劑盒和檢測儀操作說明進行測定。

1.2.2 肝功能指標(biāo)和血氨 采集患者晨起空腹靜脈血5 ml，室溫靜置30 min 后經(jīng)3 500 r/min 離心處理10 min，使用全自動生化分析儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司，BS-350E）檢測ALT、AST 和血氨水平。

1.3 統(tǒng)計方法 采用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組比較采用t 檢驗；多組比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數(shù)資料采用2檢驗；相關(guān)性分析采用Pearson 相關(guān)分析法和Spearman 相關(guān)分析法，并采用受試者工作特征曲線（ROC）分析各指標(biāo)的價值。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組Th17、Treg 和肝功能指標(biāo)比較 HE 組Th17、Th17/Treg、AST、ALT及血氨水平均高于非HE 組，Treg 水平低于HE 組（均P ＜0.05），見表1。

表1 組Th17、Treg 和肝功能指標(biāo)比較

2.2 不同嚴(yán)重程度HE 患者Th17、Treg和肝功能指標(biāo)比較 HE 重度組Th17、Th17/Treg、AST、ALT 及血氨水平均高于輕度組和中度組，Treg 水平低于中度組和輕度組（均P＜0.05）；中度組Th17、Th17/Treg、AST、ALT 以及血氨水平均高于輕度組，Treg水平低于輕度組（均P＜0.05）。見表2。

表2 不同嚴(yán)重程度HE 患者Th17、Treg 和肝功能指標(biāo)比較

2.3 Th17、Treg 和Th17/Treg 水平與HE 嚴(yán)重程度及肝功能相關(guān)指標(biāo)的關(guān)系

Th17/Treg 與AST、ALT、血氨和病情嚴(yán)重程度均呈正相關(guān)（均P ＜0.05），見表3。

表3 Th17、Treg 和Th17/Treg 水平與HE 嚴(yán)重程度以及肝功能相關(guān)指標(biāo)的關(guān)系

2.4 Th17/Treg 和肝功能指標(biāo)評估發(fā)生HE 的價值 Th17/Treg、血氨、AST 和ALT 用于評估發(fā)生HE 均有較高效能，其中上述指標(biāo)聯(lián)合診斷效能最高，其約登指數(shù)為0.734，AUC為0.823，敏感度、特異度分別為90.58%、92.03%。見表4。

表4 Th17/Treg 和肝功能指標(biāo)評估發(fā)生HE 的價值

2.5 Th17/Treg 和肝功能指標(biāo)評估HE嚴(yán)重程度的價值 Th17/Treg、血氨、AST 和ALT 用于評估HE 嚴(yán)重程度具有較高效能，其中血氨用于評估HE 嚴(yán)重程度的效能最高，其約登指數(shù)為0.677，AUC 為0.810，敏感度、特異度分別為89.47%、78.56%。見表5。

表5 Th17/Treg 和肝功能指標(biāo)評估HE 輕度與中重度的價值

3 討論

HE 是各種肝病發(fā)展至終末期的常見并發(fā)癥，其多見于肝硬化失代償期和重型肝炎患者，臨床表現(xiàn)和預(yù)后情況與發(fā)病原因、肝細(xì)胞的損傷程度等密切相關(guān)，患者可出現(xiàn)不同程度的行為異常、精神異?；蛞庾R障礙等，且死亡率較高[9-10]。當(dāng)前HE 的發(fā)病機制尚處于大量研究論證階段，并無明確的標(biāo)準(zhǔn)。明確影響疾病進展的因素對于肝臟原發(fā)疾病和HE的及時診治具有重要意義。肝臟疾病的發(fā)生和發(fā)展以及轉(zhuǎn)歸與結(jié)局與免疫細(xì)胞及各類細(xì)胞因子的作用關(guān)系密切，其中Th17 和Treg細(xì)胞能夠相互作用、相互拮抗，達到平衡狀態(tài)，在維持免疫內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定中具有重要的作用，其參與了多種免疫性疾病甚至是腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[11]。本研究結(jié)果顯示HE 組Th17、Th17/Treg和肝功能指標(biāo)AST、ALT 和血氨水平均高于非HE 組，Treg 水平低于非HE 組；這說明HE 患者存在Th17/Treg 失衡，肝功能指標(biāo)升高。分析原因為Th17 主要參與肝臟炎癥反應(yīng)過程，而Treg 細(xì)胞主要參與機體免疫應(yīng)答，二者的分化主要取決于肝臟病變微環(huán)境中的免疫、炎性細(xì)胞因子水平，HE患者多為肝硬化失代償期或重癥肝炎后期，此時機體的Th17水平和白細(xì)胞介素-6 的水平明顯升高，參與肝臟的炎性病變，加劇肝臟損傷[12]。隨著肝臟炎性病變的加重，Th17 水平增加加劇肝臟炎性反應(yīng)，導(dǎo)致Treg 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答受到抑制，Treg 通過下調(diào)以維持Th17/Treg 的平衡，并調(diào)節(jié)機體免疫，進而避免過度的肝細(xì)胞損傷，故HE 患者Th17/Treg 高于非HE 組。而HE患者多伴有肝功能衰竭、肝細(xì)胞損傷和凋亡嚴(yán)重，側(cè)支循環(huán)的建立，導(dǎo)致氨在門體分流時不經(jīng)肝臟代謝直接進入體循環(huán)，造成血氨水平升高，其代謝產(chǎn)物進入腦組織導(dǎo)致大腦功能的紊亂，因此HE組患者肝功能指標(biāo)和血氨水平升高[13]。

本研究結(jié)果顯示隨著疾病進展HE重度組患者Th17/Treg 及肝功能指標(biāo)均較輕度組和中度組升高，Th17/Treg隨著病情進展而進一步增加，與HE 進程呈正相關(guān)，與肝功能指標(biāo)AST、ALT 和血氨也呈正相關(guān)；這說明Th17/Treg 失衡加劇HE 進展和肝功能損傷。分析原因為Th17 細(xì)胞是一種高度促炎的Th 細(xì)胞亞型，肝性腦病患者肝功能損傷嚴(yán)重時Th17 水平明顯上升，Treg 細(xì)胞出現(xiàn)免疫性下調(diào)，而在外周血中，Th17 其能夠激活骨髓中中性粒細(xì)胞，進而誘導(dǎo)未成熟的單核細(xì)胞遷移至血液中，中性粒細(xì)胞在Th17 的募集下增加可提高蛋白酶的活性，導(dǎo)致炎性細(xì)胞諸如巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞等釋放增多，使髓鞘和軸突持續(xù)受到損傷，且Th17 已被證實更容易通過血腦屏障，表現(xiàn)出神經(jīng)毒性作用[14]。而血腦屏障的破壞是中樞脫髓鞘病變形成的關(guān)鍵，肝功能衰竭患者的轉(zhuǎn)化增長因子也能夠使血腦屏障的通透性增加，使得大量炎性介質(zhì)通過血腦屏障進入腦實質(zhì)，引發(fā)神經(jīng)毒性反應(yīng)，出現(xiàn)一系列的神經(jīng)系統(tǒng)病理表現(xiàn)[15]。故隨著肝功能損傷的進一步發(fā)展，HE 患者Th17/Treg 失衡越加嚴(yán)重，而隨著Th17 和Treg 比例失衡的加劇，血腦屏障破壞嚴(yán)重，神經(jīng)毒性反應(yīng)加劇，又促進了HE 的進程。而HE 患者病情與肝功能衰竭的程度密切相關(guān)，隨著肝細(xì)胞的損傷，AST、ALT 等肝功能指標(biāo)也明顯升高，血氨在肝臟的代謝受到影響，水平明顯升高，故隨著肝功能的進一步損傷，Th17/Treg失衡并誘導(dǎo)炎性反應(yīng)通過影響血腦屏障參與腦實質(zhì)的病變中，與HE 的進展和肝功能損害有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示Th17/Treg 聯(lián)合AST、ALT 及血氨共同評估肝病患者是否出現(xiàn)HE 的價值較高，且對于鑒別HE嚴(yán)重程度也具有較高的效能。分析原因為在肝臟病變早期，Th17 細(xì)胞具有一定的清除病毒，延緩感染進程的作用，但隨著炎癥進展，Th17 大量表達和分化導(dǎo)致促炎因子分泌增加，嚴(yán)重影響Th17/Treg平衡，促炎因子大量釋放導(dǎo)致肝臟細(xì)胞損傷加劇，誘發(fā)肝功能衰竭和惡化，隨著患者CD4+、CD25+Treg 細(xì)胞數(shù)量的降低，細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞的擴增失去控制，引發(fā)CD8+細(xì)胞毒性T 細(xì)胞反應(yīng)，導(dǎo)致大量肝細(xì)胞的壞死，加劇肝衰竭的進程和HE 的風(fēng)險[16]。另一方面，Th17 細(xì)胞還可以通過分泌細(xì)胞因子包括白細(xì)胞介素-17A、白介素-6、白介素-21 等而對血腦屏障造成免疫攻擊，影響血腦屏障的完整性間接的作用于血腦屏障，加重神經(jīng)脫髓鞘病變和HE 進程[17]。另外，HE 患者由于肝功能損傷嚴(yán)重導(dǎo)致血氨在體內(nèi)產(chǎn)生蓄積，其代謝產(chǎn)物隨著體循環(huán)進入大腦，增加氧化應(yīng)激和滲透壓，導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞的水腫，使星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能受損，具體表現(xiàn)為異常增殖甚至是細(xì)胞凋亡，并釋放腦源性炎性因子引發(fā)神經(jīng)炎癥，加重腦細(xì)胞損傷和HE的神經(jīng)癥狀[18]。