孫慧聰，孫勝珍，祁世杰，洪訓宇，韓冠亞

肝移植是治療終末期肝病的有效方法，但目前由于肝源缺乏、并發(fā)癥多、多種排異反應及費用昂貴等因素的影響，難以大規(guī)模開展[1]，臨床期待一種新的可替代方案。間充質(zhì)干細胞（MSCs）具有多向分化潛能，能夠分化成軟骨、硬骨、脂肪及其他組織類型，具有來源豐富及免疫原性較低的特點。多項臨床和亞臨床試驗顯示，MSCs可治療急性心肌梗死[2]、腦卒中、急性腎損傷[3]、糖尿病[4]、骨折[5]、肺動脈高壓[6]及肝病[7]，另有臨床試驗證明MSCs對嚴重的移植物抗宿主病有一定作用[8]，但目前MSCs的作用機制仍不明確[9]。人臍帶源MSCs（hUC-MSCs）是一種從人類臍帶中提取的新型MSCs，目前研究不多，筆者前期研究表明hUC-MSCs 可在體內(nèi)分化為功能性肝細胞，進而改善CCl4誘導的大鼠肝纖維化模型的肝功能及病理學變化[10]。本研究以CCl4誘導的大鼠肝硬化模型為研究對象，來探討hUC-MSCs 移植對肝硬化大鼠的治療及抗氧化作用，為臨床治療肝硬化提供理論依據(jù)，報道如下。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 選取健康成年體質(zhì)量350 ～400 g的清潔級雄性Wistar大鼠36 只，由河北省實驗動物中心提供，于河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院飼養(yǎng)，適應性飼養(yǎng)2 周，溫度20 ～25℃，光照明10h/暗14h，自由攝食及飲水。根據(jù)《關(guān)于善待實驗動物的指導性意見》[11]對實驗動物進行處理。

1.2 實驗材料 美國BECKMAN COULTER 公司生產(chǎn)的CX9 全自動生化分析儀；德國Eppendoff 公司生產(chǎn)的低溫高速離心機；梅特勒-托利多公司生產(chǎn)的PL1001-L 電子天平；法國bertin 公司生產(chǎn)的precellys 24 組織均質(zhì)器；超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）和丙二醛（MDA）檢測試劑盒均由上海碧云天生物技術(shù)公司生產(chǎn)；分析純CCl4由上海試劑總廠生產(chǎn)；橄欖油為市售食用橄欖油。天津市和澤干細胞科技有限公司進行hUC-MSCs 的分離、培養(yǎng)及鑒定。

1.3 方法

1.3.1 分離、培養(yǎng)及鑒定hUC-MSCs hUC-MSCs 由天津市和澤干細胞科技有限公司友情提供。用手術(shù)剪將新分離臍帶剪成小塊，用直徑1.5 mm 的濾網(wǎng)過濾，并接種于T 75 細胞培養(yǎng)瓶，當細胞融合80%時，用0.125%胰酶消化，1∶3 傳代培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡觀察hUC-MSCs 形態(tài)，顯示第3 代hUC-MSCs 呈成纖維細胞形態(tài)，并漩渦樣生長，生長狀態(tài)良好。應用流式細胞技術(shù)對hUC-MSCs免疫表型進行分析，結(jié)果表明分離培養(yǎng)的細胞為hUC-MSCs（封二彩圖1）。

1.3.2 模型制作及分組 將大鼠采用隨機數(shù)字表法分為3 組：（1）正常對照組（n=12）：注射0.9%氯化鈉注射液2 ml/kg；（2）模型對照組（CCl4+saline 組，n=12）：CCl4造模成功后，尾靜脈注射同等劑量的0.9%氯化鈉注射液，并于移植后第8 周處死大鼠。（3）hUC-MSCs 移植組（CCl4+hUC-MSCs 組，n=12）：造模成功后，大鼠尾靜脈注射hUC-MSCs 5×106個/只，并于移植后第8 周處死大鼠。按2 ml/kg 劑量，每周2次大鼠四肢輪流皮下注射40% CCl4橄欖油溶液進行造模，造模周期42 d。造模結(jié)束后，大鼠禁食不禁水，各組隨機抽取2 只，處死大鼠留取肝標本，制成石蠟切片，HE 及MASSON 染色觀察肝臟組織形態(tài)學變化，并評價模型狀態(tài)。造模成功后，各組繼續(xù)皮下注射CCl4，每周2 次直至處死。每日觀察大鼠的進食水、毛發(fā)及精神狀態(tài)等。

1.3.3 肝功能測定 留取標本前大鼠放于代謝籠，禁食不禁水，消毒大鼠前胸部皮膚，心尖搏動最強處進針，取大鼠左心室動脈血5ml，靜置凝固后離心取上層血清。采用美國BECKMANCOULTERCX9 全自動生化分析儀檢測血清中血清谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、總膽紅素（TBIL）、直接膽紅素（DBIL）和清蛋白（ALB）等肝功能指標。

1.3.4 肝臟大體標本觀察 消毒后切開腹部皮膚進入腹腔，分離整個肝臟，予0.9%氯化鈉注射液沖洗，觀察大鼠肝臟標本色澤、質(zhì)地、體積大小及表面是否光滑等，迅速于液氮中冷凍并保存在-80℃冰箱中待用。

1.3.5 病理指標評價 分離肝臟后取實驗大鼠同一部位肝組織，制成肝組織蠟塊，切片后予HE 染色及MASSON染色，并于光鏡下觀察肝臟病理組織學變化。肝臟炎癥評分和纖維化分級參照我國病毒性肝炎組織病理學分級分期標準進行，利用計算機圖像分析進行膠原纖維定量分析[12]。

1.3.6 抗氧化指標測定 取同一部位肝組織，按1∶9加入冰0.9%氯化鈉注射液進行勻漿，3 000 r/min離心10 min，留取上清液，按上海碧云天生物技術(shù)公司試劑盒說明書分別測定SOD、GSH、GPx 和MDA等指標水平。

1.4 統(tǒng)計方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0 軟件分析，服從正態(tài)分布的定量資料采用均數(shù)±標準差描述，多組間比較則采用單因素方差分析及SNK-q 檢驗。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 hUC-MSCs移植改善大鼠生活狀態(tài) 正常對照組大鼠皮毛色澤光澤，進食水正常，活動正常。模型對照組大鼠注射CCl4后，隨造模時間的延長，大鼠皮毛色澤逐漸晦暗，精神逐漸萎靡，進食水及活動量明顯減少。hUC-MSCs 移植后，隨著移植時間的延長，大鼠進食水以及活動量較模型對照組明顯增加，但較正常對照組大鼠明顯減少。

2.2 hUC-MSCs移植改善大鼠肝臟形態(tài)學表現(xiàn) 正常對照組大鼠肝臟顏色暗紅，表面細膩光滑。模型對照組大鼠注射CCl4后，肝臟逐漸腫脹，體積開始逐漸增大，后逐漸變小，至CCl4注射第7 周，肝臟體積明顯變小，表面明顯粗糙不平，顯示肝硬化造模成功。hUCMSCs 移植后，與模型對照組大鼠相比，hUC-MSCs 移植可使大鼠肝臟表面相對光滑，色澤相對紅潤（封三彩圖1）。

2.3 hUC-MSCs移植改善肝硬化大鼠肝臟炎性浸潤及纖維沉積 大鼠肝硬化造模結(jié)束時HE 染色顯示肝臟切片組織肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝板排列紊亂，肝細胞水腫、匯管區(qū)炎性細胞浸潤，結(jié)合MASSON 染色顯示匯管區(qū)及中央靜脈周圍可見大量纖維組織增生，假小葉形成，提示肝硬化模型造模成功。模型對照組與正常對照組大鼠相比，肝小葉結(jié)構(gòu)更加紊亂，肝板排列更加紊亂，肝細胞水腫明顯增加、炎性細胞浸潤及纖維條索明顯增多，而hUC-MSCs 移植組則顯示肝細胞壞死、匯管區(qū)炎性細胞浸潤及纖維沉積有所減少（封三彩圖1）。各組肝臟組織的炎癥評分以及纖維組織沉積定量分析也顯示了同樣的結(jié)果（圖1）。

2.4 hUC-MSCs移植改善肝硬化大鼠肝功能 與正常對照組相比，隨造模時間的延長，模型對照組及hUCMSCs移植組ALT、AST、TBIL及DBIL明顯升高，ALB則與之相反。hUC-MSCs 移植組大鼠ALT、AST、TBIL及DBIL 較模型對照組明顯降低（q≥22.88，均P ＜0.05），ALB則明顯升高（q≥9.61，均P＜0.05）。見表1。

表1 hUC-MSCs 移植對肝硬化大鼠各組肝功能的影響

2.5 抗氧化指標變化 與正常對照組大鼠相比，模型對照組及hUC-MSCs 移植組大鼠的肝組織氧化應激指標SOD、GSH及GPx活性的表達水平顯著降低，MDA 表達水平顯著升高（q≥24.47，均P ＜0.05），而相較于模型對照組而言，hUC-MSCs移植組大鼠肝組織SOD、GSH 及GPx 表達水平顯著升高，MDA 表達水平則顯著降低（q≥37.27，均P ＜0.05）。見圖2。

圖2 各組大鼠SOD、MDA、GSH 及GPx 氧化應激指標變化

3 討論

本研究結(jié)果顯示，大鼠應用CCl4橄欖油溶液皮下給藥42 d后，MASSON染色顯示匯管區(qū)及中央靜脈周圍可見大量纖維組織增生，包繞肝細胞形成假小葉，這與同類研究報道一致[13]，表明成功建立大鼠肝硬化模型。大鼠的肝臟病理組織學檢查結(jié)果表明，hUC-MSCs 移植可明顯改善肝細胞壞死，減少肝硬化大鼠的炎癥反應及纖維組織形成，這與骨髓源MSCs 移植治療效果相似[14]。

肝功能是衡量肝臟肝細胞損傷的重要尺度，ALT及AST水平可側(cè)面反映肝細胞損傷程度，ALB作為肝功能的靈敏指標，可協(xié)助評估肝損傷程度。有研究顯示，將骨髓源MSCs植入CCl4誘導的肝硬化小鼠體內(nèi)，可使小鼠的肝功能改善，死亡率降低[14]。本研究血清學檢測結(jié)果顯示，hUC-MSCs 移植可使ALT、AST、TBIL 及DBIL 明顯下降，ALB 明顯升高，與模型對照組差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），提示hUC-MSCs移植對肝硬化有治療作用，與上述研究結(jié)果一致。

氧化損傷是肝損傷的重要機制，肝臟作為機體重要的代謝器官容易受到自由基攻擊。肝細胞是肝臟功能的承擔者，肝細胞內(nèi)線粒體、微粒體以及過氧化物酶體可產(chǎn)生大量自由基，導致肝細胞氧化應激損傷進而最終發(fā)生肝臟功能障礙[15]。肝臟細胞的抗氧化防御體系由相關(guān)抗氧化酶及細胞因子共同構(gòu)成，其中SOD 是抗氧化防御體系中最重要的酶[16]，是人體細胞衰老及死亡的最直觀指標。GSH 和GPx可分解氫過氧化物，是衡量機體抗氧化能力的重要指標，MDA 是脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物，可間接反映機體受自由基攻擊的嚴重程度[17]。為證明hUC-MSCs 移植對肝硬化大鼠肝臟的抗氧化作用，本研究進一步檢測各組大鼠SOD、GSH、GPx 及MDA 含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型對照組相比，hUC-MSCs移植可顯著升高大鼠肝臟SOD、GSH 及GPx 水平，降低肝臟組織中MDA 含量（均P ＜0.05），提示hUC-MSCs 移植可緩解CCl4所致肝硬化大鼠肝組織的氧化損傷，抗氧化作用可能是其作用機制。

綜上所述，CCl4可成功誘導肝硬化模型，hUCMSCs 移植可能從抗氧化衰老方面改善大鼠的肝硬化程度。在致病因素持續(xù)存在的情況下，hUC-MSCs移植只能延緩肝硬化的進程，并不能逆轉(zhuǎn)肝硬化。