段晶晶，紀(jì)國文，郭芷君，徐 峰 （上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院南院，上海 201400）

癲癇在神經(jīng)科的發(fā)病率較高，僅次于腦血管疾病，患者首次發(fā)病后，經(jīng)常會反復(fù)發(fā)作，徹底治愈難度大，一般需要長期服藥以控制病情。在長期的抗癲癇治療過程中，患者受到藥物、氣候及周圍環(huán)境的影響，免疫功能下降，在治療期間易獲得院內(nèi)細菌性感染[1]。癲癇合并耐藥陽性菌感染的住院患者（尤其是ICU 患者）常聯(lián)合使用丙戊酸鈉和萬古霉素，以達到治療效果。但丙戊酸鈉治療指數(shù)低、體內(nèi)過程和療效存在較大個體差異，其有效血藥濃度范圍為50～100 μg/ml，而且該藥需要長期服用，易產(chǎn)生耐受，血藥濃度相對不穩(wěn)定，特別是與其他藥物聯(lián)用時，常發(fā)生相互作用而影響療效[2-3]。另外，萬古霉素療效與其血藥濃度密切相關(guān)[4]，2011 年美國感染病學(xué)會（IDSA）刊文指出，萬古霉素的血藥濃度應(yīng)達到10 μg/ml 以上，對于復(fù)雜、嚴(yán)重的感染應(yīng)達到15～20 μg/ml 方能起到更好的治療效果，同時萬古霉素的治療窗相對狹窄，血藥濃度過高可能導(dǎo)致腎功能損害及耳毒性發(fā)生。所以臨床用藥時需要對兩者進行血藥濃度監(jiān)測。

目前對丙戊酸鈉和萬古霉素進行血藥濃度監(jiān)測主要有高效液相色譜法和免疫分析法。采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）對兩者進行濃度檢測的文獻亦有報道，但均為對其單獨檢測，未見對兩者同時進行濃度檢測的報道。本研究擬建立同時測定血清中丙戊酸鈉和萬古霉素濃度的HPLC-MS/MS 法，并應(yīng)用于兩者聯(lián)合用藥時的血藥濃度監(jiān)測，該研究結(jié)果會對兩者在臨床的安全合理使用、節(jié)省醫(yī)療資源和減少患者醫(yī)療費用等方面起到積極作用。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1 260 高效液相色譜儀（美國 Agilent），包括G1322A 自動脫氣機，G1318B 自動調(diào)配四元泵，G1367E 自動進樣器，G1316A 可調(diào)柱溫箱；Agilent 6 420 triple quad LC/MS，圖譜分析軟件MassHunter Workstation Software（版本號B. 06.00）；XW-80A 型旋渦混合器（原上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）；BP110S 型電子分析天平（德國 Sartorius）；MIKRO12-24 型高速離心機（德國 Hettich）。

1.2 試藥

丙戊酸鈉對照品、丙戊酸鈉-d6對照品、萬古霉素對照品、卡那霉素B 對照品（European Directorate for the Quality of Medicines & HealthCare），甲醇、乙腈、甲酸（質(zhì)譜純，默克公司），水為重蒸去離子水。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱為美國Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（4.6 mm×100 mm, 3.5 μm），流速0.5 ml/min，柱溫25 ℃，進樣量4 μl，流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫見表1。

表1 梯度洗脫信息

2.2 質(zhì)譜條件

離子源為電噴霧離子化源（ESI），用多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）進行定量分析，用正負離子檢測模式。毛細管電壓4 000 V，噴霧氣壓力45 psi，干燥氣體流速10 L/min，干燥氣體溫度350 ℃。丙戊酸鈉和內(nèi)標(biāo)丙戊酸鈉-d6，選擇負離子模式檢測，離子反應(yīng)對[M-H]-分別為m/z143→143 和m/z149→149，碰撞能量均為0 V，裂解電壓均為110 V。萬古霉素和內(nèi)標(biāo)卡那霉素B，選擇正離子模式檢測，離子反應(yīng)對[M+H]+分別為m/z725→100 和m/z484→324，碰撞能量分別為46 V 和14 V，裂解電壓分別為142 V 和130 V。4 種藥物的四級桿捕捉時間均為0.2 s，電子倍增器300 V。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制

分別精密稱取丙戊酸鈉對照品和萬古霉素對照品20 mg 和10 mg，置于10 ml 棕色容量瓶中，用乙腈-水（50∶50）溶液定容至刻度，得到濃度分別為2 000 μg/ml 和1 000 μg/ml 的丙戊酸鈉和萬古霉素混合對照品儲備液，貯存于4 ℃冰箱備用。配制濃度均為100 μg/ml 丙戊酸鈉-d6和卡那霉素B 內(nèi)標(biāo)溶液，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 血清樣品處理

取血清樣品200 μl，置于1.5 ml 的EP 管中，分別加入內(nèi)標(biāo)丙戊酸鈉-d6和卡那霉素B 溶液各20 μl，渦旋混勻30 s，加入乙腈200 μl，渦旋混勻60 s，于室溫下以14 000 r/min 離心5 min，吸取上清液300 μl，加入乙腈-水（50∶50）溶液500 μl，渦旋混勻30 s，進樣分析，分析時間12 min。

3 結(jié)果

3.1 專屬性

取空白血清200 μl 置1.5 ml 的EP 管中，不加入內(nèi)標(biāo)溶液，按“2.4”項下操作進樣分析，獲得空白血清樣品的色譜圖；將一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液及內(nèi)標(biāo)加入空白血清中，依同法操作獲得相應(yīng)的色譜圖；另取臨床血清樣品，依同法操作得色譜圖。在該色譜質(zhì)譜條件下得到的丙戊酸鈉、萬古霉素和內(nèi)標(biāo)物的色譜峰良好，無明顯的雜質(zhì)峰干擾，丙戊酸鈉與丙戊酸鈉-d6的保留時間均為8.81 min，萬古霉素和卡那霉素B 的保留時間分別為2.82、2.24 min。結(jié)果表明，空白血清中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾丙戊酸鈉和萬古霉素的測定。色譜圖見圖1。

圖1 丙戊酸鈉和萬古霉素及內(nèi)標(biāo)的典型色譜圖

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量下限

取空白血清180 μl，加入用乙腈-水（50：50）溶液將丙戊酸鈉和萬古霉素混合對照品儲備液逐級稀釋成相應(yīng)的混合對照品系列溶液，按“2.4”項下操作法配制成血清中丙戊酸鈉濃度分別為1、2、4、10、20、100 和200 μg/ml，萬古霉素質(zhì)量濃度分別為 0.5、1、2、5、10、50 和100 μg/ml 的血清樣品，進樣分析。以待測物與內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度的比值為橫坐標(biāo)軸（X），以待測物與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)軸（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。用權(quán)重系數(shù)為1/χ2計算線性回歸方程。丙戊酸鈉和萬古霉素分別在1～200 μg/ml 和0.5～100 μg/ml 內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別為Y=2.71X+0.003 和Y=2.83X+0.19（r均＞0.999）。丙戊酸鈉定量下限為1.00 μg/ml，方法回收率為113.81%，RSD 為1.64%；萬古霉素定量下限為0.50 μg/ml，方法回收率為107.34%，RSD 為4.20%。

3.3 精密度與準(zhǔn)確度

按“3.2”項方法分別配制低、中、高3 個濃度的丙戊酸鈉（2、10 和100 μg/ml）和萬古霉素（1、5 和50 μg/ml）的質(zhì)控血清樣品各15 份，分為3 批，每批5 份，并與每批的標(biāo)準(zhǔn)曲線同時進行，按“2.4”項同法操作進樣，求得本法的精密度和準(zhǔn)確度。結(jié)果表明，低、中、高濃度的丙戊酸鈉和萬古霉素的批內(nèi)、批間精密度RSD 均小于15%，結(jié)果見表2。

表2 丙戊酸鈉和萬古霉素的精密度與準(zhǔn)確度( x±s，n=5)

3.4 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)

按“3.2”項方法分別配制低、中、高3 個濃度的丙戊酸鈉（2、10 和100 μg/ml）和萬古霉素（1、5 和50 μg/ml）的質(zhì)控血清樣品，按“2.4”項同法操作進樣得峰面積A1。另取3 份空白血清200 μl，先用200 μl 乙腈沉淀蛋白，經(jīng)14 000 r/min，5 min 離心沉淀后，取180 μl 該上清液，加入相應(yīng)濃度的丙戊酸鈉與萬古霉素混合標(biāo)準(zhǔn)液和內(nèi)標(biāo)溶液各20 μl，得3 個濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品，進樣得峰面積A2。再取3 份180 μl 重蒸去離子水，分別向其中加相應(yīng)濃度的丙戊酸鈉與萬古霉素混合標(biāo)準(zhǔn)液和內(nèi)標(biāo)溶液各20 μl，得到3 個濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品，進樣得峰面積A3。提取回收率即A1/A2×100%，基質(zhì)效應(yīng)即A2/A3×100%。結(jié)果表明，丙戊酸鈉和萬古霉素的基質(zhì)影響均在85%～115%之間，RSD 均小于15%，提取回收率平均值均達到70%以上，結(jié)果見表3。

表3 丙戊酸鈉和萬古霉素的基質(zhì)效應(yīng)與提取回收率( x±s，n=5)

3.5 穩(wěn)定性

按“3.2”項方法分別配制低、中、高 3 個濃度的丙戊酸鈉和萬古霉素的質(zhì)控血清樣品，考察樣品經(jīng)室溫放置24 h、4 ℃冷藏24 h、反復(fù)凍融3 次以及-80 ℃凍存30 d 的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，以上條件下3 個濃度樣品檢測結(jié)果的RSD 值均小于15%。結(jié)果見表4。

表4 丙戊酸鈉和萬古霉素的穩(wěn)定性( x±s，n=5)

4 討論

近年來，有報道[5-8]使用HPLC-MS/MS 法測定丙戊酸鈉和萬古霉素的血藥濃度，但都是分別單獨檢測，對它們同時檢測的HPLC-MS/MS 法尚未見報道。目前HPLC-MS/MS 法同時測定多種藥物血藥濃度的技術(shù)主要被用于測定同類藥物。同類藥物的理化性質(zhì)相似，方法的建立更簡單快速。但本實驗測定的丙戊酸鈉脂溶性強，而萬古霉素則為水溶性藥物，理化性質(zhì)存在差異，方法建立難度較大。在血清樣品的處理方法上，本實驗考慮了包括液-液萃取法、固相萃取法及蛋白沉淀法多種處理方法，液-液萃取法及固相萃取法操作復(fù)雜，時間較長，本實驗最終選擇使用蛋白沉淀法。通過對比甲醇、乙腈、10%三氯乙酸、10%三氯乙酸-甲醇（50∶50）等沉淀劑的蛋白沉淀效果，確定乙腈作為有機蛋白沉淀劑效果最好，此方法穩(wěn)定性好，同時也避免了引入新的雜質(zhì)對實驗結(jié)果產(chǎn)生影響。另外，樣本單純經(jīng)乙腈沉淀蛋白后直接進樣分析，會導(dǎo)致萬古霉素提取回收率較低，因此我們在乙腈沉淀蛋白后嘗試了按不同比例加入純化水稀釋，雖然萬古霉素提取回收率得到了改善，但穩(wěn)定性下降且峰形較差，雜峰較多。最后嘗試比較了不同比例的甲醇-水溶液和乙腈-水溶液稀釋法，確定了以乙腈-水（50∶50）溶液稀釋乙腈沉淀蛋白后的提取液，不僅提取回收率得到了提高，且穩(wěn)定性良好，可以滿足臨床樣本檢測的需要。在流動相的選擇上，本實驗選擇了0.1%甲酸水溶液-乙腈作為流動相，與文獻報道[5-8]使用的乙腈-20 mmol/L 乙酸銨水溶液、0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸甲醇溶液等相比，該流動相配制簡單，更適合用于丙戊酸鈉和萬古霉素2 種藥物的同時檢測，峰形較好，無拖尾現(xiàn)象。

在臨床上，丙戊酸鈉和萬古霉素均為監(jiān)測其血藥谷濃度，采血時間相同。采用本方法對丙戊酸鈉和萬古霉素同時進行血藥濃度監(jiān)測，不僅可以避免兩次抽血給患者帶來的不適，提高患者依從性，同時降低了檢測成本，有利于節(jié)約醫(yī)療成本，減少患者醫(yī)療支出。