胡 丹，劉春光，曹 紅，張貴英，馬紫輝，鄭明明 （. 中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊藥品儀器監(jiān)督檢驗總站,北京 0066；. 武警北京市總隊醫(yī)院藥劑科, 北京 0007；. 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院, 內(nèi)蒙古 呼和浩特 00059）

玄膝榮筋散是由螞蟻、青風(fēng)藤、老鸛草、川芎、全蝎、重樓等十三味中藥組成的復(fù)方制劑，其中黃芪為君藥，白術(shù)、桂枝為臣藥，具有滋補(bǔ)肝腎，養(yǎng)肝榮筋，消熱利濕，祛風(fēng)止痛。用于早、中、晚期風(fēng)濕、寒型類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。由于該標(biāo)準(zhǔn)中僅包含一個川芎薄層色譜鑒別和螞蟻、黃芪的顯微鑒別，且無定量測定方法，不能全面控制制劑質(zhì)量。根據(jù)全軍醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑標(biāo)準(zhǔn)提高課題要求，在原有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上，增加了川芎、穿山龍的薄層鑒別，同時采用高效液相色譜法，測定玄膝榮筋散中所含桂皮醛的含量，該法靈敏度高、專屬性好、操作簡便、重現(xiàn)性好。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AD 島津高效液相色譜儀（日本）； 紫外檢測器。

1.2 試藥

玄膝榮筋散（批號：140601、131226、140701，規(guī)格：250g/袋），由南京政治學(xué)院門診部提供；桂皮醛（對照品，批號：110710-201418，中國食品藥品檢定研究院）；乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別

2.1.1 川芎[1]

取本品5 g，加乙醚20 ml，超聲處理15 min，濾過，濾液低溫?fù)]去乙醚，殘渣加乙酸乙酯1 ml 使溶解，作為供試品溶液。取川芎對照藥材0.5 g，同法制成對照藥材溶液。取缺川芎的陰性樣品，同法制備陰性對照液。吸取上述3 種溶液各10 μl，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯(9∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點，陰性試驗樣品未見干擾，見圖1。

圖1 川芎薄層色譜圖

取本品粉末15 g，加甲醇50 ml，加熱回流1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 ml 使溶解，作為供試品溶液。另取穿山龍對照藥材0.5 g，加甲醇25 ml，同法制成對照藥材溶液。取缺穿山龍的陰性樣品，同法制備陰性對照液。吸取上述3 種溶液各5 μl，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水 (13∶7∶2)的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10 %硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點，陰性試驗樣品未見干擾，見圖2。

圖2 穿山龍薄層色譜圖

2.2 含量測定[2-8]

2.2.1 色譜條件

色譜柱：KR100-5C18(250mm×4.6mm ；5μm，E14878)；流動相：乙腈-水（35∶65）;流速：1.0 ml/min；檢測波長290 nm；進(jìn)樣體積：10 μl。在此條件下，樣品中桂皮醛與基線達(dá)到良好分離，見圖3。

2.2.2 對照品溶液的制備

取桂皮醛對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml 含桂皮醛 15 μg 的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備

取樣品（過四號篩）粉末約1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入80 %乙醇25 ml，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）20 min，放冷，再稱定重量，用 80 %乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

四是產(chǎn)業(yè)發(fā)展滯后，收益水平不高。采取將秸稈全部切碎直接深耕還田，每667 m2耕地將需要額外增加150元左右的成本。據(jù)調(diào)查，南嘴鎮(zhèn)環(huán)保木頭廠只愿意承擔(dān)100元/t的價格定點收購。此外，秸稈“五化”利用不足，秸稈綜合利用技術(shù)并未大范圍推廣。產(chǎn)業(yè)發(fā)展滯后，導(dǎo)致收益水平不高，制約秸稈綜合利用企業(yè)的發(fā)展[1]。

2.2.4 陰性對照溶液的制備

按處方量制備缺桂枝的陰性樣品，按供試品溶液方法制備陰性對照溶液。

2.2.5 專屬性試驗

取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析，陰性對照液中色譜峰對測定無干擾（見圖3）。

圖3 專屬性試驗HPLC 圖譜

2.2.6 線性關(guān)系考察

取桂皮醛對照品適量，加甲醇溶解并制成每1 ml含0.032 6 mg 溶液，作為對照品溶液5,將溶液5 分別稀釋為0.004 89、0.008 150、0.016 3、0.024 45 mg/ml四種濃度，作為對照品溶液1～4。精密吸取上述對照品溶液1～5 各10μl，注入液相色譜儀，按“2.2.1”項下色譜條件測定峰面積，以進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：Y=10 181 123.15X+6 639.54，r=1.00，結(jié)果表明：桂皮醛在0.048 9～0.326 0 μg/ml 范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

2.2.7 精密度試驗

精密吸取“2.2.3”項下供試品溶液，在上述色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣6 次。結(jié)果峰面積的RSD 為1.07%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.2.8 重復(fù)性試驗

取同一批號的玄膝榮筋散（批號140 601）按“2.2.3”項下制備方法平行制備6 份供試品溶液，按上述色譜條件，測得桂皮醛峰面積RSD 為1.12%，結(jié)果表明此法重復(fù)性良好。

2.2.9 穩(wěn)定性試驗

取同一批號的玄膝榮筋散（批號140 601）樣品，精密稱定，照上述含量測定方法，精密吸取10 μl,分別在0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣，測定一次。結(jié)果桂皮醛峰面積的RSD 為0.95%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗

取同一批號的玄膝榮筋散（批號140601）0.5 g，精密稱定，分別精密加入桂皮醛（0.008 15 mg/ml）對照品溶液25 ml，按“2.2.3”項下制備方法平行制備6 份供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件測定，結(jié)果見表1。

表1 桂皮醛加樣回收率試驗測定結(jié)果

2.2.11 含量測定

取3 批樣品，按上述供試品溶液制備方法處理，進(jìn)樣，計算桂皮醛的含量，見表2。

表2 玄膝榮筋散中桂皮醛含量測定結(jié)果(n=3)

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

桂皮醛為桂枝藥材的主成分，經(jīng)紫外吸收光譜掃描（200～400 nm），在291 nm 處有最大吸收，故確定檢測波長為290 nm。

3.2 提取方法及溶劑選擇

參照2020 版《中國藥典》[1]中桂皮醛含量測定的方法，分別取樣品2.025 1、1.053 0、0.516 9 g，加入不同濃度的乙醇、甲醇等，超聲處理20、30、40 min，按照正文的含量測定項下方法進(jìn)行測定。結(jié)果表明，最終選擇取樣量為1g，選用80%乙醇為溶劑，在超聲30 min 后提取較完全。

3.3 薄層色譜及耐用性條件考察

建立該制劑中川芎、穿山龍的薄層色譜鑒別方法，擬增加黃芪、甘草的薄層實驗中，因存在陰性試驗樣品有干擾的問題，故未列入正文。對TLC 方法，分 別 從 溫 度（10 °C 和35 °C）、相 對 濕 度（42%和88%）以及不同硅膠板（國產(chǎn)和進(jìn)口）等方面進(jìn)行考察。在各試驗條件下，鑒別結(jié)果不受溫度、相對濕度和不同硅膠板等條件改變的影響。說明本文所建立的薄層色譜方法作為定性鑒定方法具有很強(qiáng)的適用性。

本實驗運用高效液相色譜法建立了桂皮醛含量測定的方法，經(jīng)過試驗驗證，該法靈敏度高、專屬性好、操作簡便、重現(xiàn)性好，可作為該制劑生產(chǎn)過程中的質(zhì)量控制及檢驗手段，更好把控藥品療效與臨床用藥安全。