秦 燁，黃 瑋，顧雨芳，張慈安，修麗娟，唐繼貴，張 鳳，劉 煊 （. 中國人民解放軍中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院,湖北 武漢 4004；. 上海市閔行區(qū)古美社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心, 上海 00；. 海軍軍醫(yī)大學(xué)長征醫(yī)院, 上海 0000）

消痰通腑方應(yīng)用于治療胃腸癌前病變患者已有十余年，能夠延緩胃腸癌前患者向腫瘤的進(jìn)展，同時(shí)對(duì)膿毒癥等危重癥患者的胃腸功能恢復(fù)有較好療效[1-5]。該方劑由法半夏、生大黃、制大黃、制南星、重樓和黃連六味中藥配伍組成，法半夏、制大黃為主藥，旨在消痰止嘔、泄下通俯之意。半夏乃燥濕化痰、降逆止嘔、消痞散結(jié)之良藥，法半夏為半夏的炮制品，倍其化痰之力；制大黃為生大黃炒制，瀉下力緩，能通達(dá)腸腑而推陳出新，又不傷正氣，兩者合用，既燥濕化痰，又緩消積滯，達(dá)消痰通腑之功。黃連既能瀉脾胃之火，又能燥痰飲之濕。

目前對(duì)該方劑的研究集中在藥理功效方面，尚無對(duì)該方劑化學(xué)成分、有效成分的相關(guān)研究報(bào)道。尋找中藥復(fù)方的臨床藥效基礎(chǔ)，是長期困擾中醫(yī)人臨床研究的難點(diǎn)。超高效液相色譜四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法（UHPLC-Q-TOF/MS）是一種簡便、快速、高靈敏度的現(xiàn)代分析技術(shù)，能夠提供化合物的精確分子量、元素組成以及離子碎片信息（MS1 和MS），廣泛用于中藥化學(xué)成分的快速分析和鑒別[6-7]。本研究擬采用此方法對(duì)消痰通腑方的化學(xué)成分開展研究，為其質(zhì)量標(biāo)志物篩選和探明藥效物質(zhì)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

Agilent 1290 Infinity 型超高效液相色譜和6530 型四極桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國安捷倫）；CPA255D 型1/10 萬電子天平(德國Sartorius)；Eppendorf mini spin 離心機(jī)、Eppendorf 5430r 離心機(jī)(德國Eppendorf)；Lyovapor L-200 冷凍干燥機(jī)(瑞士BUCHI)；Milli-Q 型純水系統(tǒng)(美國Millipore)；SK7200H 型超聲儀(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司)。

甘草酸（批號(hào)：F610137）、重樓皂苷I（批號(hào)：F278755）、重樓皂苷II（批號(hào)：F297228）、重樓皂苷VI（批號(hào)：F483230）、薯蕷皂苷（批號(hào)：F543583）、重樓皂苷H（批號(hào)：F297228）、奎寧酸（批號(hào)：F435708）、檸檬酸（批號(hào)：F594530）、異佛萊心苷（批號(hào)：F109963）、芹糖異甘草苷（批號(hào)：F667242）購自上海一飛生物科技有限公司，異佛萊心苷純度為95%，其余對(duì)照品純度均≥98%；蘆薈大黃素（批號(hào)：D1226AS）、大黃素甲醚（批號(hào)：O1026AS）、大黃酚（批號(hào)：D0316AS）、大黃酸（批號(hào)：N1107AS）購自大連美侖生物科技有限公司，純度均≥98%；水為去離子水；甲醇、乙腈、甲酸（質(zhì)譜純，德國E. Merck公司）；其余試劑均為分析純。

消痰通腑免煎劑由法半夏、生大黃、制大黃等藥物組成。由江陰制藥廠生產(chǎn)，長征醫(yī)院監(jiān)制，生產(chǎn)批號(hào)：20 200 420。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備

精密稱定免煎劑0.5 g，加入70%甲醇50 ml，超聲提取30 min，得70%甲醇提取物（簡稱醇提液）；精密稱定免煎劑0.5 g，加入70～80°C 熱水50 ml，攪拌5 min，超聲提取30 min 得水提液。提取液于3 000 r/min 離心10 min，取上層溶液1.5 ml置離心管中，再經(jīng)15 000 r/min 離心10 min，取上清液過0.22 μm 微孔濾膜，即得。

2.2 對(duì)照品溶液制備

精密稱取適量甘草酸、蘆薈大黃素等對(duì)照品，加甲醇分別制成每1 ml 含對(duì)照品1 mg 的儲(chǔ)備溶液。精密吸取上述儲(chǔ)備溶液各10 μl，置于1.5 ml離心管中混合，渦旋混勻，加入甲醇配制成各對(duì)照品濃度分別為10 μg/ml 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.3 化合物分析庫的建立和數(shù)據(jù)分析

從已有的藥材化合物成分分析文獻(xiàn)中獲取該方劑各味藥的成分信息，確保數(shù)據(jù)庫中收錄的化合物能夠在已發(fā)表的文獻(xiàn)中檢索可得，在基于Agilent自帶的defult 文檔上建立方劑化合物數(shù)據(jù)庫。采用Agilent MassHunter Qualitative Analysis 10.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2.4 色譜條件

Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），以 0.1% 甲酸水溶液（A）-乙腈（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（0～3 min，5 %B；3～15 min，5 %～35 %B；15～30 min，35 %～95 %B），柱溫30 °C，流速0.3 ml/min，進(jìn)樣量1 μl，檢測波長254 nm。

2.5 質(zhì)譜條件

ESI 離子源，分別在正、負(fù)離子模式下采集數(shù)據(jù)，采集范圍100～1 700m/z。離子源溫度350 ℃，毛細(xì)管電壓3.5 kV（正離子）、4.0 kV（負(fù)離子），霧化氣壓力45 Psi，干燥氣流速11 L/min，鞘氣流速11 L/min，鞘氣溫度350 ℃，碎片電壓140 V。對(duì)照品和消痰通腑方的UHPLC-Q-TOF/MS 色譜圖分別見圖1 和圖2。

圖1 混合對(duì)照品的UHPLC-Q-TOF/MS 色譜圖

圖2 消痰通腑方的UHPLC-Q-TOF/MS 色譜圖

2.6 化合物的鑒定

在全掃描質(zhì)譜圖中，大多數(shù)對(duì)照品化合物在正模式下顯示[M+H]+離子，或在負(fù)模式下顯示[M-H]-。由于流動(dòng)相中存在Na+和甲酸，部分化合物中觀察到[M+Na]+和[M+HCOOH-H]-，少許化合物中觀察到[M+K]+、[M+NH4]+及[M+CH3COOH-H]-。

化合物的鑒定首先使用 Agilent 10.0 軟件中的按化學(xué)式查找功能，根據(jù)精確質(zhì)量、同位素豐度，以及上述分子離子峰進(jìn)行鑒定。當(dāng)有對(duì)照品時(shí)，通過比較其在圖譜上的保留時(shí)間和m/z信息與對(duì)照品的相關(guān)信息進(jìn)行鑒別。在沒有對(duì)照品的情況下，主要根據(jù)質(zhì)譜信息（包括化合物二級(jí)質(zhì)譜信息）和參考文獻(xiàn)進(jìn)行初步的鑒定。根據(jù)質(zhì)譜信息和參考文獻(xiàn)進(jìn)行初步鑒定時(shí)，通過導(dǎo)入已建立的方劑化合物數(shù)據(jù)庫，利用Agilent 10.0 軟件進(jìn)行識(shí)別，并結(jié)合Massbank、Pubchem、Chemspider 等在線數(shù)據(jù)庫進(jìn)行輔助分析，根據(jù)化合物準(zhǔn)確分子量及碎片信息進(jìn)行判斷，排除假陽性結(jié)果。例如：

化合物1：通過數(shù)據(jù)庫識(shí)別到0.906 min 的分子離子峰在正負(fù)離子模式下分別出現(xiàn)m/z175.119 3的[M+H]+離子和m/z173.103 6 的 [M-H]-離子，軟件自動(dòng)生成匹配度最高分值的分子式為C6H14N4O2，說明其可能為精氨酸。其次，結(jié)合Massbank 在線數(shù)據(jù)庫對(duì)其二級(jí)碎片離子進(jìn)行查找，發(fā)現(xiàn)正離子模式下可識(shí)別到158、116 碎片離子，負(fù)離子模式下可識(shí)別到173、131 等碎片離子，因此，推斷化合物1為精氨酸，結(jié)合我們建立化合物數(shù)據(jù)庫信息，判斷該化合物來源于黃連或制半夏[8]。

化合物12：通過數(shù)據(jù)庫識(shí)別到1.394 min 的分子離子峰在正負(fù)離子模式下分別出現(xiàn)m/z333.087 8的[M+H]+離子和m/z331.067 2 的 [M-H]-離子，軟件自動(dòng)生成匹配度最高分值的分子式為C13H16O10。其次，化合物產(chǎn)生m/z169 沒食子酸的特征碎片離子，而大黃中的簡單酚酸類成分基本結(jié)構(gòu)主要是沒食子酸、對(duì)香豆酸、阿魏酸、對(duì)羥基苯丙酸等，因此，推測該化合物為來源于大黃的沒食子酸-3-O-β-D-葡萄糖苷[9]。

化合物44：負(fù)離子模式下在17.208 min 識(shí)別到m/z837.388 6 的 [M-H]-離子，軟件自動(dòng)生成匹配度最高分值的分子式為C42H62O17。其次，化合物產(chǎn)生m/z351 的離子峰，為其結(jié)構(gòu)中2 分子的葡萄糖醛酸苷鍵斷裂形成的碎片離子m/z351[2 ×C6H8O6-H]-離子，因此，推斷化合物44 為甘草皂苷G2，來源于法半夏[10]。

考慮到此中藥方劑以水沖服的方式，本研究還同步分析了水提液的化學(xué)成分，結(jié)果亦參見圖2 和表1。結(jié)果表明，70%甲醇提取物能夠識(shí)別的化合物比水提液識(shí)別的化合物多10 個(gè)，且化合物的峰面積也較高。與70%甲醇提取方式獲得化合物相比，水提液識(shí)別的是即將吸收入血的體外化合物群的信息，而70%甲醇提取液識(shí)別的則是方劑中更多的化合物的信息，有助于解析其多成分的特征，保證消痰通腑免煎劑所含有的化合物的準(zhǔn)確性，也有助于免煎劑生產(chǎn)的質(zhì)量控制。

表1 消痰通腑方的鑒定分析結(jié)果

(續(xù)表1)

(續(xù)表1)

通過上述分析方法得到55 種化合物，其中，精氨酸、奎寧酸、檸檬酸、黃連堿、格蘭地新、綠原酸、木犀草素、色氨酸共8 個(gè)化合物來自黃連；脫氧腺苷、薯蕷皂苷、重樓皂苷G、polyphylloside III、重樓皂苷II、纖細(xì)薯蕷皂苷、重樓皂苷H、重樓皂苷VI、重樓皂苷I 共9 個(gè)化合物來自重樓；異亮氨酸、苯丙氨酸、夏佛托苷、秋水仙堿、胡蘿卜苷共5 個(gè)化合物來自天南星；精氨酸、脫氧腺苷、異亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、鼠李糖甘草苷、異佛萊心苷、芹糖異甘草苷、異甘草苷、甘草皂苷G2、甘草酸共10 個(gè)化合物來自法半夏；沒食子酸-3-Oβ-D-葡萄糖苷、沒食子酸、對(duì)香豆酸-O-葡萄糖苷、兒茶素-O-葡萄糖苷/表兒茶素-O-葡萄糖苷、原花青素B2、兒茶素、阿魏酸、4-( 4'-羥基苯基) -2-丁酮-O-阿魏酰-沒食子酰-葡萄糖苷、沒食子酸-O-沒食子?；咸烟擒?、對(duì)香豆酸、大黃素甲醚、2-甲基-5-羧甲基-7-羥基色原酮、表兒茶素沒食子酸酯、大黃酸-8-O-葡萄糖苷、異蓮花掌苷、2-O-桂皮-β-D-葡萄糖苷、2-(2'-羥丙基)-5-甲基-7-羥基色原酮、番瀉苷B、桂皮酸-O-沒食子酰-葡萄糖苷、6-甲氧基酸模素-8-O-β-D-葡萄糖苷、蘆薈大黃素-3-羥甲基-O-葡萄糖苷、大黃酚-8-O-葡萄糖苷、大黃素甲醚-8-O-D 葡萄糖苷、決明柯酮-O-乙酰基葡萄糖苷、大黃酸、蘆薈大黃素、大黃酚共27 個(gè)化合物來自生大黃或制大黃，具體參見表1。其中，部分化合物例如精氨酸、脫氧腺苷、異亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸是根莖類化合物的共有化學(xué)成分，在黃連、重樓及半夏中均可以檢測到，因此，根據(jù)化合物的文獻(xiàn)檢索進(jìn)行了相應(yīng)的歸屬。

3 討論

中藥方劑在中醫(yī)臨床實(shí)踐中形成了以湯劑為主的口服給藥方式，藥材煎煮制備獲得復(fù)方時(shí)是否會(huì)導(dǎo)致化學(xué)成分的改變，消痰通腑方免煎劑是否也需要對(duì)上述化合物進(jìn)行檢測來確定方劑的質(zhì)量均未知。再有，中藥方劑具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑、整合調(diào)節(jié)的作用特點(diǎn)，因此，有必要對(duì)消痰通腑方所含所有藥材的化學(xué)成分群進(jìn)行分析，初步確定其化學(xué)成分特征，為后期研究和臨床應(yīng)用提供數(shù)據(jù)參考。

為了實(shí)現(xiàn)化合物的高效、快速提取，首先考察了不同的超聲提取溶劑（水、70%及100%甲醇溶液）、提取時(shí)間（30、45 和60 min）、樣品與溶劑的比例（1:5、1:10 和1:20），結(jié)果表明，以10 倍溶劑即50 ml 的75%甲醇溶液超聲提取30 min 為最佳樣品制備方法。為了獲得分離效果好、總離子流強(qiáng)的色譜圖，選擇了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-水（含0.1%甲酸）和乙腈-水（含0.1%甲酸）流動(dòng)相體系進(jìn)行分析。結(jié)果表明，乙腈-0.1%甲酸水溶液組成的流動(dòng)相在正、負(fù)離子掃描模式下均表現(xiàn)出良好的分離效果和豐富的信號(hào)響應(yīng)。除此以外，本研究還考察了不同流速（0.3、0.4 和0.5 ml/min）和不同柱溫（25、30 和35 ℃）對(duì)于分析效果的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)柱溫在30 °C，流速為0.3 ml/min 時(shí)，色譜峰峰形尖銳、色譜圖基線穩(wěn)定，柱壓平穩(wěn)。

本研究采用的分析方法具有快捷、簡便、易行，樣品用量小和高通量等特點(diǎn)，且樣品前處理簡單，所建立的方法可用于快速鑒別消痰通腑方免煎劑的化學(xué)成分。所鑒定的化合物中包括多數(shù)具有抗炎抗腫瘤等活性的化合物。例如，已有文獻(xiàn)表明，重樓皂苷類成分如重樓皂苷I 可以通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移等發(fā)揮抗腫瘤作用[24-25]；天南星中的夏佛托苷可以通過誘導(dǎo)自噬激活發(fā)揮抗腫瘤細(xì)胞增殖作用[26]；黃連堿作為黃連中的主要成分之一，具有抗真菌、胃黏膜保護(hù)、細(xì)胞毒等一些藥理活性[27]；含大黃的方劑具有輔助放、化療增敏減毒的功效，所含化合物大黃酸、大黃素甲醚在抗炎、抗腫瘤等方面都具有顯著效果[28]。

綜上，本研究基于UHPLC-Q-TOF/MS 技術(shù)開展消痰通腑方免煎劑中的化學(xué)成分分析，豐富了全方的物質(zhì)基礎(chǔ)研究，為進(jìn)一步明確其質(zhì)量控制標(biāo)志物和藥效物質(zhì)研究提供了科學(xué)依據(jù)。