王子妍，張曉慧，芮明忠，周 敏，傅晉翔 （蘇州弘慈血液病醫(yī)院血液科, 江蘇 蘇州 215000）

細(xì)胞間隙連接（Intercellular gap junction, GJIC）是一種存在于人體所有細(xì)胞中的膜通道，由連接蛋白(connexins, Cxs)形成，并負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)移生物活性分子、代謝物和相鄰細(xì)胞或細(xì)胞與細(xì)胞外環(huán)境間的鹽離子，對細(xì)胞的增殖、分化及機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、新陳代謝、生長發(fā)育起至關(guān)重要作用[1]。實(shí)驗(yàn)證實(shí)小鼠骨髓、肝臟及脾臟基質(zhì)中有11 種不同的連接蛋白表達(dá)，但人類骨髓基質(zhì)中僅僅有3 種Cxs (Cx31、Cx43、Cx45)表達(dá)。多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)均證實(shí)Cx43 在支持正常造血過程中具有重要作用，而我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，Cx43 在多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）的發(fā)病過程中具有重要作用，患者骨髓微環(huán)境中的Cx43 表達(dá)水平較正常明顯升高，骨髓瘤細(xì)胞與成骨細(xì)胞相互作用后可通過由Cx43 組成的GJIC 促進(jìn)其遷移，上調(diào)Cx43 表達(dá)對多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的增殖及遷移均起到促進(jìn)作用，Cx43 表達(dá)異常與骨髓瘤融合細(xì)胞發(fā)生相關(guān)[2-3]。然而Cx43 在MM 細(xì)胞生存及耐藥中的作用尚未闡明，尤其在多發(fā)性骨髓瘤干細(xì)胞及其與微環(huán)境中作用尚不明確。有鑒于此，本研究分離、培養(yǎng)MM 患者及正常志愿者來源骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MM-MSCs、NDMSCs)，在直接共培養(yǎng)條件下觀察MM 干細(xì)胞樣細(xì)胞生物學(xué)特性的變化及MM-MSCs 對MM 干細(xì)胞樣細(xì)胞的生存及耐藥的作用，并探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

細(xì)胞株：MM 細(xì)胞株RPMI 8 226、U266、XG4、XG7(蘇州大學(xué)生物技術(shù)研究所張學(xué)光教授惠贈)；試劑：FBS、PBS、LG-DMEM 完全培養(yǎng)液、RPMI1640培養(yǎng)基（美國Gibco 公司)；Midi MACs 系統(tǒng)（德國Milteyni 公司）；Hoechst33342（美國Sigma 公司)；抗Cx43 及GAPDH 一抗（美國CST 公司）；RNeasy kit 試劑盒、QuantiTect reverse transcriptase kit 試劑盒、TopTaq Master Mix Kit 試劑盒（美國Qiagen 公司）；Cytometric Beads Array 試劑盒（美國BD 公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和檢測方法

1.2.1 MM 患者及正常志愿者的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離和培養(yǎng)

參考文獻(xiàn)[4]的方法，采用Ficoll 分離MM 患者及正常志愿者骨髓單個核細(xì)胞（BM-MNCs），用含10%FBS 的LG-DMEM 完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，觀察細(xì)胞狀態(tài)，72 h 后首次換液，以后根據(jù)情況每2～3 d，換液1 次。待細(xì)胞生長至80%融合后，胰酶消化傳代。傳至第三代后收獲細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，剩余細(xì)胞標(biāo)記后凍存于液氮罐中備用。志愿者及患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSCs)的分離、擴(kuò)增和鑒定在知情同意下獲得，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2.2 MM 細(xì)胞株及原代MM 細(xì)胞分離和培養(yǎng)

RPMI 8 226、U266 采用含有10% FBS 的RPMI 1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)。XG4、XG7 采用含有10% FBS、1 ng/ml IL-6 的RPMI1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)。原代MM細(xì)胞來自6 例初診MM 患者骨髓：用Ficoll 分離BM-MNCs，并用Midi MACs 系統(tǒng)純化，留取CD38+、CD138+細(xì)胞，操作按說明書進(jìn)行，分選后的細(xì)胞采用流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測其純度，CD38+、CD138+細(xì)胞≥90%，采用含有10% FBS 的RPMI1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)。觀察細(xì)胞狀態(tài)，48 h 后首次換液，以后根據(jù)情況每1～2 d，換液1 次。傳至第三代后收獲細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，剩余細(xì)胞標(biāo)記后凍存于液氮罐中備用。

1.2.3 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原分析

取對數(shù)生長期F3 代MM-MSCs 及ND-MSCs，用PBS 洗滌后，調(diào)整細(xì)胞濃度為2.0×106/ml，每取100 μl 細(xì)胞懸液，分別加入PE 標(biāo)記的CD90、CD73、CD44、CD105、CD34、CD45 及HLA-DR，陰性對照為PE 標(biāo)記的同型IgG，室溫下孵育30 min，PBS洗滌2 次后，F(xiàn)CM 上機(jī)檢測。

1.2.4 MM 細(xì)胞株及原代MM 細(xì)胞SP 測定及分選

按文獻(xiàn)[5]報(bào)道的方法，分別取RPMI 8 226、U266、XG4、XG7 及原代MM 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為106/ml，加入濃度為1 mg/ml 的Hoechst33342，調(diào)整其終濃度為5 μg/ml，混勻后置于37 ℃水浴箱中避光孵育120 min，期間數(shù)次晃動離心管。對照組于此步驟中加入終濃度為50 μmol/L 維拉帕米同時孵育。離心后PBS 洗滌，用含碘化丙啶(2 μg/m1)的4 ℃預(yù)冷PBS 重懸細(xì)胞，并置于冰浴中。FCM上機(jī)檢測，激發(fā)波長為350 nm，采集波長為450 nm(藍(lán)光)和675 nm(紅光)，通過與對照組比較，選取染色偏弱部分的細(xì)胞即為SP 細(xì)胞。SP 細(xì)胞分選按上述步驟準(zhǔn)備細(xì)胞，ALTRA 流式細(xì)胞儀更換鞘液并用酒精進(jìn)行清洗后換為雙蒸水沖洗；分別上Hoechst33342 管 和Hoechst33342+verapamil 管 進(jìn)行檢測，F(xiàn)CM 選擇SP 分選方案，調(diào)整分選參數(shù)，全程需要振蕩，分選結(jié)束后在無菌條件下分別收集主群細(xì)胞(MP)和側(cè)群細(xì)胞(SP)，備用。

1.2.5 蛋白印跡分析不同細(xì)胞Cx43 表達(dá)水平

分別收集RPMI8226、SP 細(xì)胞、ND-MSCs、MMMSCs、SP 細(xì)胞+ND-MSCs、SP 細(xì)胞+ND-MSCs+25 mmol/L α-GA、SP 細(xì)胞+MM-MSCs 和SP 細(xì)胞+MM-MSCs+25 mmol/L α-GA 各組細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS 洗滌細(xì)胞3 次，加入細(xì)胞裂解液，置4 ℃作用30 min，12000 g/min 離心10 min，收集上清液，BCA法測定蛋白濃度，加入4×SDS 凝膠加樣緩沖液混勻，煮沸10 min 使蛋白變性。然后，行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），并轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，封閉1 h 后，分別與抗Cx43 及GAPDH 一抗4 ℃孵育過夜，TBS 液洗滌后再與HRP 標(biāo)記的二抗共孵育1 h，洗滌后，應(yīng)用ECL 化學(xué)發(fā)光法顯象和Image圖象分析軟件分析。

1.2.6 間隙連接對SP 細(xì)胞的細(xì)胞周期影響

采用碘化吡啶(PI)法。實(shí)驗(yàn)分組：①SP 細(xì)胞+MM-MSCs；②SP 細(xì)胞+MM-MSCs+25 mmol/L 18α 甘草次酸(α-GA)；③對照組為RPMI 8 226 細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)設(shè)3 復(fù)孔，F(xiàn)CM 分析其DNA 含量，CellQuest軟件分析結(jié)果。

1.2.7 間隙連接對SP 細(xì)胞體外集落形成能力的影響

采用甲基纖維素半固體培養(yǎng)法。實(shí)驗(yàn)分組：①SP 細(xì) 胞+MM-MSC 組；②SP 細(xì) 胞+MM-MSC+25 mmol/L α-GA 組。分別調(diào)整SP 細(xì)胞和MMMSC 細(xì)胞濃度為4×105/ml 和2.0×106/ml，與等量的2%甲基纖維素混均后，接種于6 孔板，每孔總體系2 ml；置飽和濕度、37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，14 d 取出，置倒置顯微鏡下記錄集落數(shù)，≥50細(xì)胞為集落，≤50 則為簇。

1.2.8 MM 細(xì)胞c-myc、KIF4、SOX2 及OCT4 基因表達(dá)

采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）方法。實(shí)驗(yàn)分組：①RPMI 8 226 組；②新鮮分離SP 細(xì)胞組；③SP 細(xì) 胞+MM-MSC 組；④SP 細(xì) 胞+MMMSC+25 mmol/L α-GA 組。收集各組細(xì)胞，操作按試劑盒說明進(jìn)行。簡述如下：采用RNeasy kit 試劑盒提取RNA 樣本，取1μg RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，按等量cDNA 進(jìn)行PCR 反應(yīng)。所有引物序列均由上海生物工程公司設(shè)計(jì)并合成，采用β-actin 為內(nèi)參。βactin 上 游 引 物 5′-TCCTGTGGCATCCACG AAA CT-3′，下游引物 5′-GAAGCATTTGC GGTGGA CGAT-3′，其它引物見表1。PCR 擴(kuò)增條件均為：94 ℃5 min、94 ℃ 40 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 32 s，共35 個循環(huán)。取4 μl PCR 產(chǎn)物、Marker 3.5 μl 分別加樣于2.0%瓊脂糖凝膠中電泳，電壓100V 電泳30～60 min，紫外投射儀觀察目標(biāo)條帶，攝影，圖象分析軟件Smartview2001 分析處理結(jié)果。

表1 干細(xì)胞樣基因引物序列

1.2.9 阻斷GJIC 對BM-MSCs 細(xì)胞因子分泌的作用

采用CBA 檢測法。取對數(shù)生長期MM-MSCs，調(diào)整細(xì)胞數(shù)1×105/ml 接種于6 孔板，培養(yǎng)箱靜置4 h 棄上清，并將不同MM 細(xì)胞按1×105/ml 的濃度接種該孔中，每孔2 ml，分組為：①RPMI 8 226 細(xì)胞；②SP 細(xì)胞+MM-MSCs；③SP+MM-MSCs+α-GA（25mmol/L)；④MM-MSCs。每組設(shè)3 個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h 后收集培養(yǎng)上清，利用CBA 技術(shù)測定上清中IL-6、IL-10、TGFβ、bFGF 和IL-17 的變化。

1.2.10 間隙連接對MM 細(xì)胞蛋白酶體抑制劑敏感性的影響

采用annexinV/PI 標(biāo)記細(xì)胞流式術(shù)分析法。取對數(shù)生長期MM-MSC 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)4×105/孔接種于24 孔板；RPMI8226 或SP 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)2×104/孔接種于24 孔板，培養(yǎng)箱靜置4 h后去上清，分組如下：①RPMI8226；②RPMI8226+硼替佐米(BTZ)；③SP+BTZ；④SP+MM-MSC+BTZ；⑤SP+MM-MSC+BTZ+α-GA。所有實(shí)驗(yàn)組BTZ 及α-GA 的終濃度分別為20 nmol/L 和25 mmol/L，培養(yǎng)24 h 后收集細(xì)胞，F(xiàn)CM 檢測細(xì)胞凋亡，實(shí)驗(yàn)設(shè)5 復(fù)孔。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用Graphpad Prism 5.0 統(tǒng)計(jì)處理軟件分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間分析采用t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MM 患者M(jìn)SCs 的形態(tài)學(xué)變化及Cx43 表達(dá)

分離培養(yǎng)獲得MM-MSCs 及ND-MSCs，表面抗原提示兩者均為高表達(dá)CD73（98.0%）、CD44（100%）、CD90（99.8%）和CD105（100%），基本不表達(dá)CD34（0.3%）、HLA-DR（0.2%），細(xì)胞形態(tài)兩者無明顯差異。見表2 和圖1。

圖1 BM-MSCs 細(xì)胞表面抗原表達(dá)R

表2 BM-MSCs 細(xì)胞表面抗原分析

蛋白印跡試驗(yàn)證實(shí)SP 細(xì)胞僅表達(dá)極少量的Cx43 分子，而RPMI 8 226 細(xì)胞則表達(dá)較高水平的Cx43，兩者具有顯著性差異（P＜0.001）；MM-MSCs 較ND-MSCs 表達(dá)Cx43 明顯較多，但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；SP 細(xì)胞與MM-MSCs 共培養(yǎng)后，其Cx43表達(dá)均有顯著上調(diào)（P＜0.001）；阻斷GJ 后，SP 細(xì)胞的Cx43 表達(dá)則呈現(xiàn)明顯下調(diào)（P＜0.001），詳見圖2。

圖2 蛋白印跡分析不同細(xì)胞Cx43 的表達(dá)***P＜0.001，與SP 組比較；###P＜0.001，與SP+MM-MSCs+GA 組比較

2.2 不同來源MM 細(xì)胞SP 細(xì)胞分離

本研究對6 例MM 患者的原代細(xì)胞及4 種MM 細(xì)胞株的檢測提示，采用Hoechst 33342 染色后應(yīng)用FCM 技術(shù)可將MM 細(xì)胞分為2 群，即主群細(xì)胞（MP）和側(cè)群細(xì)胞（SP）[6]。所有MM 細(xì)胞均存在不同比例的SP 細(xì)胞。MM 細(xì)胞株中SP 細(xì)胞含量分別為1.783 %、0.825 6 %、0.082 %、0.177 %，而原代細(xì)胞不具備可重復(fù)性，鑒于RPMI 8266 細(xì)胞中SP 細(xì)胞含量較多，且穩(wěn)定，此后實(shí)驗(yàn)采用的SP 細(xì)胞均來自RPMI8226，詳見圖3。

圖3 不同MM 細(xì)胞株的SP 流式術(shù)分選

2.3 MM-MSCs 對SP 細(xì)胞周期的作用

結(jié)果分析提示SP 亞群中處G0 期細(xì)胞比例顯著高于MP 亞群，分別為(44.34±1.7) %和(28.49±1.1) % ，提示SP 亞群中包含更多處靜止期的MM細(xì)胞。與MM-MSCs 共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)MM-MSCs 具有促進(jìn)SP 亞群細(xì)胞進(jìn)入G0 期的作用，其G0 期細(xì)胞達(dá)(82.6±0.1) % (P＜0.001)，而加入間隙連接抑制劑α-GA 后，MM-MSCs 對SP 亞群的這一作用減弱，細(xì)胞進(jìn)入增殖周期者增多，G0 期細(xì)胞降至(63.42±3.86) % (P＜0.01)，詳見圖4。

圖4 MM-MSCs 對SP 細(xì)胞周期的作用

2.4 SP 細(xì)胞具有更強(qiáng)的體外集落形成能力

我們利用克隆形成實(shí)驗(yàn)分析SP 細(xì)胞體外形成集落的能力，SP 細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)、與ND-MSCs 共培養(yǎng)、與MM-MSCs 共培養(yǎng)、與ND-MSCs 共培養(yǎng)體系中加入通道阻斷劑，與MM-MSCs 共培養(yǎng)體系中加入通道阻斷劑后單克隆直徑、克隆形成數(shù)、克隆形成率見表3。結(jié)果顯示出與MM-MSCs 共培養(yǎng)的SP 細(xì)胞有更強(qiáng)的克隆形成能力。加入通道阻斷劑后克隆形成能力均表現(xiàn)出一定程度的下降，單細(xì)胞克隆直徑減小，克隆形成率降低，見圖5。

圖5 ND-NSCs 及MM-MSCs 對SP 細(xì)胞的體外集落形成的影響

表3 不同培養(yǎng)體系加入阻斷劑前后克隆形成能力

2.5 加入GJ 阻斷劑對BM-MSCs 及MM 細(xì)胞因子分泌水平的影響

CBA 分析顯示，MM-MSCs 單獨(dú)培養(yǎng)24 h 后，其培養(yǎng)上清中存在高水平的IL-6，較低水平的TGF-β、bFGF 和IL-17，基本無IL-10 分泌；RPMI 8266 細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后上清中可以測得較低水平的TGF-β 及少量bFGF、IL-17、IL-6 及IL-10；共培養(yǎng)24 h 后，其上清中IL-6、IL-10 和TGF-β 水平較前明顯升高（P＜0.05），尤其是IL-6 和IL-10 水平較單獨(dú)培養(yǎng)時顯著升高（P＜0.01），bFGF 和IL-17 共培養(yǎng)前后則無明顯變化；加入GJ 阻斷劑后，細(xì)胞因子IL-6、IL-10 和TGF-β 的分泌有所降低（P＜0.05），見圖6。

圖6 培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子變化

2.6 GJ 對SP 細(xì)胞干細(xì)胞相關(guān)基因的影響

RT-PCR 檢測發(fā)現(xiàn)RPMI8266 存在一定量cmyc、KIF4、SOX2 和Oct-4 基因表達(dá)，但SP 細(xì)胞亞群中該類基因表達(dá)明顯上調(diào)，兩者具有顯著性差異(P＜0.05)，將SP 細(xì)胞與MM-MSC 共培養(yǎng)后，可觀察到c-myc、KIF4 和SOX2 基因表達(dá)的顯著上調(diào)(P＜0.001)，而Oct-4 基因表達(dá)下調(diào)，加入GJ 阻斷劑后，原上調(diào)的基因均有不同程度下調(diào)，但無明顯區(qū)別(P＞0.05)，見圖7。

圖7 RT-PCR 分析SP 細(xì)胞干細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)

2.7 加入GJ 阻斷劑對硼替佐米誘導(dǎo)凋亡的影響

體 外PI/Annexin V 檢 測 顯 示，RPMI 8226 的MP 細(xì)胞對BTZ 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡敏感，而對SP 細(xì)胞敏感性較差，其凋亡率分別為(66.8±0.77)%和(25.9±0.86)%，P＜0.001。與MM-MSCs 直接共培養(yǎng)后，BTZ 誘導(dǎo)的凋亡作用較單獨(dú)培養(yǎng)明顯減弱(P＜0.05)，MM-MSCs 具 有 一 定 保 護(hù) 作 用，加 入GJ 阻斷劑后，可部分恢復(fù)MM 細(xì)胞對硼替佐米的敏感性，證實(shí)MM-MSCs 可保護(hù)骨髓瘤細(xì)胞免受抗腫瘤藥物影響，而GJIC 在其中可能起到一定作用，見圖8。

圖8 GJ 在硼替佐咪誘導(dǎo)的MM 細(xì)胞凋亡中的作用

3 討論

MM 是一種惡性漿細(xì)胞疾病，以腫瘤細(xì)胞與骨髓微環(huán)境中基質(zhì)細(xì)胞的復(fù)雜的相互作用網(wǎng)絡(luò)為特征，骨髓基質(zhì)細(xì)胞可促進(jìn)MM 細(xì)胞的生存、增殖和藥物抗性。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是骨髓基質(zhì)細(xì)胞中最主要的干細(xì)胞群體，能夠分化成多種細(xì)胞系，包括成纖維細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞。MSCs 可以遷移到原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移部位，這意味著這些細(xì)胞可能調(diào)節(jié)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。MSCs 在與MM 細(xì)胞相互黏附及作用過程中部分細(xì)胞特性發(fā)生改變，成為腫瘤相關(guān)BMSCs，即MM-MSCs，MM 患者來源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞顯示出功能異常，說明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在骨髓瘤的發(fā)生、發(fā)展中不是旁觀者，它還可分泌多種細(xì)胞因子影響MM細(xì)胞的生長、生存、耐藥、遷移，在疾病的發(fā)生、發(fā)展中起了重要的作用，目前成為治療多發(fā)性骨髓瘤的新的研究熱點(diǎn)[7-8]。

盡管近幾年MM 的治療取得了長足的進(jìn)步，但目前它仍然是不可治愈的，有證據(jù)表明MM 細(xì)胞之間存在異質(zhì)性，尤其是可能存在MM 干細(xì)胞亞群，它具有自我更新及原發(fā)耐藥特性，可能是MM 增殖、維持MM 表型及導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)的原因，但其耐藥性的機(jī)制還沒有得到充分的了解[5,9]。理想的多發(fā)性骨髓瘤干細(xì)胞(MMSCs)的鑒定應(yīng)依賴于MMSCs 的表型，但至今MMSCs 的表型尚未得到正確的定義。Goodell 等通過FCM 在MM 細(xì)胞中分離出具有干細(xì)胞特性的SP 細(xì)胞，為拓展腫瘤干細(xì)胞的研究提供了思路。目前，SP 細(xì)胞和ALDH1+已經(jīng)被用來鑒定MMSCs。MMSCs 與骨髓微環(huán)境的復(fù)雜的相互作用維持著MMSCs 的自我更新和生存。然而, MMSCs 與周圍骨髓微環(huán)境相互作用的分子需要進(jìn)一步確認(rèn)。

在過去的幾年里，連接蛋白的異常表達(dá)，特別是Cx43 的異常表達(dá)已經(jīng)被證實(shí)與癌癥復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移性擴(kuò)散和不良預(yù)后相關(guān)。根據(jù)癌癥的不同分期和類型，Cx43 既可以作為腫瘤抑制因子，也可以作為癌基因、生物標(biāo)記物，我們需要更好地了解Cx43在腫瘤微環(huán)境中如何參與、影響腫瘤形成和進(jìn)展，從而開發(fā)基于Cx43 的臨床可行療法。Cx43 分子在細(xì)胞表面形成通道，可使小分子和一定量大分子物質(zhì)在細(xì)胞間轉(zhuǎn)移，這一特性使它們存在將化療藥物直接送入腫瘤細(xì)胞內(nèi)的潛力，從而成為腫瘤治療新的非常有吸引力的靶點(diǎn)。

為明確MM-MSCs 與SP 細(xì)胞的相互作用，首先我們采用Hoechst33342 標(biāo)記FCM 術(shù)檢測骨髓瘤細(xì)胞株及新鮮MM 標(biāo)本，結(jié)果證實(shí)所有檢測樣本中均存在SP 細(xì)胞亞群，4 種 MM 細(xì)胞株檢測SP 細(xì)胞含量分別為1.783 %、0.825 6 %、0.082 %、0.177 %，并成功分選SP 細(xì)胞比例最高的PRMI8226 細(xì)胞株的SP 細(xì)胞。在此基礎(chǔ)上，通過對SP 亞群細(xì)胞的多種干細(xì)胞相關(guān)基因如c-myc、KIF4、SOX2 和Oct-4表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)其與RPMI 8 226 細(xì)胞有明顯不同。直接與MM-MSCs 共培養(yǎng)后SP 細(xì)胞亞群cmyc、KIF4 和SOX2 基因表達(dá)顯著上調(diào) (P＜0.001)，而Oct-4 基因表達(dá)下調(diào)，加入GJIC 阻斷劑后，cmyc、KIF4 和SOX2 基因表達(dá)盡管有所下調(diào)，但并無顯著性差異。對于細(xì)胞周期的分析也證實(shí)SP 細(xì)胞亞群中處G0 期細(xì)胞比例顯著高于MP 亞群，分別為(44.34±1.7)%和(28.49±1.1)% ，提示SP 細(xì)胞亞群中包含較多處靜止期MM 細(xì)胞，推測與該群細(xì)胞化療敏感性差可能有關(guān)。共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)MMMSCs 有促進(jìn)SP 亞群細(xì)胞進(jìn)入G0 期的作用(P＜0.001)，其G0 期細(xì)胞達(dá)(82.6±0.1)%，而加入間隙連接抑制劑α-GA 后，這一作用減弱，細(xì)胞進(jìn)入周期者增多，G0 期細(xì)胞為(63.42±3.86)%。體外集落形成試驗(yàn)證實(shí)從MM 細(xì)胞分離的SP 細(xì)胞本身具有較強(qiáng)的集落形成能力，但在MM-MSCs 存在的前提下其細(xì)胞形成的體外集落細(xì)胞數(shù)更多，胞體較大且細(xì)胞折光性強(qiáng)，提示細(xì)胞活力較好，培養(yǎng)體系中加入GJ 阻斷劑后體外集落形成能力均現(xiàn)出一定程度的下降，克隆形成率降低，單細(xì)胞克隆直徑減小。

前期我們的研究證實(shí)MM-MSCs 與MM 細(xì)胞可形成功能性GJIC，并在多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)病中扮演重要角色[2-3,10]，為進(jìn)一步觀察間充質(zhì)干細(xì)胞中連接蛋白Cx43 組成的細(xì)胞間隙連接在多發(fā)性骨髓瘤SP 細(xì)胞生存及耐藥中的作用，我們通過蛋白印跡試驗(yàn)證實(shí)除SP 細(xì)胞基本無Cx43 表達(dá)外，NDMSCs 和MM-MSCs、MM 細(xì)胞株及初診患者M(jìn)M細(xì)胞均表達(dá)Cx43 分子，與SP 細(xì)胞相比差別顯著（P＜0.001）。SP 細(xì)胞與MM-MSCs 共培養(yǎng)后，其Cx43 分子表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.001），加入α-GA 可部分下調(diào)SP 細(xì)胞的Cx43 表達(dá)（P＜0.001）。采用CBA 技術(shù)檢測共培養(yǎng)前后培養(yǎng)液中細(xì)胞因子變化，發(fā)現(xiàn)在直接共培養(yǎng)時MM-MSCs 細(xì)胞因子分泌譜發(fā)生變化，在原有高水平IL-6 的基礎(chǔ)上，IL-10 和TGFβ 水平較前明顯增加（P＜0.05），尤其是IL-6 和IL-10 較單獨(dú)培養(yǎng)時顯著增加（P＜0.01），bFGF 和IL-17 在共培養(yǎng)前后水平無明顯變化，采用α-GA 阻斷MM-MSCs 與SP 細(xì)胞間的GJIC 后，細(xì)胞因子IL-6、IL-10 和TGF-β 的分泌能力下調(diào)（P＜0.05）。綜上，我們認(rèn)為MM-MSCs 通過多種途徑影響SP 細(xì)胞的生物學(xué)特性，增加其干細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)、增加靜止期細(xì)胞比例、增強(qiáng)其體外集落形成能力、改變細(xì)胞因子分泌，而在這一過程中Cx43 分子的表達(dá)及其形成的GJIC 具有重要作用。

蛋白酶體抑制劑BTZ 是MM 治療的一線藥物，盡管BTZ 較目前其他化療藥物更為有效，但原發(fā)性或獲得性耐藥仍是限制其療效的主要原因，目前對于蛋白酶體抑制劑耐藥的機(jī)制仍未闡明。本研究發(fā)現(xiàn)盡管MP 和SP 細(xì)胞均對BTZ 敏感，但SP 細(xì)胞敏感性較差，可能與其本身極低表達(dá)Cx43 部分相關(guān)，其凋亡細(xì)胞分別為(66.8±0.77)%和(25.9±0.86)%，P＜0.001，經(jīng)與MM-MSCs 直接共培養(yǎng)后，BTZ 誘導(dǎo)的凋亡作用明顯減弱(P＜0.05)，MM-MSCs 具有保護(hù)作用，而在共培養(yǎng)體系中加入α-GA，可部分恢復(fù)MM 細(xì)胞對硼替佐咪的敏感性，由此證實(shí)MM-MSCs 促進(jìn)MM SP 細(xì)胞的生存，保護(hù)MM SP 細(xì)胞免受抗腫瘤藥物影響，GJIC 在其中起到一定作用。我們前期實(shí)驗(yàn)提示，過表達(dá)MM 細(xì)胞的Cx43 可提高M(jìn)M 細(xì)胞化療敏感性，但與MSCs 共培養(yǎng)后敏感性降低，腫瘤細(xì)胞本身Cx43 半通道有可能通過增加癌細(xì)胞對化療藥物的通透性來降低耐藥性,但與微環(huán)境中MSCs 相互作用后這一作用產(chǎn)生變化，但具體機(jī)制仍在進(jìn)一步研究中。

本研究發(fā)現(xiàn)Cx43 及其組成的GJIC 不但影響MM 細(xì)胞的遷移，而且也影響惡性漿細(xì)胞的藥物敏感性，證實(shí)骨髓微環(huán)境中Cx43 及其組成的GJIC 在MM 發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用，在細(xì)胞因子分泌、腫瘤生長、細(xì)胞周期變化、基因表達(dá)等多個環(huán)節(jié)中影響MM 細(xì)胞的生物學(xué)行為，基于我們及其他相關(guān)研究結(jié)果，我們證實(shí)MM 細(xì)胞與MM-MSCs、造血細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)通過粘附GJIC介導(dǎo)耐藥，阻斷腫瘤細(xì)胞與微環(huán)境的GJIC 將有助于提高抗腫瘤效益。