董雅芬，王 建，李 莉，李姝姝，劉河龍，邱 彥 （上海市浦東新區(qū)人民醫(yī)院, 上海 201200）

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人民生活水平的提高，糖尿病的患病率仍在逐年上升，血管并發(fā)癥是導(dǎo)致患者殘疾和死亡的主要原因，并給社會和經(jīng)濟(jì)的發(fā)展帶來了沉重負(fù)擔(dān)。內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells, EPCs)在各種因素刺激下，從骨髓動員到外周血，參與損傷內(nèi)皮的修復(fù)，在血管新生中具有重要作用[1-3]。但是高血糖會導(dǎo)致EPCs 數(shù)量減少及功能受損[4-5]。研究表明，雌激素降低是心血管疾病發(fā)病的危險因素。因此，本實驗通過研究雌激素對糖尿病大鼠EPCs 功能的改善作用并探討可能的作用機(jī)制，為探討糖尿病血管并發(fā)癥提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF 級 Wistar 大鼠，雄性，體重（180±10）g（上海斯萊克實驗動物有限公司）。實驗期間，保持動物房室溫在22 ℃左右，相對濕度70%左右，早8 點至晚8 點自動照明。動物自由進(jìn)食，自由飲水，所有實驗動物均符合實驗動物倫理學(xué)要求。

1.2 藥物與主要試劑

雌激素（Abcam 公司）；鏈脲佐菌素（Sigma aldrich 公司）；FITC 標(biāo)記的荊豆凝集素I(FITCUAE-I)（美國Sigma 公司）；Dil 標(biāo)記的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-ac-LDL)（Molecular Probe 公司）；甲醛溶液（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；基質(zhì)膠（matrigel）（Thermo Fisher 公司）；EGM-2 培養(yǎng)基（LON-ZA 公司）；CCK-8 試劑盒（日本Dojindo 公司）；NO 檢測試劑盒（美國Abcam 公司）。

2 方法

2.1 動物模型的制備

Wistar 雄性大鼠，10～12 周，適應(yīng)性地喂養(yǎng)1 周后，連續(xù)7 d 空腹腹腔注射新鮮配制的鏈脲佐菌素（streptozotocin, STZ）55 mg/（kg·d），對照組大鼠腹腔注射等體積枸櫞酸鈉緩沖液。7 d 后測空腹血糖(禁食12 h)，將血糖值為13.5～25 mmol/L 的大鼠作為糖尿病大鼠進(jìn)行實驗。注射STZ 后，每周稱體重，觀察體重變化。大鼠給藥、飼養(yǎng)過程中勤換墊料，勤補(bǔ)水。

2.2 大鼠骨髓來源EPCs 的分離培養(yǎng)

大鼠麻醉后處死，將大鼠整體置于75%乙醇浸泡10 min。取出大鼠，使用吸水紙吸干動物身上水分后轉(zhuǎn)移至超凈工作臺，剝離脛骨，使用無菌剪刀減去骨頭兩端，使用1ml PBS 通過注射器沖洗骨髓并將沖洗液轉(zhuǎn)移至15 ml 無菌離心管，沖洗過程重復(fù)操作3 次。用密度梯度離心法獲取單核細(xì)胞，將單核細(xì)胞重懸于培養(yǎng)基EGM-2 并調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106個/ml，接種于預(yù)先包被好纖維連接蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)皿，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱37 ℃和5%CO2條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)3 d 后洗去未貼壁細(xì)胞，以后每3 d換培養(yǎng)液培養(yǎng)至7 d。PBS 洗去未貼壁細(xì)胞，貼壁細(xì)胞供實驗用。

2.3 大鼠骨髓來源EPCs 的鑒定

培養(yǎng)7 d 的EPCs 用0.25%胰蛋白酶消化后收集于15 ml 離心管中，將細(xì)胞用PBS 1000r/min 離心5 min，清洗3 次。用PBS 100 μl 重懸細(xì)胞，每管加入CD34 和CD133 抗體各2 μl，4 ℃避光孵育30 min 后用PBS 清洗離心，將細(xì)胞重懸于300 μl PBS 中避光保存待上機(jī)檢測；同時將消化的細(xì)胞采用DiI-Ac-LDL 和FITC-UAE-I 雙染，倒置熒光顯微鏡觀察染色結(jié)果，雙染色陽性細(xì)胞為正在分化的EPCs。

2.4 實驗分組

實驗分3 組：①對照組；②糖尿病組：M199 培養(yǎng)基；③雌激素組：含雌激素10 nmol/L 的M199 培養(yǎng)基。在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h 后進(jìn)行實驗。

2.5 大鼠骨髓來源EPCs 功能測定[6-7]

2.5.1 細(xì)胞遷移實驗

3 組EPCs 用0.25%胰酶消化，將細(xì)胞重懸于EBM-2 培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個/ml，并取100 μl 接種于Transwell 上室，在下室中加入600 μl 含50 ng/ml 血管內(nèi)皮生長因子的EGM-2 培養(yǎng)基。37 ℃、5% CO2孵育24 h 后，取出上室，用棉球輕輕擦拭上室底部膜內(nèi)上表面的細(xì)胞，下室上表面用甲醛室溫固定20 min，于37 ℃用0.1%結(jié)晶紫染色30 min，用PBS 多次沖洗晾干后在160 倍光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照，隨機(jī)選取5 個視野計算遷移細(xì)胞數(shù)并計算平均值。

2.5.2 EPCs 小管形成實驗

在冰上將48 孔板預(yù)冷，然后加入150 μl 的基質(zhì)膠Matrigel，放置于37 ℃孵育30 min。3 組EPCs 用0.25%胰酶消化，將5×104個細(xì)胞接種于Matrigel 上，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h后，于160 倍光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照，隨機(jī)選取5 個視野計算形成小管的數(shù)目并計算平均值。

2.6 骨髓來源EPCs 中NO 水平的測定

3 組EPCs 用0.25%胰酶消化，經(jīng)PBS 清洗2 次，制成細(xì)胞懸液，采用NO 檢測試劑盒測定EPCs中NO 的水平。按照說明書的操作方法，完成后置于酶標(biāo)儀在540 nm 波長處測定吸光度（A）。

2.7 EPCs 增殖能力的測定

3 組EPCs 用0.25%胰酶消化，將100 μl 細(xì)胞懸液接種于96 孔培養(yǎng)板中并置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。每孔加入CCK-8 溶液10 μl 培養(yǎng)4 h，置于酶標(biāo)儀于450 nm 處測A值。

2.8 Western blotting 測定EPCs 中MnSOD 水平

收集3 組EPCs 并提取蛋白，應(yīng)用BCA 法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。蛋白樣本經(jīng)煮沸變性、SDS-PAGE電泳后加入兔抗人錳超氧化物歧化酶（MnSOD）和肌動蛋白（β-actin）多克隆抗體(1∶1 500 稀釋)，蛋白質(zhì)濕法轉(zhuǎn)移至硝基纖維素膜，羊抗兔二抗(1∶2000 稀釋)室溫孵育2 h，用ECL 化學(xué)發(fā)光法顯色，Image J 凝膠成像分析系統(tǒng)掃描成像，測定目標(biāo)條帶的A值，以β-actin 為內(nèi)參比較同一條帶與β-actin 的灰度值進(jìn)行分析。

2.9 ELISA 檢測EPCs 上清液中TSP-1 蛋白水平

收集3 組EPCs 上清液，按照說明書步驟進(jìn)行操作。取各組細(xì)胞上清液各100 μl 加入酶標(biāo)板中37 ℃孵育90 min，然后加入100 μl 生物素標(biāo)記抗體工作液37 ℃孵育60 min。洗滌3 次，加入100 μl酶結(jié)合物工作液在37 ℃孵育30 min 后，洗滌5 次。加入90 μl 底物溶液37 ℃孵育15 min，最后加入終止液50 μl 后，立即在450 nm 波長處測量A值。

2.10 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)以（ x±s）表示，采用GraghPad Prism軟件進(jìn)行統(tǒng)計處理，采用單因素方差分析(Oneway ANOVA)檢驗差異的顯著性。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 各組大鼠體重和血糖的變化

正常組大鼠，精神狀態(tài)良好，動作自如，反應(yīng)靈敏，毛發(fā)平伏有光澤。而糖尿病大鼠體重變輕，精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，毛雜亂無光澤，動作遲緩，弓背捲體，尿量顯著增加。在建模4 周后，糖尿病模型組空腹血糖值（23.33±3.61）mmol/L 明顯高于對照組（16.91±2.30）mmol/L，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01) (圖1A) 。對照組動物體重隨時間增加而增加，模型組在前3 周隨時間緩慢增加，但最后1 周出現(xiàn)體重下降趨勢。在第3、4 周，兩組動物體重有顯著差異(P＜0.01) (圖1B) 。

圖1 STZ 誘導(dǎo)后Wistar 大鼠血糖及體重變化

3.2 大鼠骨髓來源EPCs 的分離培養(yǎng)和鑒定

以EGM-2 培養(yǎng)基定向誘導(dǎo)培養(yǎng)5 d 后，鏡下觀察可見貼壁細(xì)胞形態(tài)由圓形逐漸向梭形轉(zhuǎn)化（圖2A）。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，CD34 與CD133 雙陽性細(xì)胞占比不小于總細(xì)胞數(shù)的85.63%（圖2B）。采用Dil-Ac-LDL 和TITC-UEA-1 雙染細(xì)胞，顯示紅綠熒光雙陽性細(xì)胞占視野中細(xì)胞的絕大多數(shù)（圖2C）。上述結(jié)果表明，我們成功地制備了大鼠骨髓來源EPCs 細(xì)胞，且細(xì)胞具有較高純度。

圖2 大鼠骨髓來源的EPCs 分離培養(yǎng)和鑒定

3.3 雌激素孵育改善糖尿病大鼠EPCs 的增殖和功能

與對照組比較，糖尿病大鼠EPCs 的對數(shù)期增殖活性明顯降低(P＜0.01)，而雌激素孵育后其增殖活性明顯改善（P＜0.01）（圖3A）。與對照組比較，糖尿病大鼠EPCs 的小管形成功能明顯下降（P＜0.01），而雌激素能夠明顯改善其小管形成功能（P＜0.01）（圖3B）。細(xì)胞遷移實驗表明，與對照組比較，糖尿病大鼠EPCs 細(xì)胞遷移能力明顯受損（P＜0.01），而雌激素孵育能夠明顯改善受損的細(xì)胞遷移能力（P＜0.01）（圖3C）。

圖3 雌激素對糖尿病大鼠EPCs 增殖、小管形成功能及遷移能力的改善

3.4 雌激素孵育上調(diào)糖尿病EPCs 細(xì)胞內(nèi)NO 含量

糖尿病大鼠EPCs 細(xì)胞中NO 含量較對照組明顯降低(P＜0.05)，而雌激素孵育能夠明顯上調(diào)NO的含量(P＜0.01)（圖4A）。

3.5 雌激素孵育上調(diào)EPCs 細(xì)胞中MnSOD 的表達(dá)并下調(diào)上清液中TSP-1 的表達(dá)

糖尿病組大鼠EPCs 細(xì)胞上清液中TSP-1 含量明顯高于對照組(P＜0.01)，而給與雌激素孵育后細(xì)胞上清液中TSP-1 含量明顯降低(P＜0.05，圖4C）。Western blotting 檢測顯示，糖尿病組大鼠EPCs 中MnSOD 蛋白表達(dá)較對照組明顯降低(P＜0.01)，而雌激素孵育能夠明顯上調(diào)細(xì)胞中MnSOD 蛋白表達(dá)(P＜0.01)（圖4D）。

圖4 雌激素孵育增加EPCs 中NO 水平并下調(diào)EPCs 上清液中TSP-1 表達(dá)及上調(diào)MnSOD 的表達(dá)

4 討論

EPCs 主要來源于骨髓，在血管新生中具有重要作用。1997 年Asahara 等[1]首次將其命名為內(nèi)皮祖細(xì)胞，而后其在心血管方面的研究越來越多。EPCs 與心血管疾病存在密不可分的聯(lián)系。研究表明，EPCs 的數(shù)量和功能與高血壓、糖尿病、血脂等呈負(fù)相關(guān)[8-11]。此外，EPCs 在腦缺血、阿爾茨海默癥治療中表現(xiàn)出較好的療效[12-13]。故改善EPCs 功能及增加其數(shù)量可作為改善糖尿病血管并發(fā)癥的新靶點。并將能表達(dá)CD34、CD133 等干細(xì)胞特征或血管內(nèi)皮生長因子受體2 (VEGFR2)等細(xì)胞標(biāo)志物定義為EPCs[14]。用密度梯度離心法獲取骨髓單核細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)并采用流式細(xì)胞術(shù)和熒光顯微鏡法對細(xì)胞進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明本實驗成功制備大鼠骨髓來源EPCs 細(xì)胞，且細(xì)胞具有較高純度。

流行病學(xué)提示雌激素為心腦血管疾病的保護(hù)因素。絕經(jīng)后女性卒中發(fā)生風(fēng)險明顯高于絕經(jīng)前女性[15]。美國的調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，年齡在18～39 歲的成年男性發(fā)生高血壓的風(fēng)險高于同齡女性，但是在年齡大于60 歲成人中男性風(fēng)險低于女性[16]。不同性別發(fā)生高血壓及靶器官損傷的差異與雌激素相關(guān)[17]。此外，楊瑩瑩[18]等的研究表明雌激素對急性期高血壓腦出血患者的EPCs 功能有改善作用且與雌激素濃度呈正相關(guān)。但是雌激素對糖尿病EPCs 功能改善作用及相關(guān)機(jī)制的研究較少。

本實驗采用腹腔注射鏈脲佐菌素制作大鼠糖尿病模型，提取其骨髓來源的EPCs 進(jìn)行實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠骨髓EPC 的增殖能力較正常EPCs 明顯下降，而雌激素體外孵育能明顯促進(jìn)其增殖活力；除增殖活力受到抑制外，糖尿病大鼠EPCs 的遷移能力和小管形成功能也明顯受損，而在體外給予雌激素10 nmol/L 孵育后細(xì)胞功能得到明顯改善。說明雌激素能促進(jìn)糖尿病大鼠EPCs 的增殖并改善其功能。

研究表明氧化應(yīng)激可導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷。MnSOD 是一種存在于線粒體并能清除機(jī)體新陳代謝中產(chǎn)生的過多的氧自由基（O2·-）等有害物質(zhì)的一種酶[19,]。MnSOD 在一定程度上能抵抗高糖所增加線粒體中的活性氧（ROS）細(xì)胞的傷害[20]。本實驗采用Western blotting 檢測EPCs 細(xì)胞中MnSOD蛋白表達(dá)，糖尿病組大鼠EPCs 細(xì)胞中MnSOD 蛋白表達(dá)明顯低于對照組，而給與雌激素體外孵育后能明顯上調(diào)細(xì)胞中MnSOD 蛋白表達(dá)，說明雌激素通過上調(diào)EPCs 中MnSOD 水平而改善細(xì)胞功能。

一氧化氮(NO)與血管健康密切相關(guān)。NO 通過促進(jìn)EPCs 向內(nèi)皮細(xì)胞分化進(jìn)而修復(fù)受傷的內(nèi)皮，而抑制內(nèi)源性NO 的合成對EPCs 的遷移能力有不良影響[21]。有文獻(xiàn)報道，高血糖通過增加活性氧積聚、降低一氧化氮生物利用度及抑制內(nèi)皮依賴性血管舒張功能，導(dǎo)致嚴(yán)重的血管內(nèi)皮功能障礙[22-23]。凝血酶敏感蛋白-1（TSP-1）屬細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白，其過表達(dá)能抑制EPCs 的功能[24]，而NO 含量降低能誘導(dǎo)TSP-1 的表達(dá)[25]。本實驗發(fā)現(xiàn)，糖尿病組大鼠EPCs 中NO 含量明顯降低而細(xì)胞上清中TSP-1含量明顯升高，雌激素處理能夠逆轉(zhuǎn)上述改變，說明雌激素通過增加EPC 內(nèi)NO 水平并降低TSP-1含量進(jìn)而改善糖尿病EPCs 功能。

綜上所述，本研究證實雌激素能改善受損的糖尿病大鼠EPCs 功能并促進(jìn)其增殖，作用機(jī)制可能與其降低細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激及下調(diào)TSP-1 的表達(dá)相關(guān)。本研究為將來進(jìn)一步進(jìn)行雌激素在糖尿病血管并發(fā)癥方面的研究提供了深入的實驗與理論依據(jù)。