李炳鋒，段雅倩，王 旭，郭美麗，高 越,1b （1. 海軍軍醫(yī)大學(xué)：a. 藥學(xué)院, b. 第一附屬醫(yī)院臨床研究中心, 上海 00433；. 中國(guó)人民解放軍63600 部隊(duì)醫(yī)院, 甘肅 酒泉 73750）

氧氣是生命活動(dòng)的基本物質(zhì)，在機(jī)體內(nèi)主要參與能量代謝過(guò)程。作為一種至關(guān)重要的生命物質(zhì)，氧氣在多個(gè)層面影響著機(jī)體，甚至可以通過(guò)多種渠道影響基因[1]。Kirmes 等的研究表明：在缺氧條件下，細(xì)胞在全基因組水平上會(huì)產(chǎn)生結(jié)構(gòu)變化，染色質(zhì)會(huì)發(fā)生聚集現(xiàn)象[2]。機(jī)體缺氧時(shí)，通過(guò)氧化呼吸鏈產(chǎn)生過(guò)多的活性氧簇（ROS），包括超氧陰離子、過(guò)氧化氫、羥自由基等。ROS 不僅可以直接損傷脂質(zhì)、蛋白質(zhì)及核酸等生物大分子，還可以通過(guò)Fas/FasL、TNF-α/TNFRl、MAPK 等信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[3-4]。目前，針對(duì)缺氧的防治，西藥主要有碳酸酐酶抑制劑、糖皮質(zhì)激素、茶堿等，中藥較為成熟的有藏藥紅景天，胡黃連、黃芪等也被認(rèn)為具有一定的抗缺氧損傷的能力[5]。乙酰唑胺作為FDA認(rèn)可的唯一一種防治急性缺氧的藥物，更多的是用來(lái)治療急性缺氧，且其存在過(guò)敏反應(yīng)、四肢麻木、疲勞、困倦等不良反應(yīng)，肝腎功能異常的人不宜使用[6-8]。藏藥紅景天目前已被高原邊防部隊(duì)作為防治高原缺氧的常規(guī)藥物。大部分學(xué)者認(rèn)為紅景天可以通過(guò)抑制氧化應(yīng)激、抗凋亡、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞等方式治療缺氧性損傷，但其主要活性成分的抗缺氧作用機(jī)制仍不清楚[9]。作為預(yù)防用藥，紅景天需要提前7～15 d 服用，才能較好起到提高抗缺氧能力的作用，療程較長(zhǎng)。目前，針對(duì)缺氧的治療仍以給予高濃度氧氣最為直接有效，而對(duì)于提高耐缺氧能力，目前尚無(wú)安全高效的藥物。

毛裂蜂斗菜（Petasites tricholobuson）是菊科蜂斗菜屬下的一種，在民間廣泛用于消腫止痛、解毒祛瘀，治跌打損傷、毒蛇咬傷等。課題組前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明，其醇提取物具有抗炎作用[10-12]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察PTB 對(duì)小鼠存活時(shí)間、血清乳酸脫氫酶（LDH）活性和丙二醛（MDA）含量變化，對(duì)腦組織與心臟超氧化物歧化酶（SOD）和還原型谷胱甘肽（GSH）活性變化、腦組織病理變化，以及對(duì)大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞（PC12）制成糖氧剝奪模型(OGD)后存活率的影響，進(jìn)一步探討PTB 的抗缺氧能力及可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與細(xì)胞株

昆明種小鼠110 只，雄性，SPF 級(jí)，體質(zhì)量23～25 g，合格證號(hào)：SCXK（京）2019-0010（斯貝福生物技術(shù)有限公司），飼養(yǎng)于清潔級(jí)動(dòng)物房，人工照明模擬晝夜變化；PC12 細(xì)胞（美國(guó)ATCC 細(xì)胞庫(kù)）。

1.2 藥物

蜂斗菜總內(nèi)酯（自提）：經(jīng)高效液相色譜（HPLC）檢測(cè)，蜂斗菜總內(nèi)酯含量為74.8%，其中，內(nèi)酯B、內(nèi)酯Ⅲa、內(nèi)酯Ⅳa 的含量分別為13.4%、46.8%、14.6%，各單體成分分子結(jié)構(gòu)式均已明確[13]；諾迪康膠囊（規(guī)格：0.28 g/粒，西藏諾迪康藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：200402）；0.9%氯化鈉溶液（500 ml，濟(jì)民健康管理股份有限公司，批號(hào)：S200516E52）；LDH 試劑盒、GSH 試劑盒、總蛋白定量測(cè)試盒、MDA 試劑盒、SOD 測(cè)試盒（南京建成生物工程研究所），規(guī)格：96T，批號(hào)：20210914、20211012、20210603、 20211012、 20211012； MTT（ 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide）（美國(guó)Sigma 公司）；高糖DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清（美國(guó)Hyclone 公司）；混合氣體（95%N2，5%CO2）（上海成功氣體工業(yè)有限公司）；CO2氣體（海軍軍醫(yī)大學(xué)熱衛(wèi)系）。

1.3 儀器

全自動(dòng)酶標(biāo)儀、1 300 SERIES A2 型超凈臺(tái)（美國(guó)Thermo 科技公司）；SHIMADZU LC-20 高效液相色譜儀（島津有限公司）；Pico17 高速離心機(jī)（ThermoFisher 科技公司）；L-420 低速離心機(jī)（湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；Tissuelyser-48 多樣品組織研磨機(jī)（上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司）；DHG.9.23A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；DK-8D 型電熱恒溫水槽（上海一恒科技有限公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 分組及給藥

小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，常規(guī)進(jìn)食，自由飲水。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用隨機(jī)數(shù)字法將小鼠分為空白對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組（諾迪康280 mg/kg）、PTB 低劑量組（20 mg/kg）、PTB 中劑量組（40 mg/kg）、PTB 高劑量組（80 mg/kg），其中空白對(duì)照組10 只小鼠，其余各組20 只小鼠。適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d 后，按照小鼠質(zhì)量10 ml/kg 灌胃給藥，連續(xù)給藥3 d，空白對(duì)照組和模型組給予等體積的溶劑CMC-Na。本實(shí)驗(yàn)過(guò)程遵守動(dòng)物福利、動(dòng)物保護(hù)和倫理原則及相關(guān)規(guī)定。

1.4.2 常壓缺氧實(shí)驗(yàn)

第3 天給藥1 h 后，除空白對(duì)照組外，取其余每組小鼠各10 只分別置于125 ml 磨口廣口瓶中（瓶?jī)?nèi)放置5 g 鈉石灰，用于吸附CO2），瓶口涂抹凡士林保證絕對(duì)密封，自蓋上瓶蓋開(kāi)始計(jì)時(shí)，以小鼠呼吸心跳停止為小鼠窒息死亡判定依據(jù)，記錄并統(tǒng)計(jì)各組小鼠死亡時(shí)間。

1.4.3 取材

根據(jù)小鼠常壓密閉缺氧實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將小鼠最短死亡時(shí)間（12 min）設(shè)為時(shí)間節(jié)點(diǎn)。除空白對(duì)照組外，將其余5 組剩余小鼠分別置于125 ml 磨口廣口瓶中（瓶?jī)?nèi)放置5 g 鈉石灰，用于吸附CO2），瓶口涂抹凡士林保證絕對(duì)密封。自蓋上瓶蓋開(kāi)始計(jì)時(shí)，到達(dá)時(shí)間節(jié)點(diǎn)后立即將小鼠取出，眼眶取血，血液樣品放置于冰盒中保存?？瞻讓?duì)照組于常壓未缺氧條件下直接眼眶取血。各組小鼠眼眶取血后，立即脫頸處死，解剖并小心分離出腦組織，于冰盤上快速分離出右側(cè)大腦半球，置4%多聚甲醛固定液中。左側(cè)大腦半球保存在清潔干燥離心管中。腦組織固定后，解剖分離出小鼠心臟，用生理鹽水充分灌洗后，用清潔濾紙吸干。所有樣品均放置于液氮中臨時(shí)保存。

1.4.4 腦組織病理染色

將各組小鼠右側(cè)大腦半球切片制作成石蠟切片，分別通過(guò)脫蠟、染色、分化、封片等步驟，進(jìn)行HE 和尼氏染色。染色切片制作完成后進(jìn)行顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。

1.4.5 生化指標(biāo)檢測(cè)

將取得的血液樣品進(jìn)行離心處理（4 000 r/min，10 min），取上清液進(jìn)行LDH 活性、MDA 含量的測(cè)定。將取得的心臟、左側(cè)大腦半球稱重，按照組織與生理鹽水1∶9 的比例，低溫條件下制成10%的組織勻漿，進(jìn)行SOD、GSH 活性的測(cè)定。MDA 含量、LDH 活性、SOD 活性、GSH 活性的檢測(cè)按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.5 體外實(shí)驗(yàn)

1.5.1 大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞（PC12 細(xì)胞）的培養(yǎng)

將PC12 細(xì)胞置于CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)（95%空氣和5%CO2，37 ℃，飽和濕度），培養(yǎng)基由90%高糖DMEM 和10%胎牛血清（FBS）組成，每3 d 更換新的培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞的生長(zhǎng)達(dá)到80%～90%匯合度時(shí)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。細(xì)胞傳代時(shí)，先棄去培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗2 次，加入不含EDTA 的胰酶消化細(xì)胞，按照1:4 的比例進(jìn)行傳代分瓶培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)穩(wěn)定處于對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)時(shí)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5.2 藥物配制

稱取適量蜂斗菜總內(nèi)酯，加入無(wú)糖培養(yǎng)基配制成2000 ng/ml 的溶液。按照比例，用無(wú)糖培養(yǎng)基將液體分別稀釋為200 ng/ml 和20 ng/ml 的溶液。

1.5.3 PC12 細(xì)胞氧糖剝奪模型（OGD）的建立及藥物處理

待鋪于細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)的細(xì)胞匯合度達(dá)到80%且生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，將原有培養(yǎng)基棄去，PBS 沖洗2 次后，模型組加入無(wú)糖培養(yǎng)基，給藥組加入含有不同濃度PTB（20 、200、2000 ng/ml）的無(wú)糖培養(yǎng)基，置于缺氧裝置（95% N2，5% CO2）內(nèi)缺氧2 h 后，將該裝置移入37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育12 h形成OGD 模型?？瞻讓?duì)照組照常更換培養(yǎng)基一次，在正常細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境下培養(yǎng)。

1.5.4 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞存活率

將狀態(tài)良好的細(xì)胞以5×104個(gè)/ml 的密度鋪于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，MTT 法檢測(cè)細(xì)胞存活率。MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)開(kāi)始時(shí)，在各細(xì)胞培養(yǎng)孔中加入20 μl MTT 溶液(5 mg/ml, 即0.5%MTT)，繼續(xù)在37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h。棄細(xì)胞上清液，每個(gè)細(xì)胞孔加入150 μl DMSO 溶液，搖床上低速震蕩10 min，使沉積在細(xì)胞內(nèi)的結(jié)晶充分溶解。在酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)量各孔的吸光值（A值）。根據(jù)各組所得的A值，計(jì)算細(xì)胞的存活率，其中，未經(jīng)OGD 處理的空白組細(xì)胞的存活率均一化為100%，其余各組細(xì)胞的存活率是相對(duì)于空白組比值的百分比。細(xì)胞的存活率=（A值實(shí)驗(yàn)組/A值空白組）×100%。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS21.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件處理。計(jì)量資料數(shù)據(jù)以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，當(dāng)P＜0.05 時(shí)，表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PTB 對(duì)常壓缺氧小鼠存活時(shí)間的影響

常壓缺氧條件下，模型組小鼠的平均存活時(shí)間為859.5 s。與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組（諾迪康）小鼠的存活時(shí)間延長(zhǎng)了131.9 s（P＜0.05），PTB 低、中、高劑量均能顯著延長(zhǎng)小鼠的存活時(shí)間（P＜0.05，P＜0.01），結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 PTB 對(duì)常壓缺氧小鼠存活時(shí)間的影響(n=10， ±s)

表1 PTB 對(duì)常壓缺氧小鼠存活時(shí)間的影響(n=10， ±s)

*P＜0.05，**P＜0.01，與模型組比較。

組別 給藥劑量（mg/kg） 存活時(shí)間（t/s）模型組 - 859.5±84.56諾迪康組 280 991.4±140.7*PTB低劑量組 20 1 023±142.7**PTB中劑量組 40 980±120.5*PTB高劑量組 80 1 055±251.9*

2.2 PTB 對(duì)常壓缺氧小鼠血清LDH 活力、MDA含量的影響

與空白對(duì)照組相比，模型組的LDH 活力明顯增高（P＜0.01）；與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組（諾迪康）、PTB 中、高劑量組LDH 活力降低至空白組水平（P＜0.05）；低劑量組的LDH 活力較模型組有所降低，但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），見(jiàn)表2。

與空白對(duì)照組相比，模型組的MDA 含量顯著增高（P＜0.01）；與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組（諾迪康）、PTB 低、中劑量組MDA 含量降低（P＜0.05）；PTB 高劑量組MDA 含量有所降低，但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），見(jiàn)表2。

表2 PTB 對(duì)常壓缺氧小鼠血清LDH 活力和MDA 含量的影響(n=10， ±s)

表2 PTB 對(duì)常壓缺氧小鼠血清LDH 活力和MDA 含量的影響(n=10， ±s)

*P＜0.05，與模型組比較；##P＜0.01，與空白組比較。

組別 給藥劑量（mg/kg） LDH（U/L） MDA（nmol/ml）空白組 - 1 052±59.49 67.04±12.63模型組 - 1 280±206.6## 204.3±58.42##諾迪康組 280 1 092±70.16＊ 132.5±54.02＊PTB低劑量組 20 1 153±82.80 138.3±32.50＊PTB中劑量組 40 1 097±100.5＊ 152.8±48.90＊PTB高劑量組 80 1 059±187.8＊ 172.7±60.54

2.3 PTB 對(duì)常壓缺氧小鼠腦組織、心臟的GSH活力的影響

在腦組織中，與空白對(duì)照組相比，模型組的GSH 活力降低（P＜0.01）；與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組（諾迪康）的GSH 活力有所升高，但是沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；與模型組相比，PTB 低、中、高3 個(gè)劑量組的GSH 活力均顯著升高（P＜0.01），見(jiàn)表3。

在心臟中，與空白對(duì)照組相比，模型組的GSH 活力降低（P＜0.05）；與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組（諾迪康）的GSH 活力升高（P＜0.05）；與模型組相比，PTB 低、中、高3 個(gè)劑量組的GSH 活力均顯著升高（P＜0.01），見(jiàn)表3。

表3 PTB 對(duì)常壓缺氧小鼠腦組織和心臟GSH 活力的影響(n=10， ±s)

表3 PTB 對(duì)常壓缺氧小鼠腦組織和心臟GSH 活力的影響(n=10， ±s)

*P＜0.05，**P＜0.01，與模型組比較；#P＜0.05，##P＜0.01，與空白組比較。

心臟GSH（μmol/g·prot）空白組 - 44.17±8.672 9.123±2.906模型組 - 31.99±5.528## 5.772±2.537#諾迪康組 280 37.47±13.56 8.345±2.336*低劑量組 20 43.38±10.46** 13.42±3.606**中劑量組 40 47.57±8.106** 12.07±4.191**高劑量組 80 50.36±17.18** 12.59±1.820**組別 給藥劑量（mg/kg）腦GSH（μmol/g·prot）

2.4 PTB 對(duì)常壓缺氧小鼠腦組織、心臟的SOD活力的影響

在腦組織中，與空白對(duì)照組相比，模型組的SOD 活力降低（P＜0.05）；與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組（諾迪康）的SOD 活力變化沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；與模型組相比，PTB 低、中、高3 個(gè)劑量組的SOD 活力均顯著升高（P＜0.01），見(jiàn)表4。

在心臟中，與空白對(duì)照組相比，模型組的SOD 活力降低（P＜0.05）；與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組（諾迪康）、PTB 低、中、高3 個(gè)劑量組的SOD 活力均顯著升高（P＜0.01），見(jiàn)表4。

表4 PTB 對(duì)常壓缺氧小鼠腦組織和心臟SOD 活力的影響(n=10， ±s)

表4 PTB 對(duì)常壓缺氧小鼠腦組織和心臟SOD 活力的影響(n=10， ±s)

**P＜0.01，與模型組比較；#P＜0.05，與空白組比較。

心臟SOD（U/mg·prot）空白組 - 71.75±19.92 100.7±13.16模型組 - 58.06±4.552# 85.26±16.80#諾迪康組 280 56.88±14.44 115.6±15.00**低劑量組 20 68.98±10.70** 139.7±25.62**中劑量組 40 80.27±18.47** 124.7±21.92**高劑量組 80 79.60±21.02** 127.1±12.15**組別 給藥劑量（mg/kg）腦SOD（U/mg·prot）

2.5 PTB 對(duì)常壓缺氧小鼠腦組織病理形態(tài)的影響

如圖1 所示，與空白對(duì)照組相比，模型組小鼠神經(jīng)細(xì)胞排列明顯紊亂，細(xì)胞之間存在大量空泡（箭頭所示）；與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組及PTB中、高劑量組的小鼠腦組織排列較整齊，細(xì)胞間空泡較少，神經(jīng)纖維束的走行較為整齊統(tǒng)一。

圖1 HE 染色觀察小鼠腦組織病理變化(40×)

尼氏染色下，與空白對(duì)照組相比，模型組海馬區(qū)尼氏小體（箭頭所示）明顯減少，海馬區(qū)細(xì)胞排列紊亂；與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組及PTB 各劑量組的尼氏小體明顯增加，細(xì)胞排列規(guī)則，見(jiàn)圖2。

圖2 尼氏染色觀察小鼠腦組織病理變化( 40×)

2.6 PTB 對(duì)OGD 處理PC12 細(xì)胞存活率的影響

如表5 所示，空白組細(xì)胞存活率為100.00%，模型組細(xì)胞存活率下降至(37.26±3.80) %，與空白組相比存在非常顯著性差異（P＜0.001）。PTB 在20、200、2000 ng/ml 濃度下的細(xì)胞存活率分別為(46.08±4.91) %、(52.90±6.85) %、(61.09±3.53) %，各濃度組相對(duì)于OGD 組均有顯著性差異（P＜0.01，P＜0.001，P＜0.001）。

表5 PTB 對(duì)常壓缺氧的PC12 細(xì)胞損傷存活率的影響( ±s)

表5 PTB 對(duì)常壓缺氧的PC12 細(xì)胞損傷存活率的影響( ±s)

組別 樣本數(shù)（個(gè)） 給藥劑量（ng/ml） 存活率（%）空白組 3 - 100.00±3.01模型組 3 - 37.26±3.80###PTB低劑量組 3 20 46.08±4.91**PTB中劑量組 3 200 52.90±6.85***PTB高劑量組 3 2000 61.09±3.53***

3 討論

缺氧條件下，由于ATP 代謝障礙、機(jī)體代謝增強(qiáng)、體內(nèi)Ca2+濃度增加等原因，產(chǎn)生過(guò)量的氧自由基。氧自由基通過(guò)損傷生物膜、蛋白質(zhì)、DNA 和糖分子，影響細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞凋亡，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生損傷[14-15]。

課題組前期通過(guò)建立減壓缺氧模型，測(cè)定實(shí)驗(yàn)動(dòng)物存活率、血糖、肝糖原、肌糖原、ATP、乳酸（LD）、LDH 等指標(biāo)，論證了PTB 具有維持血糖穩(wěn)定，提高機(jī)體主要臟器中的糖原以及ATP 的含量，減少LD 積蓄以及LDH 的活性，改善機(jī)體能量代謝的作用[13]。本論文采用常壓缺氧模型進(jìn)一步檢測(cè)了在缺氧條件下，PTB 對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)SOD、GSH、LDH 活性、MDA 含量、腦組織病理改變、對(duì)OGD 處理后細(xì)胞存活狀態(tài)等指標(biāo)的影響，進(jìn)一步完善了其對(duì)缺氧實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的保護(hù)作用。SOD 被認(rèn)為是抗氧化系統(tǒng)的第一道防線，是一種能夠?qū)Ｒ磺宄踝杂苫拿?。它通過(guò)降低氧化活性部位金屬離子的活性，以兩步快速反應(yīng)使轉(zhuǎn)變?yōu)镠2O2和O2。H2O2再被過(guò)氧化氫酶還原成H2O[16-17]。GSH 是一種非酶性抗氧化劑，通過(guò)其巰基氧化-還原態(tài)的轉(zhuǎn)換，作為可逆的供氫體，和過(guò)氧化物及自由基結(jié)合，保護(hù)細(xì)胞膜中含巰基的蛋白質(zhì)不被破壞[18]。在本實(shí)驗(yàn)中，PTB 在低、中、高3 個(gè)劑量下，均能顯著增強(qiáng)缺氧小鼠心、腦組織中SOD、GSH 的活性，提高機(jī)體清除氧自由基的能力，減輕缺氧損傷。

脂質(zhì)過(guò)氧化物（LPO）是人體內(nèi)多聚不飽和脂肪酸和氧自由基結(jié)合后形成的。在缺氧條件下，LPO水平升高，機(jī)體細(xì)胞及細(xì)胞膜產(chǎn)生氧化反應(yīng)，溶解細(xì)胞膜表面的磷脂，破壞細(xì)胞膜的生理結(jié)構(gòu)[19]。LPO 還能和細(xì)胞內(nèi)的DNA、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)形成復(fù)合物，刺激新陳代謝改變，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)的紊亂、功能障礙，甚至凋亡。MDA 是LPO 穩(wěn)定的終產(chǎn)物[20]。LDH 是生物體內(nèi)氧化還原的重要酶系之一，它能可逆地催化乳酸氧化為丙酮酸。當(dāng)機(jī)體缺氧時(shí)，主要參與葡萄糖的無(wú)氧代謝。LDH 活性的升高是機(jī)體無(wú)氧酵解程度升高的重要提示之一[21]。在本實(shí)驗(yàn)中，PTB 中、高劑量組小鼠的血清LDH含量較模型組相比明顯降低，說(shuō)明中、高劑量組小鼠的無(wú)氧酵解相對(duì)較少，反應(yīng)出機(jī)體缺氧程度較輕。低、中劑量組小鼠的MDA 含量較模型組相比明顯降低，說(shuō)明小鼠體內(nèi)發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)相對(duì)較低。這說(shuō)明PTB 可以抑制缺氧條件下機(jī)體的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，改善機(jī)體缺氧程度。

行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PTB 在各劑量下均可延長(zhǎng)常壓缺氧小鼠在密閉空間下的存活時(shí)間。腦組織HE 染色和尼氏染色表明，PTB 具有保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，維持細(xì)胞形態(tài)及功能的作用。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PTB 在20、200、2000 ng/ml 濃度下均能夠提高OGD 誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞損傷存活率，存在一定的劑量依賴性，說(shuō)明PTB 對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損傷具有保護(hù)作用。

綜上所述，蜂斗菜總內(nèi)酯具有明顯的提高小鼠耐缺氧能力的作用，其作用機(jī)制可能與清除氧自由基、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能有關(guān)。相比于藏藥紅景天，蜂斗菜總內(nèi)脂的用藥量明顯減少，可作為抗缺氧的天然藥物，進(jìn)一步研究其作用的通路機(jī)制。