王欣榮，魯仁義，王 彥 （海軍軍醫(yī)大學藥學系軍特藥研究中心, 上海 200433）

白念珠菌是一種條件致病真菌，在健康人體口腔或胃腸道中以無害共生菌的形式存在。在免疫功能低下的患者中，能夠?qū)е挛＜吧娜硇愿腥?。近年來，隨著癌癥患者、器官移植接受者等免疫功能低下人群不斷增加，白念珠菌感染引發(fā)的嚴重疾病的發(fā)病率不斷攀升[1-2]，死亡率粗略估計已高于40%[3]。

高適應性是白念珠菌傳播和致病的關(guān)鍵因素之一，包括對宿主和外界環(huán)境的適應性、形態(tài)的轉(zhuǎn)換以及對抗真菌藥物的適應性。代謝的改變能夠影響白念珠菌的藥物敏感性，Ene 等[4]發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中碳源由葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)槿樗岷蟀啄钪榫鷮拐婢幬铮ㄟ淇颠?、兩性霉素B、卡泊芬凈）的敏感性發(fā)生改變。線粒體作為重要的代謝細胞器， 其中的某些基因缺失或者功能缺陷，會導致白念珠菌藥物敏感性的變化，Sun 等[5]發(fā)現(xiàn)線粒體復合體I 相關(guān)基因GOA1和NDH51的缺失會導致白念珠菌對唑類藥物敏感性上升，Edwina 等[6]的研究發(fā)現(xiàn)線粒體關(guān)鍵基因FZO1的缺失能夠增強白念珠菌對唑類藥物的敏感性。

本課題組前期發(fā)現(xiàn)SDH2基因缺失導致白念珠菌致病力顯著下降，并發(fā)現(xiàn)白念珠菌無法利用非發(fā)酵碳源[7]。生物信息學分析顯示SDH2基因編碼琥珀酸脫氫酶（SDH）的鐵硫亞基，琥珀酸脫氫酶在三羧酸循環(huán)和線粒體電子傳遞鏈中均發(fā)揮作用，是能量代謝中重要的一環(huán)。SDH2基因可能在白念珠菌代謝過程中發(fā)揮重要的作用，那么它是否能夠通過影響代謝從而改變白念珠菌的環(huán)境適應性呢？本研究聚焦SDH2基因?qū)Π啄钪榫h(huán)境適應性的影響，包括對外界壓力應答和藥物敏感性的影響，并探索其可能的機制。

1 材料和方法

1.1 菌株培養(yǎng)

挑取少量凍存于-80℃、30% 甘油中的菌株，在YPD 液體培養(yǎng)基中活化，30℃，200 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h 后，吸取10 μl 置于新的1 ml YPD 液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)在 30℃，200 r/min 振蕩條件下培養(yǎng) 16 h，用 SDA 固體培養(yǎng)基劃板，30℃培養(yǎng) 48 h，置于 4℃保存?zhèn)溆?。實驗時挑取 SDA 平板上的單克隆菌落置于1 ml YPD 液體培養(yǎng)基中，30℃，200 r/min 振蕩培養(yǎng) 16 h 過夜，使其處于對數(shù)生長期用于后續(xù)實驗。

1.2 點板實驗檢測藥物敏感性

白念珠菌活化16 h ，用YPD 液體培養(yǎng)基調(diào)整菌濃度至3×106細胞/ml。制備每種菌株的系列稀釋液，以10 倍倍比稀釋成5 個濃度梯度，每種白念珠菌的系列濃度稀釋物各取5 μl，點在事先加入了待考察的不同濃度的化學試劑和藥物的YPD 瓊脂平板上，倒置于孵箱內(nèi)，25、30、37 ℃培養(yǎng)24～48 h，期間觀察各菌株之間生長的差異并拍照記錄。

1.3 羅丹明6G 的外排測定實驗

收集處于對數(shù)生長期的白念珠菌細胞懸浮液，用無菌PBS 洗滌3 次。隨后將細胞重懸于無菌PBS 中調(diào)整其濃度至5×107細胞/ml，孵育2 h 以耗盡能量，并加入終濃度為10 μmol/L 的羅丹明6G。30℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)細胞懸浮液60 min，使羅丹明6G 積累。洗滌白念珠菌細胞懸浮液3 次，注意要保證白念珠菌細胞最終濃度為5×107細胞/ml。然后加入終濃度為20 mmol/L 的葡萄糖。分別在25 、30、37℃ 條件下，200 r/min 振蕩培養(yǎng)白念珠菌細胞懸浮液2 h，取白念珠菌細胞樣品(約1 ml)離心，收集上清液，在527 nm 處測量吸光度。

1.4 統(tǒng)計分析

使用GraphPad Prism 軟件對全部數(shù)據(jù)進行分析，時序檢驗 (Mantel Cox) 方法比較各組差異 ，當P＜0.05 時，表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 SDH2 在白念珠菌應激反應中的作用

我們利用多種刺激劑考察了SDH2在白念珠菌應激反應中的作用。實驗應用了sdh2Δ/Δ敲除菌、野生型菌和回復菌，考察在存在應激刺激劑的培養(yǎng)基中sdh2Δ/Δ敲除菌的生長情況與野生型菌和回復菌的區(qū)別，從而判斷SDH2在白念珠菌應激反應中的作用。應激刺激劑包括細胞壁應激刺激劑（十二烷基硫酸鈉和咖啡因）、滲透壓應激刺激劑（氯化鈉）、氧化應激刺激劑（過氧化氫、二酰胺和甲萘醌）。敏感性實驗在25、30、37 ℃三種不同的溫度下進行，將不同濃度相同體積的白念珠菌接種于瓊脂培養(yǎng)板上，同樣的培養(yǎng)板制備3 份，白念珠菌生長形成明顯的菌落后拍照。結(jié)果顯示，與野生型菌或回復菌相比，sdh2Δ/Δ敲除菌于25 ℃在0.03%十二烷基硫酸鈉培養(yǎng)板上生長得多（圖1A）。此外，在所有培養(yǎng)溫度下，sdh2Δ/Δ敲除菌在含咖啡因、二酰胺或甲萘醌的培養(yǎng)板上也較野生型菌/回復菌生長得多 (圖1A、1B、1C)。

圖1 SDH2 基因缺失菌與野生型菌株對各種應激刺激劑的敏感性

2.2 sdh2Δ/Δ 對唑類藥物的敏感性增加

我們考察了sdh2Δ/Δ敲除菌、野生型菌和回復菌對抗真菌藥物的敏感性，考察的藥物包括唑類抗真菌藥物特比萘芬、兩性霉素B、氟胞嘧啶和阿尼芬凈。將不同濃度相同體積的白念珠菌接種于瓊脂培養(yǎng)板上，同樣的培養(yǎng)板制備3 份，白念珠菌生長形成明顯的菌落后拍照。藥物敏感性實驗結(jié)果顯示，與野生型菌/回復菌相比，sdh2Δ/Δ敲除菌在含有氟康唑、酮康唑和伊曲康唑的培養(yǎng)板上生長得明顯減少(圖2A、2B、2C)，而在含有其他抗真菌藥物，如特比萘芬、兩性霉素B、氟胞嘧啶和阿尼芬凈的培養(yǎng)板上沒有明顯差別。

圖2 SDH2 基因缺失菌與野生型菌株對抗真菌藥物的敏感性

2.3 SDH2 缺失導致白念珠菌藥物外排缺陷

羅丹明6G 是ABC（ATP-binding cassette）轉(zhuǎn)運蛋白的特異性底物，在能量不足時以被動擴散的方式進入白念珠菌細胞，加入葡萄糖供能后，可通過藥物外排泵以主動轉(zhuǎn)運的方式泵出細胞外。我們通過羅丹明6G 的外排實驗考察了SDH2敲除對白念珠菌藥物外排能力的影響。結(jié)果顯示在30 ℃和37 ℃ 培養(yǎng)溫度下，通過添加葡萄糖以啟動能量代謝2 h 后，與野生型菌相比，從sdh2Δ/Δ敲除菌的細胞中泵出的羅丹明6G 顯著減少(P＜0.01，見圖3)。有趣的是，在25 ℃ 的培養(yǎng)溫度下，3 種菌株泵出的羅丹明6G 都較30 ℃和37 ℃條件下有所減少，但各菌株之間沒有顯著差異(圖3)。

圖3 SDH2 基因缺失菌與野生型菌株對羅丹明6G 的外排能力

3 討論

SDH2編碼琥珀酸脫氫酶中的一個亞基，琥珀酸脫氫酶參與三羧酸循環(huán)，并且它位于線粒體內(nèi)膜上，發(fā)揮電子傳遞的作用，對于能量代謝十分重要[8]。我們對SDH2基因在白念珠菌環(huán)境適應性中的作用進行了初步探索，實驗選擇在30 ℃（白念珠菌最適宜生長溫度）、37 ℃（宿主溫度）和25 ℃（室溫）三種溫度下進行。實驗之所以選用三種溫度，一方面是由于在不同環(huán)境溫度下白念珠菌的代謝可能不同，選用不同的溫度可以考察溫度造成的差別；另一方面在三種溫度下考察SDH2基因的功能，結(jié)果相互之間可以比較或者印證，增加信息量，有利于分析SDH2基因的功能。有意思的是SDH2基因缺失后菌株對唑類抗真菌藥物（氟康唑、酮康唑、伊曲康唑）的敏感性顯著上升，而對于其他類型的抗真菌藥物包括丙烯胺類特比萘芬、多烯類兩性霉素B、核苷類氟胞嘧啶和棘白菌素類阿尼芬凈，其敏感性和野生型菌沒有差異。唑類藥物的敏感性與藥物外排泵的功能密切相關(guān)，藥物外排功能障礙可導致對唑類抗真菌藥物敏感性增加[9]。藥物外排泵包括ABC 轉(zhuǎn)運蛋白超家族和主要易化因子超家族，其中ABC 轉(zhuǎn)運蛋白中的Cdr1p、Cdr2p 發(fā)揮作用都需要消耗能量。羅丹明6G 是能量依賴型ABC 轉(zhuǎn)運蛋白的特異性底物，通過外排泵以能量依賴的主動轉(zhuǎn)運方式排出細胞外。羅丹明6G 外排實驗的結(jié)果能顯示能量依賴型ABC 轉(zhuǎn)運蛋白的功能。研究發(fā)現(xiàn)SDH2缺失后白念珠菌在30 ℃和37 ℃時外排能力都顯著降低。SDH2對能量代謝非常重要，SDH2基因缺失后，菌株能量代謝異常，能量依賴型ABC 轉(zhuǎn)運蛋白的功能下降，缺失菌對唑類抗真菌藥物的敏感性增加。

SDH2基因缺失后白念珠菌對咖啡因、二酰胺和甲萘醌都表現(xiàn)出輕微的耐受，這提示SDH2基因在白念珠菌環(huán)境應激中有一定的作用，這些環(huán)境因素包括細胞壁壓力的刺激以及氧化刺激，具體的作用機制還有待進一步探討。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)SDH2基因缺失會導致白念珠菌對環(huán)境壓力應激反應的改變；此外，SDH2基因缺失后菌株的藥物外排能力降低，菌株對唑類抗真菌藥物的敏感性增加。代謝對白念珠菌的環(huán)境適應能力和致病力十分重要，SDH2基因缺失導致白念珠菌對唑類抗真菌藥物專特性地敏感，以SDH2為靶基因，開發(fā)真菌特異性SDH2抑制劑，有望發(fā)現(xiàn)與唑類藥物協(xié)同的新型抗真菌藥物。