張 婷，張亞楠，劉 婕，葉棋濃，丁麗華，閻新龍

1 北京工業(yè)大學 環(huán)境與生命學部，北京 100124；2 軍事科學院 軍事醫(yī)學研究院 生物工程研究所，北京100850

肝癌是消化系統(tǒng)最常見且惡性程度較高的腫瘤，是癌癥引起死亡的第三大主要原因[1]。肝癌早期診斷困難，侵襲性和轉(zhuǎn)移性強，發(fā)現(xiàn)時通常已是晚期[2]。臨床上肝癌總體療效欠佳，僅一小部分患者符合手術(shù)條件，復發(fā)率高且預后極差[3-4]。組蛋白去乙?；侵匾谋碛^遺傳學機制之一，而組蛋白去乙?；?histone deacetylases，HDACs)是組蛋白去乙?；闹饕閷б蜃印DAC6通過去乙?；?tubulin調(diào)節(jié)微管穩(wěn)定性，是一種微管蛋白去乙酰化酶，有研究證實其在調(diào)控基因表達、細胞增殖、凋亡、遷移、免疫反應、蛋白降解等方面發(fā)揮著重要作用[5-8]。本研究采用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)，構(gòu)建了在人肝癌細胞HepG2中將HDAC6基因敲除(knockout，KO)的穩(wěn)定表達細胞系，并通過實驗檢測了HDAC6基因敲除對HepG2細胞增殖和遷移能力、α-tubulin乙?；潭?、耐藥性、細胞周期和凋亡的影響，為在肝癌細胞中進一步研究HDAC6蛋白的功能機制提供基因敲除的細胞模型。

材料與方法

1 材料 人胚腎細胞293T、人肝癌細胞HepG2、大腸埃希菌DH5α、CRISPR/Cas9載體(本實驗室保存)；DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；BsmBI限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、T4多聚核苷酸激酶(NEB公司)；質(zhì)粒提取試劑盒(Promega公司)；膠回收試劑盒、細胞基因組提取試劑盒(康為世紀公司)；細胞周期與細胞凋亡試劑盒(金普來公司)；Transwell小室(Corning公司)；抗HDAC6兔多克隆抗體、抗AC-α-tubulin兔多克隆抗體、抗α-tubulin兔多克隆抗體(Proteintech公司)；辣根過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗兔IgG、辣根過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗鼠IgG、鼠抗人β-actin抗體(Santa Cruz公司)；sgRNA序列合成、鑒定引物合成、質(zhì)粒測序均由北京博邁德基因技術(shù)有限公司完成。

2 設(shè)計特異性sgRNA 以CRISPR/Cas9的靶點設(shè)計原則為依據(jù)，選取HDAC6基因的第三外顯子序列設(shè)計特異性靶向HDAC6基因的sgRNA。sgRNA對應的靶序列的3’端緊跟NGG序列，長度為20 bp。為了使序列能與BsmBI酶切后形成的黏性末端互補，在sgRNA正義鏈模板的5’端添加了CACC，反義鏈模板的5’端添加了AAAC，另外根據(jù)靶點的位置相應設(shè)計了HDAC6敲除效果的鑒定引物。引物序列見表1。

表1 合成寡核苷酸序列Tab. 1 Synthesis of oligonucleotide sequences

3 LentiCRISPR-HDAC6-sgRNA重組質(zhì)粒慢病毒的包裝與感染 LentiCRISPR-HDAC6-sgRNA重組質(zhì)粒構(gòu)建成功(結(jié)果未顯示)后，將293T細胞提前接種在6孔板內(nèi)，培養(yǎng)約24 h，密度為50% ～ 70%時進行轉(zhuǎn)染。重組質(zhì)粒(或LentiCRISPR質(zhì)粒)、PAX2質(zhì)粒和VSVG質(zhì)粒按照4:3:2的比例使用，6孔板的用量為2 μg重組質(zhì)粒(或LentiCRISPR質(zhì)粒)、1.5 μg PAX2質(zhì)粒和1 μg VSVG質(zhì)粒，將三種質(zhì)?；旌嫌?00 μL無血清無雙抗的DMEM中，加入13.5 μL Megatran轉(zhuǎn)染試劑，均勻滴加到6孔板中，放回37℃孵箱繼續(xù)進行培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染4 ～ 6 h后換液，48 h后收取病毒液上清，4℃下3 000 r/min離心5 min。取300 μL包裝好的病毒上清均勻滴加到密度約60%的HepG2細胞的培養(yǎng)基中，24 h后換液，取300 μL病毒上清滴加到細胞培養(yǎng)基中進行二次感染，培養(yǎng)24 h后每孔換成帶有嘌呤霉素(2 μg/mL)的DMEM培養(yǎng)基進行篩選。1周后，將不再死亡的細胞集落吹散于24孔板中，長滿后傳至6 cm皿培養(yǎng)得到穩(wěn)定的單克隆細胞。

4 單克隆細胞基因組DNA的提取和鑒定 收取部分單克隆細胞提取基因組DNA作為模板，使用鑒定引物按照PCR反應體系進行PCR反應，反應產(chǎn)物利用瓊脂糖凝膠電泳檢測，將檢測后的反應產(chǎn)物連接到pBM23-T載體進行轉(zhuǎn)化涂板，挑取不同的單克隆菌落提取質(zhì)粒后送公司進行測序鑒定。

5 Western blot檢測相關(guān)蛋白表達 收取部分野生型(wild type，WT)細胞和HDAC6 KO的HepG2穩(wěn)定表達細胞，使用PBS清洗細胞1遍，在細胞沉淀中加入RIPA裂解液裂解細胞，裂解液體積為細胞體積的3倍，置于冰上30 min使細胞充分裂解，4℃下12 000 r/min離心15 min，收取含蛋白的上清液測定濃度，加入等體積的2 × SDS上樣緩沖液，將樣品煮沸15 min使蛋白變性后進行SDSPAGE使蛋白被分開。電泳結(jié)束后利用濕電轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，膜于室溫下使用5%脫脂牛奶孵育1 h以封閉非特異性位點，HDAC6抗體(1∶500稀釋)和β-actin抗體(1∶5 000稀釋)在冰箱4℃孵育過夜；1 × TBST洗膜5 min，重復3次，HDAC6用辣根過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗兔IgG(1∶5 000稀釋)在室溫條件下孵育1 h，β-actin用辣根過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗鼠IgG (1∶5 000稀釋)在室溫條件下孵育1 h。1 × TBST洗膜5 min，重復3次，利用化學發(fā)光法進行顯影。

6 CCK-8檢測細胞增殖能力 WT細胞和HDAC6 KO的HepG2細胞消化和計數(shù)后以4 × 103/孔的細胞密度分別接種至96孔板中，每組設(shè)3個復孔；分別在0 h、24 h、48 h、72 h、96 h時每孔加入100 μL CCK-8試劑，37℃孵育1 h后，取出，利用酶標儀測定樣品的D450nm值并記錄。

7 劃痕實驗和Transwell遷移實驗檢測細胞遷移能力 將WT和HDAC6 KO的HepG2細胞消化分別接種至6孔板中，在細胞幾乎長滿后，用無菌移液器槍頭在孔中劃出3條直線，PBS清洗去除殘留細胞，然后加入含0.5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，在劃痕處分別選上、中、下3點在顯微鏡下拍下0 h圖片。24 h后，在初始位置再次拍照；用圖像軟件測量細胞的遷移距離。

在24孔板中加入500 μL含有20%胎牛血清的DMEM作為下液，將小室放入24孔板中，將WT和HDAC6 KO的HepG2細胞消化后收集至1.5 mL EP管中，用不含有血清和雙抗的DMEM清洗3次后使用細胞計數(shù)儀對細胞進行計數(shù)，按5 ×104/室的細胞密度分別接種至Transwell上室，放回37℃孵箱繼續(xù)進行培養(yǎng)，24 h后吸棄培養(yǎng)基，PBS清洗小室后使用4%多聚甲醛固定30 min下室層面的細胞，再用1%結(jié)晶紫染色30 min，再次使用PBS清洗后，用棉簽輕輕擦去上室中的細胞，顯微鏡下觀察下室層面的細胞，拍照，計數(shù)。

8 Western blot鑒定α-tubulin乙?；潭?收取WT和HDAC6 KO的HepG2細胞冰浴充分裂解，蛋白定量后加入上樣緩沖液，煮沸使蛋白變性后進行SDS-PAGE使蛋白分開。電泳結(jié)束后利用濕電轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，使用5%脫脂牛奶封閉非特異性位點，HDAC6抗體(1∶500稀釋)、AC-α-tubulin抗體(1∶1 000稀釋)、α-tubulin抗體(1∶1 000稀釋)以及β-actin抗體(1∶5 000稀釋)，在冰箱4℃孵育過夜。1 × TBST洗膜5 min，重復3次，HDAC6、AC-α-tubulin、α-tubulin用辣根過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗兔IgG(1∶5 000稀釋)在室溫條件下孵育1 h，β-actin用辣根過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗鼠IgG(1∶5 000稀釋)在室溫條件下孵育1 h。1 × TBST洗膜5 min，重復3次，使用化學發(fā)光法顯影。

9 細胞存活實驗檢測細胞對ACY-1 215的敏感度

將WT和HDAC6 KO的HepG2細胞消化計數(shù)后以3 000個/孔的細胞密度接種到96孔板中，每組設(shè)置3個復孔，分別在每孔進行ACY-1215處理。處理48 h后每孔加入100 μL CCK-8試劑，37℃孵育1 h后，取出利用酶標儀測定樣品的D450nm值并記錄數(shù)值。

10 流式細胞術(shù)檢測細胞周期 將WT和HDAC6 KO的HepG2細胞分別接種至6孔板中，放回37℃孵箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h后使用胰酶消化收集細胞，使用PBS清洗細胞1次，使用1 mL含70%乙醇的固定液將細胞重懸，置于冰箱4℃固定過夜。染色前PBS洗去固定液，在細胞沉淀中加入500 μL碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色液重懸細胞，加入RNaseA(終濃度為0.25 mg/mL)，在37℃孵箱避光孵育30 min后進行流式細胞儀分析。

11 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 將WT和HDAC6 KO的HepG2細胞消化分別接種至6孔板中，培養(yǎng)24 h后，加入胰酶消化收集細胞，使用在冰箱4℃預冷后的PBS清洗細胞，重復清洗2次后，加入250 μL結(jié)合緩沖液，調(diào)節(jié)細胞懸液的濃度為1×106/mL，取100 μL細胞懸液置于流式管中，加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI溶液充分混勻，在室溫下避光孵育15 min后，在流式管中加入400 μL PBS，于1 h內(nèi)進行流式細胞儀分析。

結(jié) 果

1 HDAC6基因敲除細胞系內(nèi)HDAC6蛋白表達

為了檢測HDAC6 sgRNA的剪切效率，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293T細胞中，48 h后收取細胞，提取細胞基因組進行PCR擴增，連接pBM23-T載體后轉(zhuǎn)化涂板，挑取30個單克隆進行測序，結(jié)果顯示有23個單克隆都發(fā)生了不同程度的剪切，其余7個單克隆未發(fā)生剪切為野生型，剪切效率約為76.7%，可以進行下一步實驗。進一步將重組質(zhì)粒慢病毒包裝感染HepG2細胞，嘌呤霉素篩選后有限稀釋，將單克隆細胞接種至6 cm皿后，挑取5個細胞克隆，Western blot檢測HDAC6的蛋白表達水平(圖1)。結(jié)果：第3個單克隆細胞中HDAC6蛋白完全沒有表達；分別提取WT細胞和第3個單克隆細胞的基因組DNA當作模板，用設(shè)計的鑒定引物進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳后測序。結(jié)果：HDAC6 sgRNA于第三外顯子正義鏈產(chǎn)生了2 bp缺失突變、反義鏈產(chǎn)生了5 bp缺失突變，改變了HDAC6基因的開放閱讀框，終止了HDAC6蛋白的翻譯(圖2)。結(jié)果：成功構(gòu)建HepG2 HDAC6基因敲除的穩(wěn)定細胞系。

圖1 HepG2單克隆細胞中HDAC6的敲除鑒定Fig.1 Identification of HDAC6 KO HepG2 monoclonal cells

圖2 基因組DNA測序結(jié)果 A：HepG2 WT細胞序列；B：HDAC6 KO細胞的正義鏈序列；C：HDAC6 KO細胞的反義鏈序列?！啊北硎緣A基缺失的位置Fig.2 Identification of HDAC6 KO HepG2 cell lines by DNA sequencing. A: Sequence of WT HepG2 cells; B: One allele sequence of HDAC6 KO cells; C: The other allele sequence of HDAC6 KO cells. “▲” indicates the location of the base missing

2 HDAC6敲除后細胞增殖速度的變化 HDAC6 KO細胞和WT細胞接種于96孔板，用CCK-8試劑盒檢測敲除HDAC6對HepG2細胞增殖的影響。結(jié)果：敲除HDAC6可以顯著抑制HepG2細胞的增殖(圖3)，48 h、72 h和96 h時HDAC6 KO組與WT組細胞的增殖差異均有統(tǒng)計學意義。

圖3 HepG2 WT細胞和HDAC6 KO細胞的增殖曲線(aP＜0.01，vs WT)Fig.3 Proliferation curves of HepG2 WT and HDAC6 KO cells(aP＜0.01, vs WT)

3 HDAC6敲除后細胞遷移能力的變化 實驗設(shè)置了WT組、HDAC6 KO組。劃痕實驗：在劃痕24 h后，計算測量遷移距離，Transwell遷移實驗：細胞接種于不鋪基質(zhì)膠的Transwell小室，培養(yǎng)細胞24 h固定、染色后拍照，計數(shù)。結(jié)果：在劃痕實驗中，WT組細胞遷移距離約為HDAC6 KO組細胞遷移距離的2.5倍(圖4)，在Transwell遷移實驗中，WT組平均遷移細胞數(shù)目為HDAC6 KO組遷移細胞數(shù)目的2.3倍(圖5)。以上結(jié)果為3次獨立實驗結(jié)果的平均值。實驗結(jié)果表明：敲除HDAC6可以明顯抑制HepG2細胞的遷移，WT組與HDAC6 KO組細胞的遷移速度差異有統(tǒng)計學意義。

圖4 HDAC6對HepG2細胞遷移速度的影響A：HepG2 WT細胞和HDAC6 KO細胞遷移速度的變化，標尺：50 μm；B：劃痕實驗統(tǒng)計分析結(jié)果(aP ＜0.01，vs WT)Fig.4 Effect of HDAC6 on migration of HepG2 cellsA: Wound scratch healing assay of HepG2 WT or HDAC6-KO cells. Scale bar: 50 μm; B: Statistical analysis of wound scratch healing assay (aP ＜0.01, vs WT)

圖5 HDAC6對HepG2細胞遷移數(shù)量的影響A：HepG2 WT細胞和HDAC6 KO細胞遷移數(shù)量的變化，標尺：50 μm；B：遷移實驗統(tǒng)計分析結(jié)果(aP＜0.01，vs WT)Fig.5 Effect of HDAC6 on migration of HepG2 cellsA: Transwell migration assay of HepG2 WT or HDAC6-KO cells. Scale bar: 50 μm；B: Statistical analysis of Transwell migration assay (aP＜0.01, vs WT)

4 HDAC6敲除后α-tubulin乙?；潭鹊淖兓瘜嶒炘O(shè)置WT組和HDAC6 KO組，Western blot檢測HDAC6、α-tubulin、AC-α-tubulin的蛋白表達水平(圖6)。結(jié)果：HDAC6在空細胞組表達正常，HDAC6 KO組完全沒有表達，α-tubulin在空細胞組與HDAC6 KO組表達相同、AC-α-tubulin在HDAC6 KO組表達明顯增強。結(jié)果：HepG2細胞中HDAC6被敲除后使α-tubulin乙?；潭仍鰪?。

圖6 HDAC6敲除后α-tubulin乙?；潭鹊淖兓疉：HDAC6敲除后AC-α-tubulin、α-tubulin的蛋白表達；B：蛋白表達統(tǒng)計分析結(jié)果(aP＜0.01，n.s：no significance，vs WT)Fig.6 Effect of HDAC6 knockout on the acetylation of α-tubulinA: Protein expression of AC-α-tubulin, α-tubulin and HDAC6; B: Statistical analysis of protein expression(aP＜0.01, n.s: no significance, vs WT)

5 HDAC6敲除后細胞對ACY-1 215敏感度的改變 實驗設(shè)置WT組和HDAC6 KO組，用CCK-8試劑盒檢測HepG2細胞敲除HDAC6對ACY-1215敏感度的影響(圖7)。結(jié)果：HDAC6 KO組細胞活力明顯高于WT組細胞。結(jié)果表明：敲除HDAC6降低了HepG2細胞對ACY-1215的敏感度。

圖7 HDAC6敲除后細胞對ACY-1215敏感度的改變(aP＜0.01，vs WT)Fig.7 Effect of HDAC6 knockout on the cell viability exposed to ACY-1215 (aP＜0.01, vs WT)

6 HDAC6敲除對細胞周期的影響 實驗設(shè)置WT組和HDAC6 KO組，與WT組比較，HDAC6 KO組G1期細胞比例顯著升高，而S期細胞比例顯著下降(圖8)。結(jié)果表明，敲除HDAC6能夠使HepG2細胞發(fā)生G1期阻滯，降低細胞增殖能力。

圖8 HepG2 WT和HDAC6 KO細胞周期的變化A：流式細胞術(shù)檢測HepG2 WT和HDAC6 KO細胞的細胞周期；B：柱狀圖顯示HepG2細胞的細胞周期分布Fig.8 Effect of HDAC6 knockout on cell cycle of HepG2 cellsA: The cell cycle was evaluated by flow cytometry; B: Histogram showed the cell cycle distributions of HepG2 cells

7 HDAC6敲除對細胞凋亡的影響 實驗設(shè)置WT組和HDAC6 KO組，實驗結(jié)果顯示HDAC6 KO組較WT組細胞的凋亡率顯著升高(圖9)。這表明敲除HDAC6可以促進HepG2細胞的凋亡，WT組與HDAC6 KO組細胞的凋亡比例差異有統(tǒng)計學意義。

圖9 HepG2 WT和HDAC6 KO細胞凋亡的變化A:流式細胞術(shù)檢測HepG2 WT和HDAC6 KO細胞的凋亡；B：細胞凋亡率的統(tǒng)計分析結(jié)果(aP ＜0.01，vs WT)Fig.9 Effect of HDAC6 knockout on apoptosis of HepG2 cellsA: Apoptosis was tested by flow cytometry; B: Statistical analysis of apoptosis rates (aP ＜0.01, vs WT)

討 論

肝癌是全球四大癌癥相關(guān)死亡原因之一，其發(fā)生發(fā)展是一個多因素、多階段、多通道調(diào)控的復雜過程。在誘發(fā)肝癌的原因中乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒感染是主要的危險因素[9]。肝癌通常診斷較晚，死亡人數(shù)在全球癌癥死亡人數(shù)中排第二[2]。因此針對其發(fā)生發(fā)展機制的研究變得尤為重要。成簇的規(guī)律間隔的短回文重復序列/CRISPR相關(guān)蛋白9(clustered regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR/CRISPR-associated protein 9，Cas9)存在于細菌免疫系統(tǒng)，經(jīng)過人為改造后成為了一種簡單快速的基因編輯工具，是除了鋅指核酸酶和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應因子核酸酶這兩種技術(shù)以外的第三代基因編輯技術(shù)，Cas9蛋白含有兩個核酸酶結(jié)構(gòu)域，可以分別切割DNA的兩條鏈[10]。CRISPR/Cas9技術(shù)能夠有效地修飾各種物種和細胞類型的內(nèi)源性基因，通過設(shè)計特異性sgRNA與靶序列進行堿基配對，引導Cas9蛋白結(jié)合到靶序列，利用細胞的非同源性末端鏈接或同源重組修復機制對斷裂的DNA進行插入、缺失、修復或替換，從而發(fā)揮其DNA切割的功能。CRISPR/Cas9簡單易操作、成本低、效率高且突變位點選擇性強，該技術(shù)被成功用于編輯許多領(lǐng)域生物體的基因組[11-12]。CRISPR/Cas9技術(shù)簡單易操作且應用廣泛，是目前效率最高的基因編輯技術(shù)，也是近年來分子生物學領(lǐng)域研究的熱點技術(shù)之一[13]。

腫瘤的侵襲性是一種細胞運動，細胞骨架作為細胞的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，在細胞運動過程中不斷被重塑。在此背景下，一些與腫瘤細胞的微管和肌動蛋白依賴動力學相關(guān)的分子已被認為可能是肝內(nèi)肝癌轉(zhuǎn)移的預測因子或預防治療靶點[14]。HDAC6是組蛋白去乙?；讣易宄蓡T之一，最初被稱為微管相關(guān)脫乙酰酶，其通過去乙酰化組蛋白從而抑制基因的轉(zhuǎn)錄，進而影響癌細胞的生長狀態(tài)，調(diào)節(jié)多種重要的生物學進程[15-17]。有研究證明HDAC6基因的下調(diào)顯著降低了肝癌細胞系的遷移和侵襲活性，HDAC6蛋白的過表達參與了肝癌細胞的遷移和侵襲活性[14,18]。

α-tubulin是細胞骨架的重要組成部分，在細胞結(jié)構(gòu)維持和細胞轉(zhuǎn)運過程中發(fā)揮作用。研究證明抑制HDAC6能夠使α-tubulin乙?；?，進而誘導細胞凋亡[19]。本研究結(jié)果顯示，HDAC6基因敲除后α-tubulin乙?；潭让黠@增強且對HDAC6抑制劑ACY-1215的敏感度顯著降低。

細胞凋亡受抑制在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中有相當重要的作用。本研究結(jié)果顯示HDAC6基因敲除能夠使HepG2細胞發(fā)生G1期阻滯，促進HepG2細胞的凋亡，降低細胞的增殖能力。細胞周期和凋亡的改變受許多相關(guān)蛋白的調(diào)控，如Cyclin-CDK復合物、Caspase家族蛋白等[16,20-21]。本研究結(jié)果尚未顯示HDAC6基因敲除后細胞周期和凋亡相關(guān)蛋白的變化，因此HDAC6調(diào)控HepG2細胞周期和凋亡的具體機制還有待進一步研究。

綜上，本研究結(jié)果提示HDAC6是肝癌發(fā)生過程中的重要蛋白，可能成為肝癌的潛在治療靶點。HepG2細胞HDAC6基因敲除穩(wěn)定細胞系模型的建立，為進一步體內(nèi)外研究HDAC6在肝癌進展中的調(diào)控作用機制奠定了基礎(chǔ)。