陳立偉，翟性友，黃邦清，劉宸箐，張永俠，趙建東，劉明波

1 解放軍總醫(yī)院海南醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科，海南三亞 572013；2 解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學(xué)中心 耳鼻咽喉頭頸外科醫(yī)學(xué)部，北京 100048

喉癌是頭頸部常見的惡性腫瘤，96% ～ 98%病理類型為鱗狀細(xì)胞癌。當(dāng)前，手術(shù)是治療喉癌的主要手段，而非手術(shù)治療，如放療、化療和免疫治療，已經(jīng)成為可選擇的重要治療手段[1-2]。一項(xiàng)癌癥統(tǒng)計(jì)報(bào)告顯示，過(guò)去40年中喉癌的5年生存率從66%下降至63%，而造成喉癌患者死亡的主要原因是局部的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[3-5]。我們?cè)噲D在分子水平尋找調(diào)控喉癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因子，以期推進(jìn)喉癌的早期發(fā)現(xiàn)、早期治療和有效生物治療靶點(diǎn)的研究。我們前期在研究喉癌轉(zhuǎn)移機(jī)制時(shí)成功建立喉癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型，應(yīng)用喉鱗癌細(xì)胞系Hep-2細(xì)胞注射裸鼠舌緣黏膜下，待腫瘤形成并發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移后，無(wú)菌取裸鼠頸部淋巴結(jié)，培養(yǎng)轉(zhuǎn)移到淋巴結(jié)的腫瘤細(xì)胞，經(jīng)反復(fù)接種，獲得高轉(zhuǎn)移性Hep-2細(xì)胞亞系。進(jìn)一步應(yīng)用microRNA微陣列基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)(LC Sciences，Houston，TX)對(duì)親本Hep-2細(xì)胞和高轉(zhuǎn)移性Hep-2細(xì)胞亞系兩組細(xì)胞microRNA表達(dá)譜進(jìn)行檢測(cè)和分析，發(fā)現(xiàn)親本喉癌細(xì)胞和高轉(zhuǎn)移性喉癌細(xì)胞亞系中存在明顯的microRNA差異表達(dá)現(xiàn)象。經(jīng)過(guò)生物信息學(xué)分析及臨床患者組織標(biāo)本驗(yàn)證，我們發(fā)現(xiàn)microRNA-25(miR-25)和miR-100可能對(duì)喉癌侵襲轉(zhuǎn)移起到重要的調(diào)控作用[6]。本研究通過(guò)增加和抑制喉鱗癌細(xì)胞系Hep-2細(xì)胞中miR-25的表達(dá)，驗(yàn)證miR-25對(duì)喉鱗癌細(xì)胞侵襲、遷移和增殖功能的影響。

材料與方法

1 試劑和儀器 RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)，LipofectamineTM2000(Lip2000，Invitrogen公司)。

2 細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞轉(zhuǎn)染 喉鱗癌Hep-2細(xì)胞系由解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學(xué)中心耳鼻咽喉頭頸外科醫(yī)學(xué)部頭頸外科課題組儲(chǔ)存，細(xì)胞在含10%胎牛血清(Gibco)的DMEM培養(yǎng)基中于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。Hep-2細(xì)胞經(jīng)消化、離心后，采用完全培養(yǎng)基進(jìn)行重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為4×105/mL，按照6孔板中每孔2 mL細(xì)胞懸液進(jìn)行接種，常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，密度達(dá)80%左右時(shí)，更換為無(wú)血清培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)設(shè)置5組：1)空白對(duì)照組，細(xì)胞不做任何處理；2)Mimic control組：細(xì)胞轉(zhuǎn)染不會(huì)引起任何miRNA表達(dá)改變的mimic序列；3)Inhibitor control組：細(xì)胞轉(zhuǎn)染不會(huì)引起任何基因表達(dá)改變的Inhibitor序列；4)miR-25 mimic組：細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-25的mimic，序列可以引起miR-25的高表達(dá)；5)miR-25 inhibitor組：細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-25的抑制序列，可以降低miR-25的表達(dá)。轉(zhuǎn)染過(guò)程：取4個(gè)EP管，分別加入不含F(xiàn)BS的1640培養(yǎng)基200 μL，再各自加入轉(zhuǎn)染試劑Lip2000 5 μL，輕吹混勻；取另4個(gè)EP管，均加入不含F(xiàn)BS的RPMI 1640培養(yǎng)基200 μL，再加入分別加入Mimic control、miR-25 mimic、Inhibitor control、miR-25 inhibitor 2 μL，輕吹混勻。8個(gè)管分別靜置5 min；將加入Mimic control、miR-25 mimic、Inhibitor control、miR-25 inhibitor管中液體分別吸入裝有Lip2000的管內(nèi)，共400 μL的Mix，靜置20 min；將Mix滴入6孔板內(nèi)，前后左右搖晃10 ～ 15次；置培養(yǎng)箱內(nèi)，孵育6 h后更換為含F(xiàn)BS的RPMI 1640培養(yǎng)基；轉(zhuǎn)染24 h后收集各組細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

3 RT-qPCR驗(yàn)證miR-25的表達(dá) 采用 Invitrogen公司的Trizol試劑盒及操作方法提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度法定量后，采用GoScriptTM公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，取2.5 μg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物采用SYBR Green方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件：預(yù)變性，95℃，2 min；變性，95℃，20 s；退火，60℃，20 s；延伸，72℃，30 s；40個(gè)循環(huán)；熔解曲線分析：95℃，1 min；60℃，1 min；95℃，30 s。反應(yīng)完成后，采用2-△△Ct法作為相對(duì)定量差異表達(dá)的度量。所有反應(yīng)都以U6小核RNA用作內(nèi)參對(duì)照，以確定相對(duì)microRNA表達(dá)水平。

4 Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 各組細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染處理后制備成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105/mL。用Matrigel(1 mg/mL，美國(guó)BD公司)膠包被Transwell小室(孔徑8 μm，美國(guó)Corning公司)。取細(xì)胞懸液200 μL加入Transwell上室，下室中加入500 μL的DMEM完全培養(yǎng)基，盡量排除兩室之間的氣泡。培養(yǎng)12 h后取出Transwell小室，用蘸有PBS的棉簽擦去小室上層的細(xì)胞，取下Transwell膜，甲醇固定20 min后，PBS清洗3次，Giemsa染液，染色30 min，PBS清洗3次，棄去PBS后晾干，于顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野拍照計(jì)數(shù)，取平均值為最終結(jié)果。

5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染后24 h的各組Hep-2細(xì)胞以1×105/孔接種于24孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)到80%以上融合時(shí)，棄去上清，保證Tip頭垂直進(jìn)行劃痕，各孔劃痕寬度保持基本一致。采用PBS洗滌3次后向各孔中加入無(wú)血清培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，間隔48 h后觀察細(xì)胞分布并進(jìn)行拍照。細(xì)胞劃痕愈合率=(0 h劃痕寬度-48 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

6 MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 收集各組細(xì)胞，以1×103/孔接種細(xì)胞于96孔板中，在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分別于第1、2、3、4天加入20 μL MTT(5 mg/mL，美國(guó)Sigma-Aldrich公司)，培養(yǎng)4 h后，加入150 μL DMSO，振蕩10 min ，使結(jié)晶物充分溶解。490 nm酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)各孔光吸收值。以時(shí)間為橫軸，光吸收值為縱軸，繪制細(xì)胞增殖曲線。

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Stata軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以x±s表示，兩組間比較用t檢驗(yàn)，三組間比較用單因素方差分析+多重比較LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Hep-2細(xì)胞中miR-25表達(dá)的變化 轉(zhuǎn)染miR-25 mimic 24 h后，RT-qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Hep-2細(xì)胞中miR-25的表達(dá)量是正常對(duì)照組的2.48倍(P＜0.01)，而轉(zhuǎn)染miR-25 inhibitor 24 h后，RT-qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Hep-2細(xì)胞中miR-25的表達(dá)量較正常對(duì)照組下降了35%(P＜0.05)。見圖1。

圖1 RT-qPCR檢測(cè)Hep-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-25 mimic和miR-25 inhibitor后miR-25表達(dá)變化(aP＜0.05，bP＜0.01，vs Control)Fig.1 RT-qPCR detection of miR-25 expression after transfection of miR-25 mimic and miR-25 inhibitor (aP＜0.05, bP＜0.01, vs control)

2 細(xì)胞侵襲能力觀察 Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，miR-25 mimic轉(zhuǎn)染Hep-2細(xì)胞24 h后，Hep-2細(xì)胞穿過(guò)Transwell小室的腫瘤細(xì)胞數(shù)量顯著低于對(duì)照組(P＜0.01)，證明miR-25的高表達(dá)顯著抑制了喉癌Hep-2細(xì)胞的體外侵襲能力。抑制miR-25表達(dá)后，得到了與過(guò)表達(dá)miR-25表達(dá)相反的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，即Hep-2細(xì)胞的侵襲能力出現(xiàn)顯著增加(P＜0.01)。見圖2。

圖2 Hep-2細(xì)胞Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)(bP＜0.01，vs Control)Fig.2 Transwell cell migration test of Hep-2 cells (bP＜0.01, vs control)

3 細(xì)胞遷移能力觀察 Hep-2細(xì)胞中miR-25過(guò)表達(dá)后，Hep-2細(xì)胞劃痕愈合率(32.4%±3.05%)顯著低于正常對(duì)照組(47.2%±4.324%)；而抑制miR-25的表達(dá)后Hep-2細(xì)胞劃痕愈合率(87.2%±5.45%)顯著高于正常對(duì)照組。見圖3。

圖3 Hep-2細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)(bP＜0.01，vs Control)Fig.3 Cell scratch test of Hep-2 cells (bP＜0.01, vs control)

4 細(xì)胞增殖能力觀察 MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，喉鱗癌Hep-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-25 inhibitor、miR-25 mimic后，與正常對(duì)照組比，miR-25低表達(dá)組在第3天時(shí)腫瘤活細(xì)胞數(shù)量顯著增加，第4天時(shí)由于96孔板內(nèi)細(xì)胞覆蓋度達(dá)到100%，導(dǎo)致差異消失。miR-25過(guò)表達(dá)組腫瘤活細(xì)胞數(shù)量顯著減少，Hep-2細(xì)胞增殖能力在第3、4天均表現(xiàn)為顯著降低。見圖4。

圖4 Hep-2細(xì)胞MTT增殖實(shí)驗(yàn) (aP＜0.05, bP＜0.01，vs Control)Fig.4 MTT cell proliferation test of Hep-2 cells (aP＜0.05, bP＜0.01,vs control)

討 論

MicroRNA是單鏈小型非編碼RNA，含有大約22個(gè)核苷酸。MicroRNA通過(guò)與mRNA3'端的非翻譯區(qū)結(jié)合，抑制mRNA的翻譯或降解mRNA。大量研究表明，microRNA可以通過(guò)調(diào)節(jié)癌細(xì)胞增殖、分化、侵襲、遷移和細(xì)胞凋亡在癌癥中起著關(guān)鍵作用[7-9]。

在所有 microRNA 中，miR-25 是在人類不同癌癥中研究最多、描述最充分的microRNA之一。miR-25在不同癌癥中的作用報(bào)道不一，在前列腺癌和結(jié)腸癌中，miR-25表達(dá)降低起到腫瘤抑制劑作用[10]。而在乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肝細(xì)胞癌及肺癌中miR-25表達(dá)顯著增加，起到促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的致癌作用[11-17]。一項(xiàng)結(jié)腸癌的研究報(bào)道，人類結(jié)腸癌組織中的miR-25與匹配的非腫瘤黏膜組織相比，處于低調(diào)節(jié)。有研究表明，miR-25可抑制腫瘤細(xì)胞增殖和遷移，而且是通過(guò)調(diào)節(jié)Smad7起作用[18]。miR-25在喉癌中的作用目前仍未明確。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，在高轉(zhuǎn)移性喉癌細(xì)胞中miR-25的表達(dá)顯著降低，且在喉癌患者腫瘤標(biāo)本中得到驗(yàn)證[6]。

本研究中，通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-25 mimic和miR-25 inhibitor分別過(guò)表達(dá)和抑制喉鱗癌Hep-2細(xì)胞中的miR-25，發(fā)現(xiàn)miR-25表達(dá)量的下降顯著增加了Hep-2細(xì)胞的體外侵襲遷移能力，并且Hep-2細(xì)胞的體外增殖能力也顯著增加。而miR-25的表達(dá)上調(diào)后，喉癌細(xì)胞的惡性能力顯著下降。提示miR-25在喉鱗癌中起到抑癌作用，與我們前期研究發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)移性喉癌組織中miR-25表達(dá)量下降的結(jié)果一致。研究結(jié)果高度提示miR-25作為抑癌因子在喉鱗癌的惡性進(jìn)展中起到至關(guān)重要的作用，進(jìn)一步研究其作用機(jī)制具有較大的臨床價(jià)值，可幫助我們尋找喉癌治療的靶點(diǎn)基因。