趙凱迪 王秋丹 林長青

(延邊大學醫(yī)學院中醫(yī)系，吉林 延吉 133000)

桔梗(Platycodon grandiflorus)為桔?？平酃俣嗄晟荼局参?，在中國、韓國、日本和東西伯利亞被廣泛種植[1]。具有多種活性成分，包括皂苷、黃酮、多糖等[2-4]，并具有抗炎、抗過敏、抗肥胖、免疫調(diào)節(jié)等藥理活性[5]。

抗氧化活性是評價多糖生物活性的重要指標[6]。體內(nèi)過量的自由基會氧化和破壞正常細胞，誘發(fā)炎癥、過早衰老、癌癥和輻射損傷等身體疾病[7]。機體內(nèi)過度的氧化反應也會導致糖尿病及其并發(fā)癥[8]。研究[9-10]表明，多糖具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)和抗病毒作用。Wang等[11]研究指出，桔梗多糖對氧化磷酸化抑制劑引起的凋亡有保護作用。鮑少杰等[12]指出枸杞多糖、蘆薈多糖等植物多糖均具有降血糖功效。但目前有關桔梗多糖的報道多集中在桔梗多糖的提取工藝以及純化研究[13-14]，未見桔梗多糖對2型糖尿病大鼠降血糖作用的報道。試驗擬研究桔梗多糖的抗氧化性和對2型糖尿病大鼠降血糖作用及其可能機制，旨在為開發(fā)桔梗成為新抗氧化和降血糖產(chǎn)品提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫花桔梗：市售；

雄性無特定病原體(SPF)級SD大鼠：50只，體重(250±20) g，許可證號SCXK(遼)2015-0001，長春億斯試驗動物中心；

無水乙醇：分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司；

鏈脲佐菌素(STZ)：99.9%，美國Sigma公司；

鹽酸二甲雙胍片：95.0%，北京萬輝雙鶴藥業(yè)有限責任公司；

二苯代苦味肼基自由基(DPPH·)：分析純，上?；晒I(yè)有限公司；

2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)：分析純，北京索萊寶科技有限公司；

一氧化氮清除劑(PTIO)：北京綠源伯德生物科技有限公司；

大鼠總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)和過氧化氫酶(CAT)試劑盒：江蘇南京建城生物工程研究所；

四孔數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH-4型，江蘇科析儀器有限公司；

旋蒸冷凝器：CCA-1111-CE型，東京理化器械株式會社；

血糖儀：AG-605型，天津九安醫(yī)療電子股份有限公司；

離心機：TD-4M型，山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司；

酶標儀：BK-EL10C型，山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 桔梗多糖提取 將桔梗烘干，粉碎后過40目篩，參照陳俊波等[15]的方法并稍作改動：料液比1∶30 (g/mL)，提取時間3 h，提取溫度80 ℃，浸提兩次，合并提取液，用85%乙醇醇沉24 h，取沉淀，采用Sevage法除蛋白，脫色，凍干成粉，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 桔梗多糖含量測定 采用苯酚硫酸法[16]。

1.2.3 桔梗多糖抗氧化性測定 根據(jù)龔雯等[17]的方法稍作修改，將桔梗多糖配制成質(zhì)量分數(shù)分別為50，100，200，400，800，1 000 μg/mL的溶液，以維生素C作為對照組，測定其對DPPH·、ABTS+·、·OH、PTIO的清除能力。

1.2.4 試驗動物分組及給藥 選取50只SPF級雄性SD大鼠，適應性喂養(yǎng)1周，高脂高糖飼料喂養(yǎng)6周后，一次性腹腔注射STZ(30 mg/kg·BW)建立T2DM模型，并將其分為正常組、模型組、桔梗多糖高劑量組(400 mg/kg)、桔梗多糖低劑量組(200 mg/kg)、陽性組(二甲雙胍200 mg/kg)，連續(xù)灌胃8周，正常組和模型組灌以等量蒸餾水，每2周記錄所有大鼠的體重和FBG。

1.2.5 大鼠OGTT測定 參照戴燕鈴等[18]的方法。

1.2.6 大鼠TC、TG、HDL-C、LDL-C測定 試驗結(jié)束后，心臟取血，3 000 r/min離心10 min，取上清，依次按各項指標試劑盒說明書進行操作。

1.2.7 大鼠SOD、GSH、CAT、MDA測定 將肝臟用0.1 mol/L Tris-HCl制備成組織勻漿，并按說明書測定肝臟組織中SOD、GSH、CAT、MDA活性。

1.2.8 統(tǒng)計學分析 使用SPSS 23.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析和顯著性差異分析，結(jié)果以均值±標準偏差表示，P<0.05表示有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 桔梗多糖含量

試驗發(fā)現(xiàn)，多糖得率為10.82%。由圖1可知，標準曲線方程為y=10.48x+0.003 6 (R2=0.997 6)，多糖質(zhì)量分數(shù)為89.65%。

圖1 多糖標準曲線Figure 1 Standard curve of polysaccharides

2.2 對DPPH·、ABTS+·、·OH、PTIO的清除能力

由圖2可知，當桔梗多糖質(zhì)量濃度為50 μg/mL時，其對DPPH·、ABTS+·、·OH、PTIO的清除率分別為33.5%，35.5%，10.2%，14.7%；隨著桔梗多糖質(zhì)量濃度的增加，DPPH·、ABTS+·、·OH、PTIO的清除率均呈劑量依賴性增加，當多糖質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL時，其對DPPH·、ABTS+·、·OH、PTIO的清除能力分別為91.3%，89.7%，83.8%，90.4%，但與維生素C存在極顯著差異(P<0.01)。這主要是由于桔梗多糖屬于多羥基化合物，因此具有很強的還原性，極易與DPPH發(fā)生氧化反應生成醌類物質(zhì)，其對其他自由基的清除可能是通過糖醛酸與亞鐵離子耦合抑制，從而抑制羥自由基的產(chǎn)生[19-20]。綜上，桔梗多糖具有一定的清除自由基的能力，具有抗氧化性。

*與維生素C相比差異顯著(P<0.05)，**與維生素C相比差異極顯著(P<0.01)圖2 桔梗多糖對DPPH·、ABTS+·、·OH、PTIO的清除能力Figure 2 The ability of platycodon grandiflorum polysaccharide to clear DPPH·, ABTS+·, ·OH, PTIO

2.3 對大鼠體重、FBG的影響

由表1可知，灌胃8周后，與正常組相比，T2DM大鼠的體重均顯著降低(P<0.05)，經(jīng)桔梗多糖治療后的糖尿病大鼠可以有效緩解體重的下降，效果與陽性組相當。由表2可知，經(jīng)8周的桔梗多糖灌胃后，各大鼠的FBG差異顯著(P<0.05)，灌胃了桔梗多糖的T2DM大鼠的FBG與模型組相比極顯著下降(P<0.01)，與陽性組間差異不顯著，說明桔梗多糖能有效緩解T2DM大鼠體重的下降，恢復其血糖水平。

表1 T2DM大鼠體重?Table 1 Body weight of T2DM rats g

表2 T2DM大鼠空腹血糖值?Table 2 Fasting blood glucose of T2DM rats mmol/L

2.4 對T2DM大鼠OGTT的影響

由圖3可知，經(jīng)桔梗多糖灌胃后，能夠提高T2DM大鼠的糖耐量，且高劑量組的糖耐量極顯著優(yōu)于模型組(P<0.01)。經(jīng)桔梗多糖灌胃后，可能調(diào)節(jié)了T2DM大鼠體內(nèi)對葡萄糖的攝取及利用，從而降低了其FBG水平，提高了機體的OGTT水平。劉丹奇等[21]研究指出，紅茶多糖、桑葉多糖和枸杞多糖均具有顯著的降血糖效果。

#與正常組相比差異顯著(P<0.05)，##與正常組相比差異極顯著(P<0.01)；*與模型組相比差異顯著(P<0.05)，**與模型組相比差異極顯著(P<0.01)圖3 桔梗多糖對T2DM大鼠OGTT的影響Figure 3 Effect of platycodon grandiflorum polysaccharide on OGTT of T2DM rats

2.5 對大鼠TC、TG、HDL-C、LDL-C的影響

由圖4可知，模型組TC、TG、HDL-C、LDL-C水平與正常組存在極顯著性差異(P<0.01)，經(jīng)桔梗多糖治療后能夠顯著改善TC、TG、HDL-C、LDL-C的水平(P<0.05)。這可能由于桔梗多糖經(jīng)體內(nèi)吸收后參與了T2DM大鼠的脂代謝，使TC、TG、LDL-C水平降低，HDL-C水平提高。殷亞楠[22]研究指出，薏苡多糖能夠改善T2DM大鼠的異常脂代謝，說明植物多糖具有調(diào)節(jié)異常脂代謝的作用，也更加確定桔梗多糖能夠改善T2DM大鼠異常脂代謝。

#與正常組相比差異顯著(P<0.05)，##與正常組相比差異極顯著(P<0.01)；*與模型組相比差異顯著(P<0.05)，**與模型組相比差異極顯著(P<0.01)圖4 桔梗多糖對T2DM大鼠TC、TG、HDL-C、LDL-C的影響Figure 4 The effect of platycodon grandiflorum polysaccharide on TC, TG, HDL-C, LDL-C in T2DM rats

2.6 對T2DM大鼠SOD、GSH、CAT、MDA的影響

由表3可知，與正常組相比，模型組中SOD、GSH、CAT含量均極顯著下降(P<0.01)，MDA含量極顯著升高(P<0.01)，經(jīng)桔梗多糖治療后可有效恢復T2DM大鼠的SOD、GSH、CAT水平，有效降低MDA水平，且與模型組相比，高劑量桔梗多糖組能夠極顯著提高SOD、GSH、CAT水平(P<0.01)，極顯著降低MDA水平(P<0.01)。孫廣平等[23]研究指出，紫蘇葉多糖能夠調(diào)節(jié)糖尿病小鼠體內(nèi)的氧化應激指標，具有抗糖尿病作用，并認為該作用可能與降低氧化應激水平有關，與試驗結(jié)果一致。由此推測，桔梗多糖可能是通過改善T2DM大鼠機體內(nèi)的氧化應激水平從而起到降血糖作用。

表3 T2DM大鼠SOD、GSH、CAT、MDA含量?Table 3 SOD, GSH, CAT, MDA content in T2DM rats

3 結(jié)論

試驗表明，桔梗多糖具有很好的抗氧化作用，并能夠?qū)?型糖尿病大鼠起到緩解體重下降、降低血糖、改善異常脂代謝以及改善機體氧化應激的作用，證實了桔梗多糖在體外的抗氧化作用，又補充了其在體內(nèi)的抗氧化作用，彌補了桔梗多糖在2型糖尿病研究方面的空白。后續(xù)可對桔梗多糖進行組分分離，并對其在動物蛋白以及細胞水平進行深入研究。