王 娜 張昊宇 寧燦燦 范允濤 王林青 余秋穎

(1. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州 450002；2. 鄭州市營(yíng)養(yǎng)與健康食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002；3. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部大宗糧食加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002；4. 北京豐森源林業(yè)科技有限公司，北京 102100；5. 鄭州師范學(xué)院分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450044)

艾草(Artemisiaargyi)，又稱艾蒿、香艾、冰臺(tái)等，為菊科多年生草本植物[1]，在中國(guó)已有2 000余年藥食兩用歷史。艾草主要化學(xué)成分包括揮發(fā)油類、黃酮類、三萜類、多糖以及微量元素[2-4]等。黃酮類物質(zhì)是艾草主要成分，天然植物中黃酮類物質(zhì)抗炎特性目前已有報(bào)道，黃酮類物質(zhì)作為有效的抗氧化劑，能夠清除機(jī)體內(nèi)的各類自由基并抑制其形成[5-7]。

常見(jiàn)的艾草總黃酮傳統(tǒng)提取工藝包括加壓溶劑法、浸提法、索氏抽提法等，但是艾草總黃酮得率相對(duì)較低(提取率≤6%)，且提取時(shí)間較長(zhǎng)[8-10]。近年來(lái)利用微波、超聲波及超聲—微波協(xié)同提取艾草活性物質(zhì)的研究已有報(bào)道[11-13]，但多數(shù)研究?jī)H關(guān)注艾草總黃酮得率，并未同時(shí)考察艾草黃酮抗氧化活性。研究擬以艾草總黃酮得率和抗氧化活性為考察指標(biāo)，優(yōu)化艾草黃酮的提取工藝條件以期為艾草黃酮進(jìn)一步的應(yīng)用研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

艾草：品種宛艾(一年貯存期內(nèi))，產(chǎn)地北京延慶，水分含量25%；

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥95.0%，北京索萊寶科技有限公司；

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥97.0%，福州飛凈生物科技有限公司；

無(wú)水乙醇：分析純，天津富宇精細(xì)化工有限公司；

亞硝酸鈉、硝酸鋁、硫酸亞鐵、水楊酸：分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠；

30%過(guò)氧化氫溶液：分析純，煙臺(tái)市雙雙化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：TU-1901型，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；

微孔板分光光度計(jì)：BioTek/epoc型，美國(guó)BioTek instruments公司；

微波光波超聲波萃取儀：Sientz-IIDM型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

高速多功能粉碎機(jī)：HC-200T型，武義海納電器有限公司；

臺(tái)式低速離心機(jī)：TD-5A型，湖南赫西離心機(jī)儀器有限公司；

電子分析天平：FA1204型，寧波力辰科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，置于50 mL容量瓶中，使用60%乙醇定容得到0.2 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別取0.0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液于10 mL具塞試管中，按照亞硝酸鈉—硝酸鋁—?dú)溲趸c法顯色后使用60%乙醇定容至10 mL，參照文獻(xiàn)[14]進(jìn)行線性關(guān)系考察，以蘆丁濃度(c)為橫坐標(biāo)，吸光度(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：A=12.666c+0.009 5，R2=0.999 2，在蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品濃度0.00～0.05 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.3.2 艾草黃酮提取方法選擇

(1) 超聲—微波輔助水提：參考王琴等[15]的方法，稍作修改。干艾草10.0 g，粉碎30 s，按m干艾草∶V水=1∶30 (g/mL)加去離子水，混勻，60 ℃水浴處理40 min后將料液置于微波光波超聲波萃取儀中，設(shè)置超聲功率460 W、超聲時(shí)間30 min、微波功率600 W、微波時(shí)間120 s，提取后將料液過(guò)濾，5 000 r/min離心10 min取上清液，得到艾草黃酮提取液。

(2) 超聲—微波輔助醇提：干艾草10.0 g，粉碎30 s，按m干艾草∶V乙醇=1∶30 (g/mL)加入體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶液，混勻，將樣品置于微波光波超聲波萃取儀中，設(shè)置超聲功率460 W、超聲時(shí)間30 min、微波功率600 W、微波時(shí)間120 s，提取后將料液過(guò)濾，5 000 r/min離心10 min 取上清液，得到艾草黃酮提取液[13]。

(3) 傳統(tǒng)煎煮：參考朱瑜等[16]的方法，稍作修改。干艾草10.0 g，粉碎30 s，按m干艾草∶V水=1∶30 (g/mL)加去離子水，混勻，將料液煮沸10 min后過(guò)濾，濾渣加入相同比例的水進(jìn)行二次煎煮，合并濾液，5 000 r/min離心10 min，得到艾草黃酮提取液。

(4) 水浴加熱提?。簠⒖监嵲普沟萚17]的方法，稍作修改。干艾草10.0 g，粉碎30 s，按m干艾草∶V水=1∶30 (g/mL)加去離子水，混勻，95 ℃水浴處理120 min后將料液過(guò)濾，5 000 r/min離心10 min，得到艾草黃酮提取液。

1.3.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì) 由于試驗(yàn)所用微波光波超聲波萃取儀處于恒溫模式的儀器無(wú)法恒定微波功率和工作時(shí)間，同時(shí)恒溫模式控溫不精準(zhǔn)。故提取過(guò)程中不對(duì)溫度進(jìn)行控制，艾草總黃酮提取液在提取結(jié)束后的溫度約為70～75 ℃。

(1) 超聲時(shí)間：取樣品10.0 g，固定超聲功率340 W，微波時(shí)間120 s，微波功率600 W，料液比1∶30 (g/mL)，考察超聲時(shí)間(20，25，30，35，40 min)對(duì)艾草總黃酮得率及抗氧化活性的影響。

(2) 超聲功率：取樣品10.0 g，固定超聲時(shí)間30 min，微波時(shí)間120 s，微波功率600 W，料液比1∶30 (g/mL)，考察超聲功率(220，280，340，400，460 W)對(duì)艾草總黃酮得率及抗氧化活性的影響。

(3) 微波時(shí)間：取樣品10.0 g，固定超聲時(shí)間30 min，超聲功率340 W，微波功率600 W，料液比1∶30 (g/mL)，考察微波時(shí)間(60，90，120，150，180 s)對(duì)艾草總黃酮得率及抗氧化活性的影響。

(4) 微波功率：取樣品10.0 g，固定超聲時(shí)間30 min，超聲功率340 W，微波時(shí)間120 s，料液比1∶30 (g/mL)，考察微波功率(300，400，500，600，700 W)對(duì)艾草總黃酮得率及抗氧化活性的影響。

(5) 料液比：取樣品10.0 g，固定超聲時(shí)間30 min，超聲功率340 W，微波時(shí)間120 s，微波功率600 W，考察料液比[1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50 (g/mL)]對(duì)艾草總黃酮得率及抗氧化活性的影響。

1.3.4 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì) 以單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)為基礎(chǔ)，將超聲時(shí)間、超聲功率、微波時(shí)間、微波功率和料液比5個(gè)試驗(yàn)因素分別設(shè)置高、低2個(gè)水平，以艾草總黃酮得率為響應(yīng)值，共設(shè)計(jì)12組試驗(yàn)，篩選出對(duì)艾草總黃酮得率影響較高的因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 以超聲功率、超聲時(shí)間和料液比3個(gè)對(duì)響應(yīng)值影響顯著的因素為自身變量，以艾草總黃酮提取率為響應(yīng)值，利用Design-Expert 12.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

1.3.6 艾草總黃酮得率測(cè)定 采用紫外分光光度法[14]測(cè)定總黃酮含量，按式(1)計(jì)算艾草總黃酮得率。

(1)

式中：

Y——艾草總黃酮得率，mg/g；

c——供試品溶液的艾草總黃酮濃度，mg/mL；

n——稀釋倍率；

V——艾草提取液體積，mL；

m——艾草質(zhì)量，g。

1.3.7 抗氧化活性指標(biāo)的測(cè)定

(1) 艾草總黃酮清除DPPH自由基能力：參考文獻(xiàn)[18]，按式(2)計(jì)算DPPH自由基清除率。

(2)

式中：

Q——DPPH自由基清除率，%；

Ai——2 mL樣品溶液+ 2 mL 0.1 mol/L DPPH溶液的吸光度；

Aj——2 mL樣品溶液+ 2 mL無(wú)水乙醇的吸光度；

Ac——2 mL無(wú)水乙醇+ 2 mL 0.1 mol/L DPPH溶液的吸光度。

(2) 艾草總黃酮清除羥自由基能力：參考文獻(xiàn)[19]，按式(2)計(jì)算羥自由基清除率。

(3)

式中：

Q——羥自由基清除率，%；

A1——2 mL 9 mmol/L FeSO4溶液+2 mL 9 mmol/L水楊酸—乙醇+2 mL 9 mmol/L H2O2+2 mL樣品溶液的吸光度；

A2——2 mL 9 mmol/L FeSO4溶液+2 mL 9 mmol/L水楊酸—乙醇+2 mL樣品溶液的吸光度；

A0——2 mL 9 mmol/L FeSO4溶液+2 mL 9 mmol/L水楊酸—乙醇+2 mL 9 mmol/L H2O2吸光度。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 22.0進(jìn)行方差分析；Design-Expert 12.0進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 艾草總黃酮提取方法選擇

預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，超聲提取法艾草總黃酮得率47.90 mg/g，DPPH自由基清除率79.81%，羥自由基清除率61.65%；微波提取法艾草總黃酮得率為42.53 mg/g，DPPH自由基清除率78.52%，羥自由基清除率53.64%，兩種提取方法的得率明顯偏低，抗氧化活性方面優(yōu)勢(shì)不明顯，故篩選艾草總黃酮提取方法時(shí)未將上述兩種提取方法納入比較。

由表1可知，各提取方法間艾草總黃酮得率有顯著性差異(P<0.05)，傳統(tǒng)煎煮法的艾草總黃酮得率最高，超聲—微波輔助水提法次之；水浴加熱提取法的DPPH自由基清除率最高，但與超聲—微波輔助水提法差異不顯著；超聲—微波輔助水提法的OH自由基清除率最高，且與其他方法差異顯著(P<0.05)。由于傳統(tǒng)煎煮法與水浴加熱提取法耗時(shí)較長(zhǎng)，同時(shí)綜合考慮黃酮得率及抗氧化活性，確定超聲—微波輔助水提法作為艾草總黃酮的理想提取方法，并優(yōu)化其提取工藝。

表1 提取方法對(duì)總黃酮得率與抗氧化活性的影響?Table 1 Effects of different extraction methods on flavonoid yield and antioxidant activity

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 超聲處理時(shí)間對(duì)總黃酮得率和抗氧化活性的影響

由表2可知，超聲時(shí)間30，40 min時(shí)艾草總黃酮得率和羥自由基清除率同其他組差異顯著(P<0.05)，超聲30 min 時(shí)DPPH自由基清除率最高且與其他組差異顯著(P<0.05)。綜合考慮，超聲時(shí)間選擇30 min。

表2 超聲時(shí)間對(duì)總黃酮得率和抗氧化活性的影響?Table 2 The effects of ultrasonic time on flavonoid yieldand antioxidant activity

2.2.2 超聲功率對(duì)總黃酮得率和抗氧化活性的影響 由表3可知，超聲功率340 W時(shí)艾草總黃酮得率最高，與其他組差異顯著(P<0.05)；超聲功率340，460 W的DPPH

表3 超聲功率對(duì)總黃酮得率和抗氧化活性的影響?Table 3 The effects of ultrasonic power on the yield and antioxidant activity

自由基清除率較高且二者差異不顯著。綜合考慮，超聲功率選擇340 W。

2.2.3 微波處理時(shí)間對(duì)總黃酮得率和抗氧化活性的影響

由表4可知，微波時(shí)間180 s時(shí)艾草總黃酮得率最高，微波時(shí)間120 s時(shí)次之。由于微波時(shí)間120 s時(shí)DPPH自由基與羥自由基清除率均最高，因此選擇微波時(shí)間120 s。

表4 微波處理時(shí)間對(duì)總黃酮得率和抗氧化活性的影響?Table 4 The effects of microwave treatment time on the yield and antioxidant activity

2.2.4 微波功率對(duì)總黃酮得率和抗氧化活性的影響 由表5可知，微波功率600 W時(shí)艾草總黃酮得率與DPPH自由基清除率最高，與其他組間差異顯著(P<0.05)。微波功率500，600 W的羥自由基清除率較高，且二者差異不顯著。綜合考慮，選擇微波功率600 W。

表5 微波功率對(duì)總黃酮得率和抗氧化活性的影響?Table 5 The effects of microwave power on the flavonoid yield and antioxidant activity

2.2.5 料液比對(duì)總黃酮得率和抗氧化活性的影響 由表6 可知，料液比1∶20 (g/mL)時(shí)艾草總黃酮得率最高，與其他各組間差異顯著(P<0.05)，料液比1∶30 (g/mL) 時(shí)次之。料液比1∶30 (g/mL)時(shí)DPPH自由基清除率和羥自由基清除率最高。綜合考慮，選擇料液比1∶30 (g/mL)。

表6 料液比對(duì)總黃酮得率和抗氧化活性的影響?Table 6 The effects of solid-liquid ratio on flavonoid yield and antioxidant activity

2.3 Plackett-Burman試驗(yàn)

Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表7、表8，試驗(yàn)結(jié)果方差分析見(jiàn)表9。

表7 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 7 Experimental design of Plackett-Burman design

表8 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果Table 8 Results of Plackett-Burman design

由表9可知，超聲時(shí)間、超聲功率和料液比3個(gè)因素對(duì)艾草總黃酮得率影響極顯著(P<0.01)，選擇以上3個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)試驗(yàn)。微波時(shí)間和微波功率兩個(gè)因素對(duì)艾草總黃酮提取影響較低，后續(xù)試驗(yàn)中將其固定為120 s和600 W。

表9 Plackett-Burman 試驗(yàn)結(jié)果方差分析表?Table 9 Analysis of variance of Plackett-Burman design

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.4.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表10。

表10 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平表Table 10 Factors and levels of response surface design

利用Design-Expert 12.0對(duì)表11的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和回歸分析，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行擬合。以超聲功率、超聲時(shí)間和料液比為自變量，擬合得到回歸方程：

表11 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 11 Experimental design and results of response surface design

Y=-549.88+3.08A+3.66B+4.12C-0.000 6AB+0.002 7AC+0.024BC-0.004 6A2-0.077B2-0.091C2。

(4)

表12 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果方差分析表?Table 12 Analysis of variance of response surface design

2.4.3 最佳工藝的修訂及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 通過(guò)Design-Expert 12.0得到最佳提取工藝為：超聲功率339.83 W、超聲27.08 min、料液比1∶31.14 (g/mL)，艾草總黃酮得率達(dá)到最大值87.70 mg/g?？紤]實(shí)際操作，工藝參數(shù)調(diào)整為：

料液比1∶30 (g/mL)、60 ℃水浴40 min、超聲功率340 W、超聲時(shí)間27 min、微波功率600 W、微波處理120 s，進(jìn)行3組平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，其艾草總黃酮得率均值為87.93 mg/g，與預(yù)測(cè)值(87.70 mg/g)相差0.03%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.61%，接近模型預(yù)測(cè)值，說(shuō)明預(yù)測(cè)模型可靠。

2.5 最佳工藝與傳統(tǒng)煎煮、水浴熱提取的比較

由表13可知，試驗(yàn)所得最佳提取工藝在艾草總黃酮得率和羥自由基清除率方面顯著優(yōu)于傳統(tǒng)煎煮法、水浴加熱提取法。

表13 最佳工藝與傳統(tǒng)方法的艾草總黃酮得率與抗氧化活性比較?Table 13 Comparison of flavonoid yield and antioxidant activity between optimal process and traditional process

3 結(jié)論

以艾草總黃酮得率、DPPH自由基清除率、羥自由基清除率為指標(biāo)，采用Plackett-Burman試驗(yàn)及響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化超聲—微波輔助水提工藝，結(jié)果表明，艾草黃酮的最佳提取工藝為60 ℃水浴40 min，超聲340 W處理27 min，微波600 W處理120 s，料液比1∶30 (g/mL)，此時(shí)艾草總黃酮得率可達(dá)87.93 mg/g，DPPH自由基清除率為80.84%，羥自由基清除率為77.92%，其艾草總黃酮得率和羥自由基清除率顯著優(yōu)于傳統(tǒng)煎煮和水浴加熱法。試驗(yàn)未進(jìn)一步探究艾草黃酮物質(zhì)組成及各組分生物活性，后續(xù)將以大孔樹(shù)脂純化艾草總黃酮后使用高效液相—質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)艾草總黃酮純度以及組成成分等進(jìn)行分析研究。