鐘菲菲 雷德卿 周金沙 劉 波 王子倩

(長沙市食品藥品檢驗所，湖南 長沙 410008)

人工合成甜味劑是一類應用較廣泛的食品添加劑，主要有糖精鈉、安賽蜜、阿斯巴甜、愛德萬甜、甜蜜素、三氯蔗糖等[1]。過量攝入人工合成甜味劑可能損害人的肝臟、神經(jīng)、消化系統(tǒng)，甚至引發(fā)癌癥[2-4]，嬰幼兒更容易受到不可逆損傷[5]。

食品中人工合成甜味劑檢測手段較多[4,6]，主要有毛細管電泳法[7]、離子色譜法[8]、氣相色譜法[9]、高效液相色譜法[10-13]、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[14-16]等。毛細管電泳法及離子色譜法靈敏度低，重現(xiàn)性差，易受樣品中其他組分干擾；氣相色譜法通常需要柱前衍生化，操作較繁瑣；高效液相色譜—質(zhì)譜法儀器昂貴，且受樣品基質(zhì)影響明顯。目前食品國家安全標準主要是檢測單組分的甜味劑，往往一個方法適用于一種組分，同時檢測多種非法添加食品甜味劑的方法尚未見諸于報道。因此，亟需建立一種準確簡單的方法同時測定多種人工合成甜味劑。

小兒止咳糖漿以藥食同源的甘草和桔梗等為原料，處方中蔗糖含量為65 g/100 mL[17]。但藥用輔料蔗糖來源于天然產(chǎn)物，價格昂貴，因此一些商家為降低成本使用糖精鈉等人工合成甜味劑替代蔗糖。研究擬以小兒止咳糖漿為例，在探索前處理方法的基礎上，建立高效液相色譜法同時測定藥品糖漿劑中安賽蜜、糖精鈉、阿斯巴甜、愛德萬甜4種食品甜味劑，以期為食品甜味劑安全研究和風險評估提供參考，為科學監(jiān)管提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腈：色譜純，批號JA110130，美國默克公司；

甲醇：色譜純，批號L1147507 117，德國默克公司；

超純水：自制并經(jīng)檢測符合規(guī)定；

小兒止咳糖漿樣品：來源于21家生產(chǎn)企業(yè)共45批次；

安賽蜜標準品：純度99.4%，批號G1012337，德國Dr. Ehrenstorfer公司；

糖精鈉標準品：純度86.2%，批號510208-202001，德國Dr. Ehrenstorfer公司；

阿斯巴甜標準品：純度95.0%，批號510206-202001，德國Dr. Ehrenstorfer公司；

愛德萬甜標準品：純度97.0%，批號102278222，德國Dr. Ehrenstorfer公司。

1.2 主要儀器設備

高效液相色譜儀：Waters alliance e2695型，美國Waters公司；

電子分析天平：METTLER XS205DU型，瑞士梅特勒—托利多公司；

純化水系統(tǒng)：Millipore Milli-Q Direct 8型，美國密理博公司。

1.3 方法

1.3.1 液相色譜條件 色譜柱為Shiseido AQ-C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm)，以乙腈為流動相A，以0.02 mol/L磷酸二氫銨(用三乙胺調(diào)節(jié)pH值至5.5)為流動相B，梯度洗脫(洗脫程序：0 min，2% A，98% B；10 min，5% A，95% B；30 min，45% A，55% B；40 min，45% A，55% B；41 min，2% A，98% B；50min，2% A，98% B)，流速1.0 mL/min，柱溫35 ℃，檢測波長214 nm，進樣量10 μL。

1.3.2 供試品溶液的制備 精密量取糖漿劑樣品1 mL，置10 mL容量瓶中，加50%甲醇適量，搖勻，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即可。

1.3.3 對照品溶液的制備 精密稱取安賽蜜25.39 mg，糖精鈉28.88 mg，阿斯巴甜26.27 mg，愛德萬甜25.21 mg，置25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液(每1 mL含各組分約為1 mg)。精密量取貯備液0.2，0.5，1，1，1，1 mL分別置100，100，100，50，20，10 mL容量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為標準曲線工作溶液，每1 mL含各組分約為2，5，10，20，50，100 μg。

1.3.4 樣加標溶液的制備 因無實際樣品同時含安賽蜜、糖精鈉、阿斯巴甜、愛德萬甜4種組分，取一批樣品45 mL，加上述貯備液5 mL，渦旋混勻，其余按2.2項同法操作，作為樣加標溶液(每1 mL含各組分約為100 μg)，備用。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理方法優(yōu)化

比較乙腈、水、10%甲醇、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、90%甲醇、甲醇作為稀釋劑的效果。其中：用乙腈作為稀釋劑時，樣品不能均勻分散，明顯成團；用水、10%甲醇、30%甲醇作為稀釋劑，振搖時產(chǎn)生大量氣泡，久置不散；用50%以上甲醇溶液作稀釋劑，能均勻分散，沒有或產(chǎn)生少量氣泡，靜置即散。由于初始流動相中水相比例高，當樣品溶液有機相濃度過高易引起溶劑效應，故選擇50%甲醇作為稀釋劑。

2.2 色譜條件優(yōu)化

2.2.1 pH 調(diào)節(jié)流動相pH值分別為4.5，5.5，6.5，7.5，結(jié)果表明pH值5.5時峰形對稱，分離效果良好。4種目標物分子中均含有仲氨基團，愛德萬甜和阿斯巴甜分子中含有羧基，糖精鈉和甜蜜素分子中含磺酸基，均呈現(xiàn)酸堿兩性，在強酸或強堿環(huán)境下，分子主要呈解離態(tài)，峰形拖尾嚴重，弱酸條件下，分子主要呈游離態(tài)，峰形良好，故選擇pH值5.5。

2.2.2 磷酸二氫銨濃度 比較了流動相中不同磷酸二氫銨濃度(0.005，0.010，0.020，0.050，0.100 mol/L)下的峰形和分離效果，結(jié)果：0.005,0.010 mol/L的分離效果和峰形均較差，0.020,0.050,0.100 mol/L的分離效果和峰形均良好，考慮鹽濃度過高對儀器和色譜柱的損傷，故選擇0.020 mol/L的磷酸二氫銨。

2.2.3 色譜柱型號 考察4個品牌型號的色譜柱(Waters symmetry-C18、Agilent TC-C18、Inerstil ODS-SP-C18、Shiseido AQ-C18，規(guī)格均為4.6 mm×250 mm, 5 μm)對分離效果的影響，分離效果均良好，由于AQ-C18柱耐高水相，建議選用。

2.2.4 流速 比較丁流動相流速對峰形和分離效果。結(jié)果表明：流動相流速過低，縱向分子擴散嚴重，影響峰形和分離效能，提高流速可以有效減少縱向分子擴散，改善峰形提高分離效能；但流速過高，會增加傳質(zhì)阻力，降低分離效能，且會增加柱壓損壞色譜柱。其他條件不變，流速在0.8～1.2 mL/min范圍內(nèi)，縱向分子擴散與傳質(zhì)阻力達到較好的平衡狀態(tài)，4種待測組分分離良好。

2.2.5 柱溫 考察了柱溫(30,35,40 ℃)對色譜分離效果的影響，結(jié)果顯示在試驗范圍內(nèi)柱溫對分離效果、保留時間、峰形、柱壓影響不大。提高柱溫，雖然可以減少流動相黏滯性，但對于降低傳質(zhì)阻力作用并不明顯，而4種待測組分熱穩(wěn)定性好，無需控制低溫，因此無需嚴格控制柱溫，建議使用柱溫箱保持柱溫恒定即可。

2.3 線性范圍、檢出限與定量限

取標準曲線工作溶液，按1.3.1的色譜條件測定4個組分，以質(zhì)量濃度(mg/L)為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)繪制標準曲線。安賽蜜、糖精鈉、阿斯巴甜、愛德萬甜4種組分在質(zhì)量濃度為2～100 mg/L范圍內(nèi)線性關系良好，相關系數(shù)R2均大于0.999。以信噪比S/N=3計算檢出限，S/N=10計算定量限，4種組分線性范圍與檢測限見表1。由表1可知，檢出限和定量限均較低，可見該法靈敏度較好。

表1 4種組分線性范圍與檢測限Table 1 Linearity range and detection limit of four components (n=6)

2.4 專屬性

取經(jīng)檢測不含4種待測成分的小兒止咳糖漿樣品溶液、樣加標溶液、混合對照品溶液，按1.3.1的色譜條件進樣檢測，結(jié)果如圖1所示，4種組分峰形對稱，分離良好，保留時間合適，樣品中其他成分沒有干擾。

2.5 精密度試驗

取混合對照品溶液，連續(xù)進樣6次，結(jié)果見表2，4種組分RSD均小于4%(n=6)，說明儀器精密度良好。

表2 精密度試驗 Table 2 The test of precision (n=6)

2.6 穩(wěn)定性試驗

取樣加標溶液，在0，2，4，8，12，16，20， 24 h進樣，平行進2針，以2針的平均峰面積計算，結(jié)果見表3，RSD均小于4%(n=8)，說明供試品溶液至少在24 h內(nèi)穩(wěn)定，制備后24 h內(nèi)進樣分析不影響結(jié)果。

表3 穩(wěn)定性試驗Table 3 The test of stability (n=8)

2.7 重復性試驗

取樣品(批號：170403)，按1.3.2的方法平行制備供試品溶液6份，按1.3.1的色譜條件測定，結(jié)果表明所建立方法重復性良好(見表4)。

表4 重復性試驗Table 4 The test of repeatability (n=6)

2.8 回收率試驗

精密量取供試品(批號：170403)1 mL，置10 mL容量瓶中，平行量取9份，分為高、中、低3個組，高、中、低組分別精密加入100 μg/mL的混合對照品溶液1.2，1.0，0.8 mL，置振蕩器混勻，按1.3.2的方法制備供試品溶液。

1. 安賽蜜 2. 糖精鈉 3. 阿斯巴甜 4. 愛德萬甜圖1 4種目標物的色譜圖Figure 1 Chromatogram of 4 kinds of target compounds

精密量取10 μL供試品溶液注入液相色譜儀，依法測定，按式(1)計算回收率。

(1)

式中：

p——回收率，%；

m1——測得加標樣品中待測組分的質(zhì)量，μg；

m2——樣品中含待測組分的質(zhì)量，μg；

m0——加入待測組分標準物質(zhì)的質(zhì)量，μg。

由表5可知，安賽蜜、糖精鈉、阿斯巴甜、愛德萬甜平均回收率分別為98.65%，104.09%，100.96%，102.30%，RSD分別為1.4%，0.8%，1.4%，1.7%(n=9)，說明所建立的方法回收率良好，準確度高。

表5 回收率試驗Table 5 The test of recovery (n=9)

2.9 樣品測定

按1.3.2的樣品制備方法和1.3.1的下色譜條件，測定45批次樣品，對樣品中出現(xiàn)與對照品保留時間一致的色譜峰，進行純度測試和光譜指數(shù)圖一致性比較，能通過純度測試且與相應對照品光譜指數(shù)圖一致，判定為檢出，其中3批次檢出愛德萬甜，2批次檢出阿斯巴甜和愛德萬甜，結(jié)果見表6，其他均未檢出。

表6 樣品測定結(jié)果Table 6 The results of sample determination mg/L

3 結(jié)論

建立了糖漿劑藥品中人工合成甜味劑含量測定方法，該方法可同時測定安賽蜜、糖精鈉、阿斯巴甜、愛德萬甜4種組分，專屬性好、準確可靠、操作簡單、線性范圍寬，可用于糖漿劑質(zhì)量安全監(jiān)測。下一步將繼續(xù)探索液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用定性方法，以液相色譜定量結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用定性建立補充檢驗方法監(jiān)測糖漿劑藥品中非法添加人工合成甜味劑。