陳彩雯 田佳寧 于坤正 李丹丹

(1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095；2. 濟寧賽寶工業(yè)信息技術(shù)研究院，山東 濟寧 272000)

淀粉，除了作為人類和動物的食物之外，絕大部分通過酶法或化學(xué)法轉(zhuǎn)化為淀粉水解物、葡萄糖漿、果糖糖漿和麥芽糊精等高附加值產(chǎn)品[1-2]。工業(yè)上使用的淀粉原料多數(shù)是支鏈淀粉與直鏈淀粉的混合物，其中支鏈淀粉含量一般在75%～85%。直鏈淀粉是主要由α-1,4-糖苷鍵形成的線性聚合物，支鏈淀粉則由約95%的α-1,4-糖苷鍵和約5%的α-1,6-糖苷鍵形成的多分支結(jié)構(gòu)構(gòu)成[3]。因此，為了徹底水解淀粉，通常需要多種淀粉酶的協(xié)同作用。其中，葡萄糖淀粉酶既能水解α-1,4-糖苷鍵又能水解α-1,6-糖苷鍵，但其水解α-1,6-糖苷鍵的速率較慢，從而造成淀粉質(zhì)原料利用率及產(chǎn)品品質(zhì)的下降。而普魯蘭酶能夠?qū)Ｒ恍缘厍虚_支鏈淀粉中的α-1,6-糖苷鍵，加速α-1,6-糖苷鍵的水解，實現(xiàn)原料利用率的提高及產(chǎn)品品質(zhì)的改善[4-5]。因此，普魯蘭酶逐漸成為淀粉加工中不可或缺的關(guān)鍵酶制劑，被廣泛應(yīng)用在淀粉糖加工、改性淀粉、醫(yī)藥、飼料、啤酒及白酒釀造等工業(yè)中，尤其是作為淀粉加工中的非大宗關(guān)鍵酶制劑，在工業(yè)應(yīng)用方面有重大價值及大量需求[6-7]。

電場作為食品處理的常用物理方式，可以改善淀粉的理化性質(zhì)和微觀結(jié)構(gòu)，作為淀粉常壓干法改性的方法，具有重要的工業(yè)應(yīng)用潛力[8]。同時，其特有的電學(xué)特性在淀粉改性和酶活性調(diào)控方面表現(xiàn)出了高適應(yīng)現(xiàn)象[9]。Samaranayake等[10]發(fā)現(xiàn)，60 ℃條件下1 V/cm電場處理后，α-淀粉酶活性可增加41%。Durham等[11]發(fā)現(xiàn)，30 ℃條件下，8～12 V/cm電場處理后，纖維素的酶解速率常數(shù)可增加49%～164%。Ohshima等[12]發(fā)現(xiàn)，與傳統(tǒng)水浴加熱相比，低強度脈沖電場在相同加熱速率時，可提高酶活性5%～20%。與菌株篩選、基因工程菌株構(gòu)建等復(fù)雜方法相比，電場處理具有操作簡單、容易實現(xiàn)的優(yōu)點。然而現(xiàn)有研究中，未見關(guān)于電場處理對普魯蘭酶活力影響的報道，其作用機制不明。研究擬以糯米淀粉為原料，通過掃描電子顯微鏡、X-射線衍射儀、差示掃描量熱儀和快速黏度儀等技術(shù)對電場作用下糯米淀粉酶解效率、酶解淀粉的顆粒形貌、結(jié)晶性質(zhì)和熱特性等進行研究，并在此基礎(chǔ)上探究電場處理對普魯蘭酶活力(不加淀粉)以及淀粉結(jié)構(gòu)性質(zhì)(不加酶)的影響，從而解析電場影響普魯蘭酶水解糯米淀粉的機制，為電場技術(shù)在淀粉酶法改性領(lǐng)域的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糯米淀粉：食品級，淀粉含量95%以上，其中支鏈淀粉含量達98%，安徽蚌埠市兄弟糧油食品有限公司；

普魯蘭酶：1 U/mg，上海源葉生物試劑有限公司；

DNS試劑：分析純，上海源葉生物試劑有限公司；

醋酸、醋酸鈉、鹽酸、氫氧化鈉等：分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

單相輸出500VA變頻電源：KHD-1100型，寧波凱華德電子科技有限公司；

紫外可見分光光度計：HP 33120A型，南京菲勒儀器有限公司；

掃描電子顯微鏡：EVO-LS10型，德國卡爾·蔡司股份有限公司；

X射線衍射儀：D2 PHASER型，美國Bruker儀器公司；

差氏掃描量熱儀：Q20型，美國TA儀器公司；

快速黏度分析儀：RVA 4500型，澳大利亞Perten公司；

冷凍干燥機：FreeZone型，美國Lanconco公司；

高速離心機：GL-20G-H型，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 電場處理對普魯蘭酶水解糯米淀粉的影響 利用乙酸鈉緩沖液(0.04 mol/L，pH 4.4)配制0.06 g/mL的普魯蘭酶溶液，并取20 mL加入2.0 g糯米淀粉，磁力攪拌30 s，50 ℃恒溫水浴，插入電極片(電極尺寸10 mm×10 mm×2 mm)，打開交變電源(正弦)進行電場處理：電場強度分別為0.0，2.5，5.0，7.5，10.0，12.5 V/cm；電場頻率50 Hz；處理時間20 min。處理后，加入2 mol/L NaOH溶液調(diào)整pH至11.0滅酶，再加入2 mol/L HCl溶液中和。3 500 r/min離心10 min，所得沉淀物經(jīng)80%乙醇洗滌3次(每次100 mL)，凍干備用；利用DNS法測定上清液中還原糖含量。

1.3.2 電場處理對普魯蘭酶活力的影響(不加淀粉) 利用乙酸鈉緩沖液(0.04 mol/L，pH 4.4)配制0.06 g/mL的普魯蘭酶溶液，并取20 mL，50 ℃恒溫水浴，電場強度分別為0.0，2.5，5.0，7.5，10.0，12.5 V/cm；電場頻率50 Hz；處理時間20 min，測定酶活力。

1.3.3 電場處理對淀粉結(jié)構(gòu)性質(zhì)的影響(不加酶) 準確稱取2.0 g糯米淀粉于20 mL乙酸鈉緩沖液(0.04 mol/L，pH 4.4)中，混勻，50 ℃恒溫水浴，電場強度分別為0.0，2.5，5.0，7.5，10.0，12.5 V/cm；電場頻率50 Hz；處理時間20 min，3 500 r/min離心10 min。所得沉淀物經(jīng)80%乙醇洗滌3次(每次100 mL)，凍干備用。

1.3.4 還原糖含量測定 采用DNS法[13]。

1.3.5 酶活力測定 參照龍杰[5]的方法。

1.3.6 掃描電鏡觀察(SEM) 用牙簽將淀粉及其酶解產(chǎn)物均勻分散至雙面導(dǎo)電膠帶上(雙面導(dǎo)電膠帶固定于載物臺上)，用洗耳球吹去粘結(jié)不牢的粉末，真空噴金，觀察淀粉及其酶解產(chǎn)物的表面形態(tài)(加速電壓5 000 V，放大倍數(shù)5 000)。

1.3.7 X-射線衍射分析(XRD) 參照Li等[14]的方法。Cu Kα輻射，管壓40 kV，管流40 mA，掃描速度4 (°)/min，掃描范圍(2θ)4°～40°，步長0.028，接受狹縫0.2 mm。利用MDI Jade 6.5軟件分析譜圖，分析結(jié)晶晶型并按式(1)計算相對結(jié)晶度。

(1)

式中：

Rc——相對結(jié)晶度，%；

Ac——結(jié)晶區(qū)含量，%；

Aa——無定形區(qū)含量，%。

1.3.8 差示掃描量熱分析(DSC) 參照Li等[15]的方法。

1.3.9 快速黏度分析(RVA) 參照AACC 76-21。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗重復(fù)3次取平均值。采用Origin 8.6軟件繪圖，SPSS 21.0軟件進行顯著性分析。P<0.05代表差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 電場處理對普魯蘭酶水解糯米淀粉的影響

由圖1可知，當電場強度為0.0～2.5 V/cm時，還原糖含量從0.50 g/L增加至0.53 g/L；但之后隨著電場強度的進一步增加，還原糖含量逐漸降低；當電場強度為5.0，7.5 V/cm時，還原糖含量大于空白對照組，當電場強度為10.0，12.5 V/cm時，還原糖含量低于空白對照組。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖1 電場強度對還原糖含量的影響Figure 1 Effect of the intensity of the electric field on the content of reducing sugar

研究[9,12]表明，低強度電場處理可改善酶活性，酶活性的增加可降低反應(yīng)的活化能，有利于酶促反應(yīng)的進行；而高強度電場處理會嚴重破壞酶分子的結(jié)構(gòu)，使酶鈍化。Barba等[16]發(fā)現(xiàn)，只有電場強度達到臨界值(Ec)才可引起蛋白分子的極化：低強度作用下，蛋白分子沿著電場方向有序排列，但其結(jié)構(gòu)變化較??；中強度電場可誘導(dǎo)蛋白分子極化，其內(nèi)部的疏水基團外露；但隨著電場強度進一步增加，極化蛋白分子間通過疏水相互作用絡(luò)合，與試驗結(jié)果高度契合。

2.2 電場輔助酶解對淀粉顆粒結(jié)構(gòu)的影響

由圖2可知，天然糯米淀粉顆粒形狀不規(guī)則，大部分顆粒尺寸為4～5 μm，與Li等[17]的結(jié)果一致。經(jīng)普魯蘭酶處理后，淀粉顆粒表面出現(xiàn)孔洞或裂縫，部分大顆粒被降解為小的片段，且小的片段間可能發(fā)生粘附。當電場強度為0.0 V/cm時，淀粉顆粒表面處有許多的裂縫和孔洞；當電場強度為2.5 V/cm時，由于酶解程度的增加，淀粉顆粒破壞增加，小的碎片發(fā)生聚集，形成了大顆粒；隨著電場強度的進一步增加，淀粉酶解程度降低，淀粉表面依然存在裂縫和孔洞，但數(shù)目和尺寸減少。淀粉顆粒表面孔洞數(shù)目和尺寸的增加，將極大地提高淀粉的比表面積，有利于運載功能性成分和用作吸附劑[18-19]。低電場強度時，淀粉表面會出現(xiàn)孔洞和裂縫，酶解產(chǎn)物可用作多孔淀粉；而高電場強度時，淀粉顆粒結(jié)構(gòu)被完全破壞，產(chǎn)物不能用作吸附劑使用[17]。當電場強度為12.5 V/cm時，淀粉依然維持原有的顆粒結(jié)構(gòu)，但表面孔洞和裂縫增加，是由于試驗溫度固定為50 ℃，消除了電場熱效應(yīng)影響的緣故[20]。

圖2 電場輔助酶解對糯米淀粉掃描電鏡圖像的影響Figure 2 Effect of the electro-assisted hydrolysis on the SEM image of waxy rice starch

2.3 電場輔助酶解對淀粉結(jié)晶結(jié)構(gòu)的影響

由圖3可知，原糯米淀粉在15.02°，17.02°，18.08°，23.08°處出現(xiàn)衍射峰，屬于典型的A型淀粉，與Li等[17]的結(jié)果一致。電場輔助酶解后，糯米淀粉的結(jié)晶晶型未發(fā)生顯著變化，但酶解淀粉的相對結(jié)晶度均高于原糯米淀粉。隨著電場強度從0.0 V/cm增加至2.5 V/cm，糯米淀粉的相對結(jié)晶度從42.39%增加至49.66%；但隨著電場強度的進一步增加，相對結(jié)晶度逐漸降低。淀粉顆粒是由疏松的無定形層和致密的結(jié)晶層交替排列形成的半剛性結(jié)構(gòu)。在酶解過程中，酶分子優(yōu)先水解疏松的無定形層，從而導(dǎo)致淀粉相對結(jié)晶度增加。Han等[21-23]發(fā)現(xiàn)，電場處理可破壞淀粉的顆粒和半結(jié)晶結(jié)構(gòu)，從而造成淀粉相對結(jié)晶度降低。

圖3 電場輔助酶解對糯米淀粉X-射線衍射圖譜和相對結(jié)晶度的影響Figure 3 Effect of the electro-assisted hydrolysis on the XRD pattern and relative crystallinity of waxy rice starch

2.4 電場輔助酶解對淀粉熱特性的影響

由圖4可知，原糯米淀粉的DSC曲線上出現(xiàn)了兩個吸熱峰，第一個顯著的吸熱峰為支鏈淀粉熔融峰，第二個較微弱的吸熱峰則歸因于熱穩(wěn)定的直鏈淀粉—脂質(zhì)復(fù)合物的熔化。一般情況下，淀粉相對結(jié)晶度增加代表淀粉結(jié)構(gòu)有序性增加，破壞其結(jié)構(gòu)所需要的能量會增加，體現(xiàn)在DSC曲線上即為糊化溫度和焓值的增加。Abdorreza等[24]報道，西米淀粉的糊化溫度和焓值隨酸解程度的增加而增加。由表1可知，隨著電場強度的增加，糯米淀粉的To、Tp逐漸增加，但焓值變化不明顯。這可能是電場加快了非結(jié)晶區(qū)的酶解效率，對結(jié)晶區(qū)破壞較小，焓值不變而糊化溫度小幅度升高；其次，電場加快了支鏈部分的酶解，使直鏈淀粉比例增加，也會導(dǎo)致糊化溫度增加。此外，糯米淀粉中含有少量的直鏈淀粉，該直鏈淀粉可與脂肪形成脂質(zhì)復(fù)合物，脂質(zhì)復(fù)合物的熱穩(wěn)定性較高，通常出現(xiàn)在80 ℃左右。隨著酶解的進行，第2個吸熱峰位置和焓值并未發(fā)生顯著變化，說明直鏈淀粉—脂質(zhì)復(fù)合物的含量未發(fā)生明顯變化。

圖4 電場輔助酶解對糯米淀粉DSC曲線的影響Figure 4 Effect of the electro-assisted hydrolysis on the DSC curves of waxy rice starch

表1 電場輔助酶解對糯米淀粉DSC參數(shù)的影響?Table 1 Effect of the electro-assisted hydrolysis on the DSCparameters of waxy rice starch

2.5 電場輔助酶解對淀粉糊化特性的影響

由圖5和表2可知，淀粉酶解后，淀粉顆粒表面被破壞，吸水膨脹能力受限，淀粉糊的峰值黏度、谷值黏度、崩解值和最終黏度均降低。酶解程度越大，黏度降低越多。經(jīng)2.5 V/cm電場輔助酶解后，淀粉糊黏度下降最多，峰值黏度從原淀粉的1 852 mPa·s降低至1 153 mPa·s，崩解值從616 mPa·s降低至324 mPa·s；而經(jīng)12.5 V/cm電場處理后，淀粉糊黏度僅降低了126 mPa·s，崩解值減少了292 mPa·s，與還原糖結(jié)果一致。Polesi等[25]和Ahmed等[26]研究發(fā)現(xiàn)，隨著水解程度的增加，淀粉糊黏度逐漸降低。淀粉回生值主要與直鏈淀粉的泄露及重新聚集有關(guān)。研究[27]表明，淀粉的改性會導(dǎo)致淀粉分子排列的規(guī)整性降低。酶解淀粉的回生值均低于原淀粉，是由于普魯蘭酶水解α-1，6-糖苷鍵，切除支鏈后的淀粉分子排列規(guī)整性降低，原本的有序結(jié)構(gòu)受到影響，直鏈淀粉重新締合的速率減慢，回生值減小，與劉程玲等[28]的結(jié)果相似。同時，淀粉損傷程度的增加將會導(dǎo)致淀粉糊化溫度的降低[29]。與原糯米淀粉相比，酶解淀粉的糊化溫度略有上升，可能與酶解過程中優(yōu)先水解無定形層導(dǎo)致的淀粉相對結(jié)晶度增加有關(guān)。

表2 電場輔助酶解對糯米淀粉RVA參數(shù)的影響?Table 2 Effect of the electro-assisted hydrolysis on the RVAparameters of waxy rice starch

圖5 電場輔助酶解對糯米淀粉RVA曲線的影響Figure 5 Effect of the electro-assisted hydrolysis on the RVA curves of waxy rice starch

2.6 電場影響普魯蘭酶水解糯米淀粉的可能機制

由圖6(a)可知，當電場強度從0.0 V/cm增加到5.0 V/cm時，相對酶活性從100%增加到116%；但隨著電場強度的進一步增加，普魯蘭酶活性迅速降低。電場作用下，普魯蘭酶活性的變化趨勢與淀粉酶解效率一致，說明試驗條件下，酶活性的變化可能是導(dǎo)致淀粉酶解效率變化的主導(dǎo)因素。然而，在利用電場強化α-淀粉酶水

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖6 電場影響普魯蘭酶水解糯米淀粉的可能機制Figure 6 Possible mechanism of the electro-assisted hydrolysis of waxy rice starch in the presence of pullulanase

解玉米淀粉的試驗中，電場對淀粉酶解效率的影響與α-淀粉酶活力的變化趨勢并不一致，而淀粉結(jié)構(gòu)變化對電場強化淀粉酶解效率的影響極為顯著[17]。這可能是由于前期試驗條件中，未控制電場處理的溫度且緩沖液濃度較高(0.2 mol/L)，隨著電場強度和處理時間的增加，淀粉酶解液的溫度逐漸上升，淀粉顆粒結(jié)構(gòu)被部分破壞，淀粉分子從顆粒內(nèi)部泄露，與淀粉酶間的親和力增加。而該試驗中，處理溫度控制在50 ℃且緩沖液濃度低(0.04 mol/L)，電場熱效應(yīng)可忽略。

淀粉顆粒和結(jié)晶結(jié)構(gòu)的微小破損即可顯著影響淀粉的吸水膨脹，從而導(dǎo)致淀粉糊黏度的降低。為了進一步明確電場對普魯蘭酶水解糯米淀粉的作用機理，測定了電場作用下淀粉的糊化性質(zhì)變化(不加普魯蘭酶)。由圖6(b)可知，不同電場處理后，淀粉的糊化曲線近乎重疊，證實電場處理并未能對糊化結(jié)構(gòu)性質(zhì)造成顯著影響。因此，試驗條件下，電場作用下淀粉結(jié)構(gòu)性質(zhì)變化可能并非是影響普魯蘭酶水解糯米淀粉效率的關(guān)鍵因素。但值得注意的是，由于電場擁有物質(zhì)所具有的力和能量的客觀屬性，會對處于其中的物質(zhì)產(chǎn)生力及能量的作用[30]。因此，電場作用于酶解反應(yīng)時，可能會賦予淀粉酶解中間產(chǎn)物(碳正離子)反應(yīng)基團動能，使官能團中的原子和電荷活躍度更高，更易參加反應(yīng)。

3 結(jié)論

探究了不同強度電場作用下糯米淀粉水解效率、普魯蘭酶活力、糯米淀粉結(jié)構(gòu)性質(zhì)的變化規(guī)律。結(jié)果表明，強度≤2.5 V/cm的電場可改善普魯蘭酶的活力，從而加速糯米淀粉的酶解速率；強度≥5 V/cm的電場則導(dǎo)致酶活力的降低，酶解效率降低。隨著酶解的進行，淀粉顆粒表面逐漸出現(xiàn)孔洞、裂縫、破裂及小片段的聚集等現(xiàn)象。電場輔助酶解不會改變淀粉的結(jié)晶晶型，但相對結(jié)晶度增加；且酶解程度越高，相對結(jié)晶度越大。電場輔助酶解后，糯米淀粉第1個糊化峰的起始溫度增加，但第2個糊化峰的起始溫度以及糊化焓均未發(fā)生顯著變化。淀粉的峰值黏度、谷值黏度、終點黏度、崩解值和回生值經(jīng)酶解后均顯著降低，且酶解程度越高，黏度下降越多。試驗條件下，電場對淀粉結(jié)構(gòu)性質(zhì)的影響不顯著，說明電場對普魯蘭酶水解糯米淀粉的作用主要與酶活力的變化相關(guān)。而對于電場處理影響普魯蘭酶活性的原因尚不清楚，還需進一步研究。