曾秋霞，黃敏興*，鄭冰儀，高裕鋒，程巧云，楊李勝，劉志鵬

(1廣東省科學(xué)院生物與醫(yī)學(xué)工程研究所，廣東 廣州 510316；2中國輕工業(yè)甘蔗制糖工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510316)

0 引言

甘蔗作為全球主要的糖料作物，是食糖生產(chǎn)的重要原料[1]。甘蔗的生長過程中容易受到病蟲草害的影響[2]，從而降低甘蔗的產(chǎn)量和質(zhì)量，直接影響食糖生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益[3]。為了提高甘蔗的產(chǎn)量和質(zhì)量，使用除草劑、殺菌劑等農(nóng)藥成為防治病蟲草害的重要手段，其中苯酰胺類農(nóng)藥是普遍施用的農(nóng)藥之一。苯酰胺類農(nóng)藥是具有酰胺結(jié)構(gòu)的芳香類化合物，用途較廣，特別是苯酰胺類除草劑和殺菌劑，因其具有選擇性好、高效低毒且價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，在國內(nèi)外獲得廣泛應(yīng)用[4]。雖然施用苯酰胺類農(nóng)藥對(duì)甘蔗的種植增收起到了非常重要的作用，但是錯(cuò)用、濫用農(nóng)藥所引發(fā)的農(nóng)藥殘留超標(biāo)問題會(huì)嚴(yán)重影響甘蔗及其制品的質(zhì)量安全，殘留在甘蔗中的農(nóng)藥通過食物鏈富集和傳遞進(jìn)入人體，對(duì)人類健康造成潛在威脅[5-6]。因此，建立甘蔗中苯酰胺類農(nóng)藥殘留的檢測方法，對(duì)加強(qiáng)甘蔗中苯酰胺類農(nóng)藥殘留的監(jiān)測具有重要意義。

目前關(guān)于酰胺類除草劑和殺菌劑的檢測方法較多，有氣相色譜法[7]、氣相色譜質(zhì)譜法[8]、液相色譜質(zhì)譜法[9]等，但是同時(shí)測定多種苯酰胺類農(nóng)藥殘留的方法較少，楊曉鳳等[10]應(yīng)用凝膠滲透色譜凈化-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定大豆中23種酰胺類除草劑殘留量，而利用氣相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜法測定甘蔗中苯酰胺類農(nóng)藥殘留則鮮見報(bào)道。氣相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜法選擇性高，定性定量準(zhǔn)確，能有效降低背景噪音和基質(zhì)干擾，被廣泛應(yīng)用于復(fù)雜樣品的農(nóng)藥殘留檢測[11]。甘蔗中富含蔗糖、果糖、色素等，基質(zhì)復(fù)雜，基體干擾大，利用QuEChERS技術(shù)能有效去除雜質(zhì)干擾，且前處理過程簡單，成本低廉。

鑒于此，本文應(yīng)用QuEChERS法結(jié)合氣相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜技術(shù)同時(shí)測定甘蔗中22種苯酰胺類農(nóng)藥殘留，為甘蔗中苯酰胺類農(nóng)藥殘留的檢測提供技術(shù)支撐，也為甘蔗中苯酰胺類農(nóng)藥殘留的監(jiān)測提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑

Agilent 7890B/7000D型氣相色譜三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（配備EI源）（美國Agilent公司）；Sorvall ST4 Plus型離心機(jī)（賽默飛世爾科技公司）；AutoEva-20plus E054型自動(dòng)氮吹儀（?？萍瘓F(tuán)股份有限公司）；Multi Reax型渦旋振蕩器（德國Heidolph公司）；S22H型超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司）；JE3002GE/02型電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）。

22種苯酰胺類農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液（1000 mg/L，農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所）；乙腈、丙酮、乙酸乙酯（色譜純，Sigma-Aldrich公司）；氯化鈉、無水MgSO4（分析純，廣州化學(xué)試劑廠）；N-丙基乙二胺(PSA)、C18、石墨化碳黑(GCB，天津博納艾杰爾科技公司)；0.22 μm有機(jī)相濾膜（彼西絡(luò)科技(廣州)有限公司）

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別準(zhǔn)確吸取22種苯酰胺類標(biāo)準(zhǔn)溶液1000 mg/L各0.1 mL，用丙酮稀釋并定容10 mL，配制成質(zhì)量濃度為10 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4℃條件下保存。取上述混合儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋，用乙酸乙酯定容，分別配制成5、10、50、100、500 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作液。

1.3 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取粉碎均勻的甘蔗樣品10.00 g于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈，渦旋5 min，充分提取后，加入5 g氯化鈉，再渦旋2 min，以4500 r/min離心5 min，移取8 mL上層有機(jī)相于凈化管中（含有30 mg無水MgSO4與不同比例的PSA、C18、GCB），渦旋混勻2 min，以4500 r/min離心5 min，用移液槍準(zhǔn)確移取4 mL上清液于10 mL刻度管中，氮吹至近干，用2 mL乙酸乙酯復(fù)溶，渦旋超聲5 min，過有機(jī)濾膜，上機(jī)測試。

1.4 色譜和質(zhì)譜條件

色譜條件：色譜柱：Agilent HP-5MS Ultra Inert(30 m×250 μm×0.25 μm)；升溫程序：起始溫度40℃，保持1 min，以40℃/min升溫至120℃，然后以5℃/min升溫至240℃，再以12℃/min升溫至300℃保持3 min；進(jìn)樣口溫度280℃；輔助加熱器溫度：280℃；載氣：高純度氦氣；載氣流速：1.2 mL/min；不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1 μL。

質(zhì)譜條件：離子源:電子轟擊電離源(EI)；電子能量70 eV，離子源溫度280℃；四極桿溫度：150℃；淬滅氣：氦氣；碰撞氣：氮?dú)?；溶劑延遲3 min；選擇動(dòng)態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測(dMRM)掃描模式。22種苯酰胺類農(nóng)藥質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 22種苯酰胺類農(nóng)藥質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜和質(zhì)譜條件的優(yōu)化

根據(jù)苯酰胺類農(nóng)藥屬于弱極性化合物的特性，選擇HP-5MS毛細(xì)管色譜柱，通過優(yōu)化色譜柱程序升溫條件，實(shí)現(xiàn)22種苯酰胺農(nóng)藥的有效分離。在全掃描模式下定性確定22種苯酰胺類農(nóng)藥的保留時(shí)間和特征離子，選擇豐度高、質(zhì)量數(shù)大的特征離子作為母離子；再用產(chǎn)物離子掃描模式獲得子離子；最后在動(dòng)態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測模式(dMRM)下進(jìn)行碰撞能量的優(yōu)化，獲得最佳碰撞能量。質(zhì)譜具體參數(shù)見表1，22種苯酰胺類農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖見圖1。

圖1 22種苯酰胺農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(500 μg/L)TIC總離子流圖

2.2 提取溶劑的選擇

甘蔗樣品中含有大量的粗纖維，進(jìn)行粉碎均質(zhì)后能增大甘蔗樣品與有機(jī)溶劑的接觸面積，從而提高甘蔗中的農(nóng)藥提取率，直接用乙腈進(jìn)行提取是檢測甘蔗農(nóng)藥殘留常用的方法，乙腈極性相對(duì)適中，對(duì)各種農(nóng)藥組分均有較好的溶解度，同時(shí)其他共萃物相對(duì)較少，適合多種農(nóng)藥殘留的提取。

2.3 凈化方法的優(yōu)化

甘蔗中含豐富的糖分、有機(jī)酸、色素等物質(zhì)，基質(zhì)復(fù)雜，容易對(duì)目標(biāo)物造成干擾，降低儀器分析的靈敏度和準(zhǔn)確度，因此考慮采用QuEChERS法對(duì)甘蔗提取液進(jìn)行凈化，其中PSA、C18、GCB是常用的凈化劑填料。PSA能去除有機(jī)酸、色素和糖類等雜質(zhì)，C18能去除基質(zhì)中的非極性物質(zhì)和色素，GCB有較強(qiáng)的吸附能力，能去除疏水性化合物。加入無水MgSO4的目的是除去提取液中的水分，防止對(duì)色譜柱造成損害。本文選擇PSA用量為100、200、300 mg，C18用量為20、50、100 mg，GCB用量為10、30、50 mg進(jìn)行3因素3水平的正交實(shí)驗(yàn)，通過調(diào)整3種填料的用量以找到最優(yōu)的凈化條件，結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明，當(dāng)樣品加標(biāo)水平為50 μg/L，PSA用量為200 mg，C18為100 mg，GCB為10 mg時(shí)有21種苯酰胺類農(nóng)藥能達(dá)到回收率范圍在80%～110%之間的要求，其中呋菌胺因其分子結(jié)構(gòu)的特殊性，部分被GCB吸附，導(dǎo)致回收率偏低，為76.5%，但仍能滿足農(nóng)藥殘留檢測要求。因此，當(dāng)PSA用量為200 mg，C18為100 mg，GCB為10 mg為最優(yōu)組合。

表2 凈化劑填料的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)是指樣品中的非待測組分可能對(duì)待測組分的產(chǎn)生干擾，影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性[12]。李敏等[13]通過樣品基質(zhì)中添加相同含量分析物得到的響應(yīng)值與純?nèi)軇┲械姆治鲰憫?yīng)值比值確定基質(zhì)效應(yīng)的大小，若目標(biāo)物基質(zhì)效應(yīng)在100%～120%之間則基質(zhì)效應(yīng)弱，120%～150%則基質(zhì)效應(yīng)中等，＞150%則為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，22種苯酰胺類農(nóng)藥在甘蔗中的基質(zhì)效應(yīng)均＞150%，表現(xiàn)為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)，基質(zhì)效應(yīng)不可忽略，因此選擇用甘蔗空白樣品基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量，以減小基質(zhì)效應(yīng)的影響。具體苯酰胺農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)見表3。

表3 22種苯酰胺農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)

2.5 線性關(guān)系、檢出限與定量限

用陰性基質(zhì)甘蔗樣品基質(zhì)溶液配制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，以標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的濃度為橫坐標(biāo)，各組分的峰面積為縱坐標(biāo)，求得線性方程和相關(guān)系數(shù)r2。具體結(jié)果見表4。結(jié)果表明，22種苯酰胺類農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)曲線5～500 μg/L的相關(guān)系數(shù)r2在0.9993～0.9999之間，線性良好。用信噪比S/N=3計(jì)算檢出限，信噪比S/N=10計(jì)算定量限，則22種苯酰胺農(nóng)藥的檢出限范圍在0.1～3.8 μg/kg之間，定量限范圍在0.4～12.5 μg/kg之間。

表4 22種苯酰胺農(nóng)藥檢測的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

2.6 回收率和精密度

選取陰性基質(zhì)甘蔗樣品添加水平分別為10、50、500 μg/kg進(jìn)行回收率試驗(yàn)，每個(gè)加標(biāo)水平平行測定6次，重復(fù)測定3天。22種苯酰胺農(nóng)藥的平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差結(jié)果見表5。由表5可知，平均加標(biāo)回收率范圍在71.7%～104.0%之間，日內(nèi)精密度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)(n=6)在0%～6.7%之間，日間精密度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)(n=3)在4.7%～9.0%之間，滿足甘蔗中22種苯酰胺類農(nóng)藥殘留的檢測要求。

表5 甘蔗中22種苯酰胺農(nóng)藥的平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

2.7 實(shí)際樣品測定

根據(jù)本試驗(yàn)方法，分別對(duì)20個(gè)不同批次的甘蔗樣品進(jìn)行22種苯酰胺類農(nóng)藥測定，經(jīng)測定，在20個(gè)批次甘蔗樣品中，有2個(gè)批次的甘蔗樣品檢出苯霜靈，含量分別為5.9、9.3 μg/kg，有1個(gè)批次的甘蔗樣品檢出氟噻草胺，含量為8.7 μg/kg。其余17個(gè)批次甘蔗樣品均未檢出。

3 結(jié)論

應(yīng)用QuEChERS前處理技術(shù)結(jié)合氣相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜法(GC-MS/MS)，建立了檢測甘蔗樣品22種苯酰胺類農(nóng)藥殘留的分析方法。22種苯酰胺類農(nóng)藥在5～500 μg/L范圍內(nèi)線性良好(r2＞0.999)，檢出限在0.1～3.8 μg/kg之間，定量限在0.4～12.5 μg/kg之間。在樣品中添加22種苯酰胺類農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)行3水平(10、50、500 μg/kg)添加回收實(shí)驗(yàn)，加標(biāo)回收率范圍在71.7%～104.0%之間，日內(nèi)精密度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)(n=6)在0%～6.7%之間，日間精密度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)(n=3)在4.7%～9.0%之間。該方法簡單高效，準(zhǔn)確度和精密度高，適用于大批量甘蔗樣品中22種苯酰胺類農(nóng)藥殘留的檢測。