陳連勇，茹浩浩，楊星，閆雙群，陳濤，倪沁璇，許琳

（云南省疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病防治所，云南 昆明 650022）

結(jié)核病仍是人類面臨的重大公共衛(wèi)生問題。據(jù)WHO 估計[1]，2019 年全球有新發(fā)結(jié)核病1 000 萬，近50 萬新發(fā)利福平（rifampicin，RFP）耐藥肺結(jié)核患者，其中78%為耐多藥結(jié)核病患者（multiple drug resistant tuberculosis，MDR-TB）指同時耐異煙肼和利福平的結(jié)核病患者，而中國是全球30 個MDR 高負(fù)擔(dān)國家之一，耐藥結(jié)核患者占了其中的14%，位居全球第2[1]。耐藥結(jié)核病尤其是MDR-TB 仍是結(jié)核病防治面臨的一個嚴(yán)重挑戰(zhàn)。異煙肼（isoniazid，INH）自其問世以來一直是治療結(jié)核病的首選藥物之一，當(dāng)結(jié)核分枝桿菌對INH 產(chǎn)生耐藥時則會嚴(yán)重影響結(jié)核病的治療效果。而耐藥從分子水平上大部分是由于結(jié)核耐藥相關(guān)基因位點發(fā)生了突變而產(chǎn)生的，同時受地域因素等影響，其耐藥基因突變類型和頻率存在差異。為了解云南省的INH 耐藥結(jié)核分枝桿菌基因突變情況，本研究對云南省結(jié)核耐藥監(jiān)測點分離的結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行INH 耐藥相關(guān)基因katG 基因和inhA 基因測序，以闡明其耐藥基因突變特征，為本地區(qū)耐藥結(jié)核病的快速診斷和防控政策的制定提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

結(jié)核分枝桿菌菌株來自于2016 年1 月至12月期間前來云南省32 個耐藥監(jiān)測縣就診的病原學(xué)陽性肺結(jié)核患者，對其痰標(biāo)本進(jìn)行分離培養(yǎng)后獲得。結(jié)核桿菌標(biāo)準(zhǔn)株（H37RV）由中國疾控中心結(jié)核病預(yù)防控制中心國家結(jié)核病參比實驗室提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 表型藥物敏感性試驗表型藥物敏感性試驗采用比例法，檢測其對6 種抗結(jié)核藥物的藥物敏感性?？菇Y(jié)核藥物在培養(yǎng)基中的終濃度分別為：INH 0.2 μg/mL，OFX 2 μg/mL，RFP 40 μg/mL，KM 30 μg/mL，EMB 2 μg/mL 和SM 4 μg/mL。以耐藥百分比作為判定標(biāo)準(zhǔn)：<1%者判定為敏感，≥1%則報告為耐藥。并以H37RV 作對照進(jìn)行質(zhì)量控制。

1.2.2 DNA 模板制備對表型藥敏結(jié)果顯示INH耐藥的結(jié)核分枝桿菌，從固體羅氏培養(yǎng)基斜面上刮取1 接種環(huán)培養(yǎng)3～4 周的新鮮菌株，重懸于200 μLTE 中，恒溫金屬浴85 ℃孵育30 min 滅活，12000 r/min 離心5 min，然后棄上清，每管分別加入100 μL 去離子水，渦旋振蕩重懸；95 ℃恒溫金屬浴20 min，超聲裂解15 min，12000 r/min離心 5 min，取上清液作為DNA 模板備用。

1.2.3 耐藥基因擴增及測序從Genebank獲得H37Rv 的katG 和inhA 基因序列，采用Primer 5.0 設(shè)計引物，對katG 和inhA 基因進(jìn)行擴增，2對引物的序列分別為：

katG-F：5‘-AATCGATGGGCTTCAAGACG-3’ ；

katG-R：5‘-CTCGTAGCCGTACAGGATCTCG-3’ 。

inhA-F：5‘-CCTCGCTGCCCAGAAAGGGA-3’ ；

inhA-R：5‘-ATCCCCCGGTTTCCTCCGGT-3’ 。

擴增產(chǎn)物分別為500 bp 和248 bp。每個反應(yīng)體系為50 μL，包括2×PCR 擴增25 μL、上下游引物（10 mol/L）各1.5 μL，DNA 模板5 μL，去離子水17 μL。PCR 擴增反應(yīng)條件：94 ℃變性5 min；94 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min 共35 個循環(huán)，再72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.4 測序結(jié)果比對katG 和inhA 基因測序結(jié)果采用BioEdit v7.2.5 軟件分析，測序結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)菌H37Rv 的基因序列進(jìn)行比對，確定基因突變位點及基因突變情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

建立EpiData 數(shù)據(jù)庫，并將實驗結(jié)果等信息錄入，采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。突變率的比較采用χ2檢驗，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 藥物敏感性實驗結(jié)果

共收集并分離到846 株結(jié)核分枝桿菌，藥敏試驗結(jié)果顯示，88 株結(jié)核分枝桿菌對INH 耐藥，INH 耐藥率為10.40%。其中32 株同時對RFP 耐藥（即MDR），MDR 率為4.29%，另56 株對INH耐藥，而對RFP 敏感（INH 單耐）。

2.2 INH 耐藥相關(guān)基因突變特征

88 株表型藥敏試驗結(jié)果顯示INH 耐藥的結(jié)核分枝桿菌，對其katG 和inhA 基因進(jìn)行PCR 擴增，擴增出500 bp 和248 bp 大小的目的基因片段，見圖1。

圖1 katG 和inhA 基因擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose GEL electrophoresis of katG and inhA gene amplification products

測序結(jié)果顯示，73 株檢出INH 耐藥相關(guān)基因突變，15 株（17.05%）未檢測到katG 或inhA 基因的突變，INH 耐藥基因型與表型的符合率為82.95%（73/88），其中65 株（73.86%）為katG 基因突變，7 株（7.95%）為inhA 基因突變，1 株（1.14%）為katG 基因和inhA 基因的聯(lián)合突變?；蛲蛔兩婕発atG 和inhA 的14 個基因突變類型和13 種氨基酸改變，有點突變、雙位點聯(lián)合突變和基因缺失，見表1。

表1 88 株INH 耐藥結(jié)核分枝桿菌的KatG 和inhA 基因突變情況Tab.1 Distribution of mutations of katG and inhA gene among 88 inh-resistant TB isolates

突變頻率最高的位點為KatG315 位點，占INH 耐藥菌株數(shù)的67.05%（59/88），包括52 株Ser315Thr（堿基改變?yōu)锳GC→ACC，氨基酸改變?yōu)镾er→Thr）基因突變，見圖2，6 株Ser315Asn（堿基改變?yōu)锳GC→AAC，氨基酸改變?yōu)镾er→Asn）基因突變，見圖2，1 株Ser315Arg（堿基改變?yōu)锳GC→CGC，氨基酸改變?yōu)镾er→Arg）基因突變。有4 株（4.55%）出現(xiàn)katG 基因的雙位點突變，見表1，其中1 株出現(xiàn)Ser315Thr+Lys327Lys雙位點突變中的Lys327Lys 堿基密碼子改變?yōu)橥x突變，堿基變化為AAA→AAG，而編碼氨基酸未發(fā)生改變，均為Lys，見表1。7 株（7.95%）INH耐藥菌株的基因突變發(fā)生于非315 密碼子區(qū)。

7 株（7.95%）inhA 基因突變位于inhA 基因啟動子區(qū)域，均為-15 位點（C→T），見圖2，占基因突變類型的第2 位。katG315 或inhA-15 位點的突變占到所有INH 耐藥菌株數(shù)的75%（66/88）。

圖2 katG 和inhA 基因的主要突變類型Fig.2 The characteristics of katG and inhA gene mutation

2.3 耐藥基因突變與耐藥類型的比較

32 株MDR 菌株中有87.50%（28/32）出 現(xiàn)katG 或inhA 基因突變，而56 株INH 單耐菌株中出現(xiàn)基因突變的比例為80.36%（45/56），MDR 和INH 單耐菌株中基因突變比例，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.735，P=0.391）。32 株MDR 菌株中，katG 基因突變的有28 株，占MDR 數(shù)的87.50%，其中出現(xiàn)katGSer315Thr 的比例為62.50%（20/32），見表2，56 株INH 單耐菌株中，katG 基因突變的有38 株（67.86%），其中出現(xiàn)Ser315Thr 的比例為57.14%（32/56），見表2，MDR 菌株中出現(xiàn)katG基因突變的比例與INH 單耐結(jié)核分枝桿菌相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.190，P=0.041），而出現(xiàn)katGSer315Thr 基因突變，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.242，P=0.623）。inhA 基因突變中，7 株inhA-15 位點基因突變均來自于INH 單耐菌株中，1 株inhA-34 位點基因突變來自于MDR 菌株，為與katG314 位點的聯(lián)合突變，MDR 和INH 單耐菌株的inhA 基因突變，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（3.13% vs 12.50%，χ2=1.180，P=0.277），inhA-15 位點基因突變，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（0 vs 12.50%，χ2=2.806，P=0.094）。

表2 不同耐藥類型中INH 耐藥基因突變情況[n（%）]Tab.2 KatG and inhA gene mutations between MDR and INH mono-resistant [n（%）]

3 討論

INH 和RFP 作為治療結(jié)核病的2 種最重要的首選抗結(jié)核藥物，兩者均存在價格便宜、殺菌力強和副作用低的特點[2]。由于RFP 耐藥的主要分子機制相對簡單，96%以上RFP 耐藥都是由于apoB 基因的核心區(qū)基因突變引起的[3]，表型和基因型耐藥高度相關(guān)，因而使得RFP 耐藥快速檢測成為可能，而INH 的耐藥機制十分復(fù)雜，涉及katG、inhA、ahpC、oxyR-ahpC 等結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控區(qū)[4?7]，其中最為主要的為katG 和inhA 基因。INH 耐藥菌株中katG 基因突變率約為60%～95%，而inhA 基因突變率則為8%～43%左右[8?10]。本研究通過對來自云南結(jié)核病耐藥監(jiān)測點分離的88株INH 耐藥結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行katG 和inhA 基因的序列分析，結(jié)果顯示82.95%的菌株出現(xiàn)INH耐藥相關(guān)基因katG 和/或inhA 的突變，15 株未檢測到katG 基因及inhA 基因的突變，這可能和其它異煙肼耐藥相關(guān)基因發(fā)生突變有關(guān)，有關(guān)文獻(xiàn)報道，在異煙肼耐藥菌株中，oxyR-ahpC 突變率可達(dá)占5%～10%[2]。本研究中katG 基因突變占INH 耐藥菌株數(shù)的73.86%，INH 耐藥以katG 315位點基因突變?yōu)橹?，超過INH 耐藥菌株數(shù)的50%，達(dá)到67.04%；其次為inhA-15 位點的突變，占耐藥菌株數(shù)的7.95%，總體結(jié)果與國內(nèi)其它省份基本一致。katG 基因突變率與江西（73.25%）[11]和吉林（70.6%）[12]等地結(jié)果接近，高于浙江（63.1%）[13]和北京（62.3%）[14]；katG 315 位點突變率與江西（68.8%）[11]、浙江（63.1%）[13]等地報道接近，低于上海（81.4%）[15]和四川（84.43%）[16]，inhA-15 位點的突變與浙江（10.41%）[13]結(jié)果接近，而低于江西（15.30%）[11]、上海（16.9%）[15]、湖南（15.6%）[17]及北京（19.5%）[14]等地結(jié)果，提示katG 和inhA 基因突變受地域等因素的影響。目前，商品化的INH 耐藥檢測分子診斷技術(shù)大部分是基于對katG 基因的315 位點和inhA 基因啟動子區(qū)的幾個常見突變位點進(jìn)行檢測，根據(jù)本研究，兩者占INH 耐藥的75%左右，鑒于常規(guī)表型藥敏檢測從痰標(biāo)本采集到獲得藥敏結(jié)果需分離培養(yǎng)和藥敏試驗等過程，耗時2～3 個月時間，而分子診斷技術(shù)工具大大縮短了診斷的時間，因此合理使用分子診斷技術(shù)對于指導(dǎo)臨床診療具有重要意義，同時今后還需開發(fā)或引進(jìn)包含其它基因或位點的分子診斷工具以提高INH 耐藥檢測水平。

世界各地結(jié)核分枝桿菌中katG 基因中Ser 315Thr 突變的流行率各不相同，與當(dāng)?shù)亟Y(jié)核病疫情密切相關(guān)，相比于結(jié)核病低疫情地區(qū)，高結(jié)核病負(fù)擔(dān)地區(qū)INH 耐藥菌株中的Ser 315Thr 突變率總是處于一個比較高的水平[18]。本研究顯示云南省的結(jié)核分枝桿菌Ser 315Thr 突變達(dá)到INH 耐藥菌株數(shù)的59.09%，超過50%與國內(nèi)其他地區(qū)的報道基本一致[18]。有研究表明，INH 耐藥菌株在katG 315 密碼子以外區(qū)域的突變頻率低于1%[19]，而本研究中315 密碼子突變率為7.95%，同時4.55%菌株出現(xiàn)katG 基因雙位點突變看，提示我省katG 基因突變的多樣性較高。

本研究還對耐多藥和INH 單耐菌株的耐藥基因突變率進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，MDR 結(jié)核分枝桿菌中katG 基因突變率顯著高于INH 單耐的菌株，這可能與大部分MDR 菌株其INH 耐藥性的獲得提前于RFP 有關(guān)[2]，通常認(rèn)為katG 突變與結(jié)核分枝桿菌對INH 高水平耐藥相關(guān)，inhA 啟動子突變與INH 低水平耐藥相關(guān)。INH 耐藥性尤其是katG 突變更容易誘發(fā)菌株對RFP 耐藥而形成MDR 菌株。國外相關(guān)研究[19?20]也顯示MDR 菌株中的katG 基因突變率高于INH 單耐。本研究中雖然MDR 和INH 單耐菌株中其inhA 基因突變比例無顯著差異，但7 株inhA -15 位點突變的菌株均來自于INH 單耐，僅有1 株inhA-34+katG314聯(lián)合突變的菌株為MDR，提示不同耐藥類型中，inhA 的基因突變率也可能不同，本研究受限于inhA 基因突變的樣本較少，尚不足以明確反映inhA 基因與表型耐藥的關(guān)系，具體情況還有待于今后進(jìn)一步研究。

本研究首次通過基因測序手段揭示了云南省結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥的分子特征，并對耐藥表型和基因型的關(guān)系進(jìn)行了分析，為云南省今后各類異煙肼耐藥檢測技術(shù)手段在云南省的合理應(yīng)用提供了技術(shù)支撐。