張 莉 ，王雨婷 ，石佳寧 ，余丹 ，楊仁華 ，沈志強(qiáng) ，龍江 ，陳鵬

（1）昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院暨云南省天然藥物藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500;2）昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，云南 昆明 650032）

心血管疾?。╟ardiovascular disease，CVD）是世界范圍內(nèi)人類(lèi)死亡的主要原因之一，而動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是所有心血管疾病的病因和共同的病理生理基礎(chǔ)[1?3]。動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一組發(fā)展緩慢、復(fù)雜的炎癥性血管疾病，其特征是動(dòng)脈壁增厚、硬化，失去彈性，管腔狹窄，血管內(nèi)膜上積淀淡黃色動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，是臨床重多心血管系統(tǒng)疾病的關(guān)鍵的病理基礎(chǔ)。近年來(lái)研究表明，AS 發(fā)病呈現(xiàn)年輕化的趨勢(shì)[4?5]。因此，尋找AS 關(guān)鍵有效的預(yù)防靶點(diǎn)一直是心腦血管領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)。目前，他汀類(lèi)藥物、抗血小板聚集藥物和一些中草藥復(fù)方制劑是臨床上常用一線的抗AS 藥物[6]。雖然這些藥物對(duì)AS 有一定的防治療效，但既往研究表明，長(zhǎng)期使用他汀類(lèi)藥物會(huì)導(dǎo)致肝腎損傷和橫紋肌溶解等不良反應(yīng)[7]，甚至?xí)霈F(xiàn)橫紋肌溶解后急性腎衰竭而死亡等嚴(yán)重的后遺癥[8]。因此，關(guān)注AS 的發(fā)病機(jī)制對(duì)其防治AS 的病程進(jìn)展具有非常重要的臨床價(jià)值。

燈盞花又名燈盞細(xì)辛，是云南特色藥用植物，其主要成分為燈盞乙素（Scutellarin），其結(jié)構(gòu)式：4′，5，6-三羥基黃酮-7-葡萄糖醛酸苷，見(jiàn)圖1。前人研究發(fā)現(xiàn)，燈盞乙素能改善高血糖引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷[3]。與前人[9]的研究結(jié)果相似，筆者的研究表明燈盞乙素可以保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，并通過(guò)減少氧化作用發(fā)揮抗AS 的作用，而具體的分子機(jī)制并不清楚。結(jié)合上述研究結(jié)果，提示燈盞乙素具有潛在的抗AS 臨床價(jià)值，值得進(jìn)一步深入研究。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是以系統(tǒng)生物學(xué)和多向藥理學(xué)為基礎(chǔ)，可以為研究者提供新的藥物研究策略，它可以通過(guò)構(gòu)建“疾病-基因-靶點(diǎn)-藥物網(wǎng)絡(luò)，篩選出關(guān)鍵作用的靶點(diǎn)與生物學(xué)過(guò)程” 更直觀的向人們闡述藥物作用于疾病的生物學(xué)作用和潛在的分子機(jī)制[10]。因此，本課題結(jié)合網(wǎng)藥預(yù)測(cè)結(jié)果，同時(shí)復(fù)制APOE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型，研究系列濃度的燈盞乙素對(duì)APOE-/-小鼠AS模型的胸主動(dòng)脈斑塊組織中PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路的調(diào)控作用及炎癥因子的影響，深入挖掘燈盞乙素抗 AS 的分子生物學(xué)作用機(jī)制，為AS 的預(yù)防和治療進(jìn)一步提供全新的視角和實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)支持。

圖1 燈盞乙素的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure of Scutellarin

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 數(shù)據(jù)庫(kù)及軟件實(shí)驗(yàn)中用到的數(shù)據(jù)庫(kù)和軟件如下：PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）；SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.swisstargetprediction.ch/）；PharmMapper 數(shù)據(jù)庫(kù)v2017（http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）；GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)v5.6.0（https://www.genecards.org/）；DisGeNET Database v7.0（https://www.disgenet.org/）；Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.uniprot.org/）；Venny 2.1.0 軟件（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）；蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)STRING v11.5（https://stringdb.org/）；DAVID v6.8 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://david.ncifcrf.gov/）；微生信平臺(tái)（http://www.bioinformatics.com.cn/）；Cytoscape v3.9.0 軟件（https://cytoscape.org/），見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)涉及的部分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)Tab.1 Main databases involved in the experiment

1.1.2 藥物與試劑（1）云南省藥物研究所張人偉教授提供燈盞乙素，純度為98.8%。阿托伐他汀鈣由輝瑞公司提供。（2）燈盞乙素組每天以0.1 mL/10 g 體重進(jìn)行灌胃。以28 mg/kg 的燈盞乙素組為例，將2800 mg 的燈盞乙素單體溶于100 mL 蒸餾的0.02 mmol/L NaOH 溶液中，調(diào)整pH 值至7.8。將上述28 mg/kg 劑量的溶液稀釋一半，以獲得燈盞乙素（14，7 mg/kg）溶液。（3）阿托伐他汀鈣（atorvastatin calcium，ATV）的配制，10 mg/kg 的阿托伐他汀鈣陽(yáng)性對(duì)照組藥物，每天以0.1 mL/10 g 體重進(jìn)行灌胃。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物70 只健康的ApoE-/-小鼠和20只健康的C57BL/6J 小鼠（雌雄各半），年齡8 周，體重（20±5）g，ApoE-/-小鼠由北京偉同利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司（北京，中國(guó)）購(gòu)買(mǎi)。生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（京）2012-0001。C57BL/6J 小鼠由昆明醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物系提供，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（滇）2015-0002。動(dòng)物在潔凈的動(dòng)物房中飼養(yǎng)，溫度18～25 ℃，濕度40%～70%。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 燈盞乙素（“Scutellarin”）的靶點(diǎn)篩選及網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建以“Scutellarin”為檢索詞，使用PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)下載燈盞乙素2D 結(jié)構(gòu)式的SDF格式并復(fù)制燈盞乙素的Canonical SMILES 號(hào)。通過(guò)Swiss 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)藥物靶點(diǎn)時(shí)，提供PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)下載的燈盞乙素的Canonical SMILES 號(hào)，即可得到該數(shù)據(jù)庫(kù)中燈盞乙素潛在的作用靶點(diǎn)；使用PharmMapper 數(shù)據(jù)庫(kù)查找燈盞乙素潛在作用靶點(diǎn)時(shí)，在PharmMapper 數(shù)據(jù)庫(kù)首頁(yè)點(diǎn)擊Submit job，將燈盞乙素結(jié)構(gòu)式的SDF 格式導(dǎo)入，選擇Human Protein Targets Only，提交后可得到該數(shù)據(jù)庫(kù)中燈盞乙素的潛在作用靶點(diǎn)，由于在PharmMapper 數(shù)據(jù)庫(kù)下載的藥物靶點(diǎn)只有Uniplot格式，需要轉(zhuǎn)化為常見(jiàn)基因名，故使用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，首先把PharmMapper 數(shù)據(jù)庫(kù)下載得到的靶點(diǎn)進(jìn)行篩選，將Zscore 列設(shè)置為大于0.9，把篩選出的基因的Uniplot 列粘貼到Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇UniProtKB AC/ID to Gene name，提交后下載Target list。將2 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)查的藥物靶點(diǎn)整合后，構(gòu)建藥物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)（Cytoscape 3.9.0）。

1.2.2 Atherosclerosis 靶點(diǎn)篩選輸入“Atherosclerosis”，通過(guò)DisGeNET Database v 7.0 和Gene Cards 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索疾病靶點(diǎn)，按照篩選條件，將篩選結(jié)果整合后得到疾?。▌?dòng)脈粥樣硬化）的潛在靶點(diǎn)。

1.2.3 Scutellarin 與 Atherosclerosis 的 Venny分析將燈盞乙素的作用靶點(diǎn)與動(dòng)脈粥樣硬化的基因靶點(diǎn)進(jìn)行Venny 分析，將共同靶點(diǎn)上傳Venny 2.1.0 數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建韋恩分析圖，篩選得到共同作用靶點(diǎn)，即為燈盞乙素治療動(dòng)脈粥樣硬化的作用靶點(diǎn)。

1.2.4 蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建為了深入挖掘燈盞乙素潛在靶點(diǎn)與動(dòng)脈粥樣硬化疾病靶點(diǎn)之間的潛在分子機(jī)制，現(xiàn)將篩選得到的共同作用靶點(diǎn)上傳STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)，“Minimum required interaction score”設(shè)置為0.4（中等可信度），并隱藏不連接節(jié)點(diǎn)，其余數(shù)值均保持默認(rèn)值，則蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖繪制完成。

1.2.5 GO 富集分析為說(shuō)明燈盞乙素的靶點(diǎn)在基因功能中的作用，將上述篩選出的燈盞乙素治療動(dòng)脈粥樣硬化的作用靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID v6.8 數(shù)據(jù)庫(kù)中，按照FDR 值升序（FDR <0.05），篩選細(xì)胞組 成（cellular component，CC），生物學(xué)過(guò)程（biological process，BP），分子功能（molecular function，MF）富集最顯著10 個(gè)GO 條目，利用微生信平臺(tái)繪制條形圖。

1.2.6 KEGG 通路富集分析KEGG 通路分析，按照FDR 值升序（FDR <0.05）篩選排名前20 的信號(hào)通路，計(jì)算通路富集倍數(shù)（Gene ratio），以P值作為參數(shù)，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入微生信平臺(tái)進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化處理。

1.2.7 AS 模型的復(fù)制、給藥和血管取材適應(yīng)性喂養(yǎng)7d 后，用西方高脂肪飲食（1%膽固醇、15%豬油、15%花生油、20%蛋黃粉、1%鹽和48%普通飲食）喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠，用標(biāo)準(zhǔn)飲食喂養(yǎng)C57BL/6J 小鼠。12 周后，隨機(jī)犧牲6 只ApoE-/-小鼠和6 只C57BL/6J 小鼠，收集胸主動(dòng)脈進(jìn)行組織病理學(xué)評(píng)估，檢測(cè)動(dòng)脈粥樣硬化的形成。確認(rèn)模型構(gòu)建成功后，將剩余的60 只動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠隨機(jī)分為5 組（n=12）：動(dòng)脈粥樣硬化模型組;7 mg/kg、14 mg/kg 和28 mg/kg 的燈盞乙素治療組；以及10 mg/kg 的阿托伐他汀鈣（atorvastatin calcium，ATV）作為陽(yáng)性對(duì)照組；12只C57BL/6J 小鼠設(shè)為正常對(duì)照組。每周稱(chēng)量調(diào)整劑量，治療組用不同劑量的燈盞乙素灌胃，每天1 次，每次0.1 mL/10 g，對(duì)照組和模型組用相同量的正常生理鹽水灌胃，持續(xù)12 周。取材前給予小鼠2%異氟烷吸入式麻醉。然后，分離每只小鼠的胸主動(dòng)脈，最后小鼠吸入2%異氟烷過(guò)量致死。

1.2.8 HE 染色取各組小鼠總動(dòng)脈一段固定后的主動(dòng)脈，常規(guī)脫水、透明、浸蠟，石蠟包埋，以20 μm 厚度連續(xù)切片，每只動(dòng)物從連續(xù)切片的第 5 張開(kāi)始，每間隔 10 張選1 張，即第 5、15、25，共3 張切片，顯微鏡下觀察，拍照。

1.2.9 ELISA 法檢測(cè)TNF-α 和IL-1β 的含量小鼠麻醉后，迅速眼球取血，離心，取上清，使用小鼠ELISA 的TNF-α 和IL-1β 試劑盒檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組中小鼠分離提取血清實(shí)驗(yàn)樣本TNF-α 和IL-1β 中含量。依據(jù)說(shuō)明書(shū)依次加入試劑和樣品，用酶標(biāo)儀在 450 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD 值），通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中小鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白細(xì)胞介素 1β（IL-1β）含量。

1.2.10 RT-PCR 確證差異基因?yàn)榱搜芯繜舯K乙素對(duì)AS 模型影響，進(jìn)行RT-PCR 來(lái)檢測(cè)PI3K、AKT、mTOR、Bax、Bcl-2、Caspase-3 的mRNA水平。用TRIzol 試劑提取各組胸主動(dòng)脈血管組織總RNA，并使用Quant Script RT 試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。在ABI7900HT（Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA）上進(jìn)行PCR。2-ΔΔCT值用來(lái)表示PI3K、AKT、mTOR、Bax、Bcl-2、Caspase-3 RNA 的相對(duì)表達(dá)水平。隨機(jī)選擇并準(zhǔn)備了7 條PCR 引物來(lái)分析頸總動(dòng)脈的變化。PCR 條件如下：95 ℃熱變性40 s，60 ℃退火30 s，60 ℃延伸45 s，共40 個(gè)循環(huán)。一式3 份的PCR，20 μL 的混合物含有4 μL 的5×FastPfu 緩沖液，2 μL 的dNTPs（2.5 mM），0.8 μL 的每個(gè)引物（5 μM），0.4 μL 的Fast Pfu 聚合酶，和10 ng 的模板DNA。則樣品中的相對(duì)mRNA 表達(dá)水平被確定為2-ΔΔCT。特定基因的引物序，見(jiàn)表2。

表2 引物序列Tab.2 The primer sequence

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 燈盞乙素（Scutellarin）靶點(diǎn)篩選

從PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)中得到燈盞乙素分子結(jié)構(gòu)圖 的sdf 格式及Canonical SMILES 號(hào)，通過(guò)Pharm Mapper 數(shù)據(jù)庫(kù)、Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫(kù)尋找與燈盞乙素相關(guān)的潛在靶點(diǎn)，經(jīng)篩選后共得到167 個(gè)靶點(diǎn)，主要有腫瘤壞死因子-a（TNFα）、NADPH 氧化酶4（NADPH oxidase 4）、MAP激酶p38α（MAP kinase p38 alpha）、P-糖蛋白1（Pglycoprotein 1）、淋巴細(xì)胞分化抗原 CD38（Lymphocyte differentiation antigen CD38）等。

2.2 成分-藥物靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將“Scutellarin”與167 個(gè)潛在靶點(diǎn)經(jīng)數(shù)據(jù)處理后上傳Cytoscape 3.9.0，即呈現(xiàn)燈盞乙素-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，其中黃色代表燈盞乙素，灰色代表燈盞乙素作用的靶點(diǎn)，見(jiàn)圖2。

圖2 燈盞乙素-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Scutellarin-target network

2.3 疾病靶點(diǎn)篩選

以“Scutellarin”為檢索詞，通過(guò)DisGeNET Database v7.0 數(shù)據(jù)庫(kù)和Gene Cards 數(shù)據(jù)庫(kù)分別進(jìn)行檢索，共得到5197 個(gè)與AS 的相關(guān)靶點(diǎn)，包括低密度脂蛋白受體（low density lipoprotein receptor）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素6（interleukin 6，IL-6）、載脂蛋白E（apolipoprotein E，APOE）、AKT 絲氨酸/蘇氨酸激酶1（AKT serine/threonine kinase 1）等。

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將藥物和疾病靶點(diǎn)依次上傳至Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行靶點(diǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)化，再通過(guò) Venny 2.1 軟件繪制韋恩圖及藥物-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，其中AS 靶點(diǎn)用黃色表示，燈盞乙素靶點(diǎn)用藍(lán)色表示，2 部分交集得到106 個(gè)共同靶點(diǎn)，見(jiàn)圖3；將共同靶點(diǎn)上傳STRING 繪制PPI 網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖4。

圖3 燈盞乙素-動(dòng)脈粥樣硬化-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)Fig.3 Intersection of Scutellarin predicted targets and atherosclerotic targets

圖4 燈盞乙素治療動(dòng)脈粥樣硬化潛在靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)Fig.4 PPI network of potential targets of Scutellarinl on anti-AS

2.5 核心靶點(diǎn)篩選

將PPI 圖的tsv 格式導(dǎo)入Cytoscape v3.9.0 軟件，在Cytohubba 中提交，選擇排名前20 的靶點(diǎn)制作核心靶點(diǎn)圖，見(jiàn)圖5。

圖5 核心靶點(diǎn)篩選Fig.5 Core target screening

2.6 GO 功能富集分析

將上述共同靶點(diǎn)上傳至DAVID v6.8 數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)106 個(gè)差異基因進(jìn)行GO 功能富集分析，其中共得到239 個(gè)生物學(xué)過(guò)程（biological process，BP），主要包括MAP 激酶活性的正調(diào)控（Positive regulation of MAP kinase activity）、平滑肌細(xì)胞增殖的正調(diào)控（Positive regulation of smooth muscle cell proliferation）、Ras 蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（Ras protein signal transduction）等；41 個(gè)細(xì)胞組成（cellular component，CC），主要涉及細(xì)胞外空間（Extracellular space）、細(xì)胞溶質(zhì)（Cytosol）、薄膜（Membrane）；68 個(gè)分子功能（molecular function，MF），主要包括蛋白酶結(jié)合（Protease binding）、酶結(jié)合（Enzyme binding）等，見(jiàn)圖6。

圖6 燈盞乙素治療動(dòng)脈粥樣硬化潛在靶點(diǎn)的GO 富集分析Fig.6 GO enrichment analysis of potential targets of Scutellarin for anti-atherosclerosis

2.7 KEGG 通路富集分析

同樣，筆者得到20 條與AS 相關(guān)的KEGG 信號(hào)通路，依據(jù)是按照P值升序排列，主要包括PI3K/AKT 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路等，筆者用“微生信”平臺(tái)處理上述信號(hào)通路，其中與AS 相關(guān)且涉及該通路的基因數(shù)用氣泡大小代表示，顏色深淺代表富集顯著性，見(jiàn)圖7。

圖7 燈盞乙素治療AS 潛在靶點(diǎn)的KEGG 通路分析Fig.7 KEGG pathway analysis of potential targets of Scutellarin on anti-atherosclerosis

2.8 HE 染色結(jié)果

HE 染色顯示，正常組小鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜完整，排列緊密，中膜平滑肌細(xì)胞排列整齊，未見(jiàn)明顯增厚的現(xiàn)象，無(wú)脂質(zhì)沉積，無(wú)炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)。與正常組相比，AS 模型組則表現(xiàn)出內(nèi)皮細(xì)胞損傷嚴(yán)重，部分內(nèi)膜脫落，內(nèi)膜上可見(jiàn)大小不等的斑塊，見(jiàn)黑色箭頭。經(jīng)過(guò)陽(yáng)性藥物阿伐他汀鈣（atorvastatin calcium，ATV）治療后，病理改變明顯減少，內(nèi)膜基本完整，增厚不明顯，中膜平滑肌細(xì)胞增生明顯減少。與AS 模型組相比，7 mg/kg Scutellarin 治療組內(nèi)膜上可見(jiàn)大小不等的斑塊，并伴有大量的炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，平滑肌細(xì)胞排列也比較紊亂；14 mg/kg Scutellarin 治療組內(nèi)膜增厚情況減輕，泡沫細(xì)胞數(shù)量減少明顯，平滑肌細(xì)胞排列整齊程度有所改善，且脂質(zhì)沉積情況有所改善；28 mg/kg Scutellarin 治療組內(nèi)膜增厚程度明顯減輕，泡沫細(xì)胞數(shù)量減少，中膜平滑肌細(xì)胞排列變得較為整齊，脂質(zhì)沉積幾乎沒(méi)有出現(xiàn)，細(xì)胞間隙減小，見(jiàn)圖8。

圖8 HE 染色結(jié)果（200×）Fig.8 HE staining results（200×）

2.9 RT-PCR 確證差異基因的結(jié)果

RT-qPCR 結(jié)果提示，和正常組相比，模型組PI3K、AKT、mTOR 和Bcl-2 的mRNA 表達(dá)量明顯升高（P<0.01）；Bax 和Caspase-3 的mRNA表達(dá)量明顯降低（P<0.01）；和模型組相比，燈盞乙素組則呈濃度依耐性地下調(diào)PI3K、AKT、mTOR 和Bcl-2 的mRNA表達(dá)，上調(diào)Bax 和Caspase-3 的mRNA表達(dá)（P<0.05），見(jiàn)圖9A，圖9B。

2.10 ELISA 結(jié)果

和正常組相比，模型組血清TNF-α 和IL-1β 的含量明顯升高，（P<0.01）。和模型組相比，燈盞乙素則呈濃度依耐性地下調(diào)小鼠血清TNFα 和IL-1β 的含量（P<0.05），見(jiàn)圖9C，圖9 D。

圖9 燈盞乙素對(duì)PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路及炎癥因子的影響[（ ），n=6）]Fig.9 Effects of Scutellarin on PI3K/AKT/mTOR signaling pathway-related genes and inflammatory factors[（ ），n=6）]

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化的病程進(jìn)展與慢性炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等病理過(guò)程密切相關(guān)，尋找有效的防治AS 的靶點(diǎn)有重要的臨床意義。燈盞花在傳統(tǒng)的中醫(yī)中藥有著悠久的民族藥理歷史，燈盞乙素作為一種燈盞花的主要活性成份，目前學(xué)者們正在研究其對(duì)各種組織損傷的保護(hù)作用。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)燈盞乙素可通過(guò)降低胞內(nèi)Ca2+濃度、促NO、釋放抗脂質(zhì)過(guò)氧化及調(diào)控抗氧化酶與氧化酶活性等，降低氧化應(yīng)激作用保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣的作用[9]，然而其作用機(jī)制并不明確，同時(shí)缺乏分子水平的驗(yàn)證研究。因此，深入研究分析燈盞乙素抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)制，探索其潛在作用靶點(diǎn)，對(duì)臨床應(yīng)用提供重要的參考價(jià)值。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法構(gòu)建基于Scutellarin 的“藥物-作用靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)[10]。筆者的PPI 交互用網(wǎng)絡(luò)研究結(jié)果提示，燈盞乙素與AS 的交集靶點(diǎn)包括LDL-R，TNF-α，AKT1等，參與機(jī)體的各種炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)過(guò)程，以上結(jié)果表明Scutellarin 可能是通過(guò)這些靶點(diǎn)來(lái)干預(yù)動(dòng)脈粥樣硬化的病程進(jìn)展的。GO 功能富集分析顯示BP 主要包括MAP 激酶活性的正調(diào)控、平滑肌細(xì)胞增殖的正調(diào)控、Ras 蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多數(shù)與平滑肌細(xì)胞增殖，氧化應(yīng)激反應(yīng)等相關(guān)，推測(cè)燈盞乙素干預(yù) AS 的病程進(jìn)展與平滑肌細(xì)胞增殖等相關(guān)的生物過(guò)程密切相關(guān)。另外，KEGG結(jié)果表明，燈盞乙素可同時(shí)作用于多種與AS 疾病相關(guān)的信號(hào)通路，包括PI3K/AKT 信號(hào)通路（hsa04151）、Ras 信號(hào)通路（hsa04014）、MAPK 信號(hào)通路（hsa04010）等，其中PI3K/AKT 信號(hào)通路顯著富集。大量研究表明，PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路與血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移密切相關(guān)[11]。白藜蘆醇可通過(guò)調(diào)控PI3K/AKT 信號(hào)通路抑制此效應(yīng)發(fā)生，發(fā)揮抗肺動(dòng)脈高壓治療作用[12]。另有研究證實(shí)[13]，磷酸化蛋白分子p-AKT、p-mTOR的過(guò)度表達(dá)可引起肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖。綜上，燈盞乙素治療AS 是通過(guò)多成份，多靶點(diǎn)，多途徑發(fā)揮協(xié)同作用的，筆者發(fā)現(xiàn) PI3K/AKT 信號(hào)通路參與增殖、分化、凋亡等多細(xì)胞多因子的調(diào)節(jié)功能，在細(xì)胞代謝、細(xì)胞周期調(diào)控及細(xì)胞增殖凋亡等諸多生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，因此筆者選擇PI3K/AKT 信號(hào)通路作為筆者研究的靶標(biāo)。

因此，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果，筆者在APOE-/-小鼠AS 動(dòng)物模型上進(jìn)行RT-PCR 的驗(yàn)證。因?yàn)锳S 動(dòng)物模型是研究動(dòng)脈粥樣硬化病理生理機(jī)制、尋找有效藥物的重要前提，選擇和復(fù)制合適的動(dòng)物模型是評(píng)價(jià)抗 AS 作用必不可少的研究工具[14]。筆者選擇高脂飲食喂養(yǎng)的APOE-/-小鼠復(fù)制AS 動(dòng)物模型，該模型顯示了頭干動(dòng)脈粥樣硬化伴不穩(wěn)定AS 斑塊的特征，被認(rèn)為是研究動(dòng)脈粥樣硬化的理想模型[15]。在AS 整體動(dòng)物模型上，RT-qPCR 的驗(yàn)證結(jié)果提示，Scutellarin 通過(guò)調(diào)控PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路，抑制炎癥反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。筆者的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)一步確認(rèn)了燈盞乙素治療AS 的可靠性，為其進(jìn)一步進(jìn)入臨床應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析方法，結(jié)合有效成分、靶點(diǎn)預(yù)測(cè)、GO 富集分析、KEGG 分析等，從系統(tǒng)的角度預(yù)測(cè)了燈盞乙素治療動(dòng)脈粥樣硬化的分子機(jī)制。另外，通過(guò)APOE-/-小鼠AS 模型對(duì)篩選出的靶點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證，確認(rèn)燈盞乙素調(diào)控PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路，抑制小鼠AS 模型炎癥反應(yīng)的過(guò)程，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到治療AS 的目的。本研究可為將燈盞乙素研究成為自主創(chuàng)新和云南特色植物來(lái)源的防治AS 的藥物提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。