李玉曉 ，賀銘 ，王天蓉 ，姚永剛 ，王雨

（1）昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，云南 昆明 650032;2）昆明醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，云南 昆明 650500;3）中國科學(xué)院昆明動物研究所動物模型與人類疾病機理重點實驗室，云南 昆明 650223;4）中山大學(xué)附屬第七醫(yī)院耳鼻咽喉科，廣東 深圳 517108）

變應(yīng)性鼻炎（allergic rhinitis，AR）是特應(yīng)性個體對變應(yīng)原產(chǎn)生的主要由特異性免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）介導(dǎo)的鼻黏膜非感染性慢性炎癥性疾病，成為全球性公共的健康問題。對患者的生活質(zhì)量和勞動能力造成嚴重的影響，并造成嚴重的社會經(jīng)濟負擔[1]，AR 是哮喘的高危因素[2]。全球約10%～20%的人口罹患該病[3]，我國城市的發(fā)病率在9.6%～23.9%[4]之間。臨床發(fā)現(xiàn)近年來AR 的患病率顯著增加趨勢。AR 的發(fā)病機制復(fù)雜，尚不完全清楚，目前主要觀點認為：AR 的發(fā)病機制是由炎性細胞、細胞因子、轉(zhuǎn)錄因子以及趨化因子等組成的復(fù)雜信息網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)相互作用的結(jié)果。新近研究發(fā)現(xiàn)，2 型濾泡輔助性T 細胞和濾泡調(diào)節(jié)性T 細胞在IgE 的產(chǎn)生中起重要的調(diào)節(jié)作用，2 型先天性淋巴樣細胞參與了早期2 型免疫反應(yīng)[5?7]。在這復(fù)雜的炎癥信息網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)中Thl 和Th2 細胞及其相應(yīng)的細胞因子可能在變應(yīng)性炎癥過程中起關(guān)鍵性作用，Th2 細胞免疫增強而Thl 細胞免疫降低，以Th2 細胞免疫反應(yīng)為主的炎性反應(yīng)造成變應(yīng)性疾病[8]。Th1 和Th2分化與轉(zhuǎn)化受多種因素影響，如局部微環(huán)境中多種細胞因子的作用、遺傳背景等，其中，特異性轉(zhuǎn)錄因子T-bet、GATA-3 在T 細胞亞群分化過程中具有重要的調(diào)節(jié)作用。GATA-3 和IL-4 是Th2特異性轉(zhuǎn)錄因子和細胞因子，對Th2 型細胞因子的轉(zhuǎn)錄起關(guān)鍵作用[9?10]。T-bet 能夠阻斷或抑制Th2 細胞分化信號，誘導(dǎo)已分化的Th2 向相反的Th1 細胞方向分化，是Th1 細胞分化的特異性轉(zhuǎn)錄因子[11]。GATA-3 是Th2 細胞分化，增殖，存活的關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，能促使Th2 細胞因子IL-4，IL-5，IL-13 的表達[12]。有研究[13]發(fā)現(xiàn)：在AR動物模型PBMCs 中GATA-3 mRNA 表達增強，Tbet mRNA 表達降低，大蒜新素能有效地降低GATA-3 mRNA 表達，增強T-bet mRNA 的表達，恢復(fù)二者的免疫平衡，改善臨床癥狀。其他的研究[14?15]結(jié)果也發(fā)現(xiàn)了AR 動物模型中PBMCs 中GATA-3 mRNA 表達增強，T-bet mRNA 表達降低。因此，Th2 細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子GATA-3 在變應(yīng)性鼻炎的發(fā)病中可能起著關(guān)鍵作用，可能是未來治療AR 的一個靶點。

慢病毒（Lentivirus）載體是以人類免疫缺陷型病毒（human immunodeficiency virus，HIV）為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體，它對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力，可以在體內(nèi)較長期的表達而其安全性高，是目前常用的RNA 干擾技術(shù)[16]。RNA 干擾技術(shù)多見于腫瘤疾病的研究，但鮮見于變應(yīng)性疾病的研究。本研究團隊[17]前期針對目的基因靶基因序列，成功制備并篩選出最佳的慢病毒介導(dǎo)的RNAi 載體si-GATA-3。本研究的目的是研究si-GATA-3 能否在體外有效地調(diào)節(jié)AR 小鼠外周血PBMCs 中GATA-3 mRNA 和Tbet mRNA 及其相應(yīng)蛋白和相應(yīng)的下游細胞因子IL-4 和IFN-γ 的表達，并糾正AR 中Th2/Th1 的免疫失衡。假定si-GATA-3 能夠成功在體外糾正AR 中Th2/T1 的免疫失衡，將為今后的體內(nèi)實驗打下堅實的基礎(chǔ)，并為今后AR 治療提供一種嶄新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

（1）主要試劑：Platimum HIFI Taq Polymerase、高保真擴增酶、Platinum Taq DNA Polymerase（Takara 公司，日本），100 mmol/L dNTPs（Promega公司，美國），DH5α 感受態(tài)細胞（威斯騰生物，中國 ），stbI3 感受態(tài)細胞、包裝質(zhì)粒Packing Mix（Sigma 公司，美國），293T 細胞（中科院上海細胞所，中國），Oligo Dt/隨機引物/特異性引物（威斯騰生物，中國 ），限制性內(nèi)切酶（Invitrogen公司，美國），T4 ligase 連接酶（NEB 公司，英國），慢病毒干擾載體PL/shRNA/F、Lipofectamine 2000（Invitrogen公司，美國），胎牛血清（Invitrogen公司，美國），AMV Reverase Transcriptase（Promega，美國），DNase/RNase-free，Random Primer d（N）6（上海申能博彩，中國），Trzol（Invitrogen 公司，美國），SYBR Green I（Invitrogen 公司，美國），F(xiàn)icoll 400（Sigma，美國），RPMI1640 培養(yǎng)基（Gibco，美國），DMEM/F12 培養(yǎng)基（Gibco，美國），牛血清白蛋白（BSA）（Gibco，美國），臺盼藍（Sigma，美國），淋巴細胞分離液（Sigma，美國），卵蛋白（OVA）（Sigma，美國），引物（上海生工，中國），RT 試劑（威斯騰生物，中國），熒光定量PCR 試劑（威斯騰生物，中國），T-bet antibody sc-21003、GATA-3 antibody sc-9009（Santa Cruz，美國）等。（2）主要設(shè)備：熒光定量PCR 儀（FTC2000，加拿大），CO2恒溫孵箱（TC2323，SHEL LAB 公司，美國），熒光倒置顯微系統(tǒng)（BMI 3000，Leica 公司），測序儀（ABI3730，Invitrogen 公司，美國），GDS8000 凝膠掃描系統(tǒng)（UVP，美國），電泳儀（Bio-rad，美國），微量 DNA/RNA 定量儀（GeneGuent Pro，美國），梯度PCR 儀（Eppendorf MG，德國），紫外分光光度儀（Eppendorf MG，德國），高速恒溫離心機和低溫高速離心機（Beckman，美國），電子分析天平（Precisa12A，瑞士），光學(xué)倒置顯微鏡（Olympus AX70，日本），隔熱式電熱恒溫培養(yǎng)箱（XMTH-142，中國），細胞培養(yǎng)箱（Shellab，美國），細胞計數(shù)板（上海醫(yī)用儀器廠，中國）等。

1.2 實驗方法

1.2.1 si-GATA-3 的制備根據(jù)李玉曉等[17]的文獻報道的方法對抑制 GATA-3 基因慢病毒載體進行構(gòu)建、包裝、純化及慢病毒病毒載體濃度滴定。

1.2.2 變應(yīng)性鼻炎小鼠模型的制備實驗動物：Specific pathogen-free（SPF）級BALB/C小鼠，40只（購于昆明醫(yī)科大學(xué)動物中心），4～6 周齡，體重15～18 g，獲得昆明醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會批準。隨機分為2 組，AR 組30 只，正常對照組10 只。小鼠在SPF 級實驗室喂養(yǎng)1 周，觀察無異常進入動物實驗。

AR 小鼠模型的制備：AR 組：（30 只）致敏階段：第1 天每只小鼠腹腔注射抗原溶液0.1% OVA 0.1 mL（OVA100 μg）+100 g/L 氫氧化鋁凝膠0.2Ml（20 mg）。第7、14、21 天同樣劑量、方法加強。激發(fā)階段：致敏結(jié)束后，間歇1 周，于第27 天后的連續(xù)7 d，1% OVA 溶液20 μL 滴鼻激發(fā)，10 μL/鼻孔。

正常對照組（10 只）：小鼠在致敏階段和激發(fā)階段，用等體積的0.9%的生理鹽水代替OVA，其它同AR 模型的建立。

記錄末次激發(fā)后30 min 內(nèi)每只小鼠的癥狀積分。符合AR 模型標準[18]的進入下一階段的實驗，見表1。

表1 AR 小鼠癥狀評分標準Tab.1 Symptom scoring criteria for AR mice

1.2.3 si-GATA-3 載體感染AR 小鼠PBMCs（1）細胞分離方法，于末次激發(fā)結(jié)束后10 h 腹腔內(nèi)注射3%戊巴比妥鈉（1 mL/kg）麻醉，以眼球途徑取血，血液滴入肝素抗凝管中，取足1mL 新鮮血液，加入PBS 溶液按1∶1 稀釋血液；取稀釋血液，在分離液上方1 cm 處沿試管壁徐徐加入，使血液重懸于淋巴細胞分離液上（血液∶分離液=2∶1）；室溫，水平離心2000 r/min，20 min；吸取PBMCs，加5 倍以上體積的PBS 溶液洗滌2 次，每次離心1500 r/min，10 min；棄上清液，加入1640 培養(yǎng)液1 mL，取少量進行細胞計數(shù)，細胞活性在95%以上；PBMCs 樣本（30 個）分組：將AR 小鼠PBMCs 隨機等分為3 組，即RNAi 載體（si-GATA-3 group）、空載體組（si-NC group）和陽性對照組（AR group）。正常對照組PBMCs 樣本（10 個）（Control group）。

（2）細胞培養(yǎng)方法：將收集的PBMCs 集中于離心管中用培養(yǎng)液洗滌2 次，分別以2500 r/min和2000 r/min 離心各10 min，棄上清，之后進行接種。嚴格無菌操作。將接種后的培養(yǎng)瓶放CO2培養(yǎng)箱中，條件37 ℃、5%CO2、95%O2飽和度。從24 h 開始每24 h 添加等體積的培養(yǎng)液。每6～8 h 晃動1 次培養(yǎng)器皿。（3）si-GATA-3 轉(zhuǎn)染PBMCs：①RNAi 載體組（si-GATA-3 group）：將收集的AR 小鼠PBMCs，無血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細胞密度為3～5×106/mL，裝到不同的1.5 mL離心管中，每管200 μL 細胞懸液。準備病毒載體（si-GATA-3）：凍存在-80 ℃的病毒載體先在冰上融化，根據(jù)慢病毒使用量參考公式：細胞感染復(fù)數(shù)MOI=慢病毒滴度×慢病毒使用量/細胞數(shù)目，按照MOI=20 進行后續(xù)試驗，計算好每孔所需病毒原液量，同時加入5 μg/mL 的Polybrene 助轉(zhuǎn)染試劑?；靹蚝髮?.5 mL 管放在37 ℃、5%CO2飽和度培養(yǎng)箱中孵育過夜。將管中混合溶液吸出加到12 孔板里，加入足夠量的新鮮培養(yǎng)液，500 μL/孔。8～12 h 以后觀察細胞狀態(tài)。細胞狀態(tài)與未感染組無明顯差異，表明慢病毒對細胞沒有明顯毒性作用，繼續(xù)培養(yǎng)，感染72 h 后，熒光顯微鏡觀察熒光表達情況，估計慢病毒感染目的細胞的效率；②空載體組（si-NC group）：將等量的si-NC 加入AR 小鼠PBMCs 培養(yǎng)液中共培養(yǎng)；方法同①；③陽性對照組（AR group）：生理鹽水代替si-GATA-3 載體與AR 小鼠PBMCs 共培養(yǎng)，方法同①；④正常對照組（Control group）：用生理鹽水取代si-GATA-3 載體與正常小鼠PBMCs 共培養(yǎng)，方法同（1）。

對上述各組共培養(yǎng)的PBMCs 進行分離，分離出PBMCs 和上清液，以備用于測定PBMCs 中GATA-3 mRNA、T-bet mRNA 及其相應(yīng)蛋白相對表達量以及檢測上清液中細胞因子IL-4 和IFNγ 的含量。

1.2.4 GATA-3 mRNA 和T-bet mRNA 及其相應(yīng)蛋白以及IL-4 和IFN-γ 的表達（1）熒光定量Q-PCR 技術(shù)測定PBMCs 中GATA-3 mRNA 和T-bet mRNA 的表達量，RNA 的提取 ：用Trizol進行RNA 的提?。▏栏癜碦NA 的提取試劑盒說明）。提取的RNA-70℃保存。GATA-3 和T-bet mRNA 及內(nèi)參β-actin mRNA 引物序列及大小，見表2。①反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：2×RT buffer 10 μL，6N 隨機引物（100 pmol/μL）1 μL，RT-mix 1 μL，模板（RNA）1 μL，DEPC 水 3 μL，共20 μL。反應(yīng)條件：25 ℃ 10 min，42 ℃ 50 min，85 ℃ 5 min；②熒光定量PCR 反應(yīng)體系：2×PCR buffer 25 μL，Primers（25 pmol/μL）1 μL×2，Sybr green I 0.5 μL，模板（cDNA）2 μL，DEPC 水 20.5 μL。擴增條件：94 ℃ 4 min，94 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s 循環(huán)35 次，72 ℃檢測信號；③用熒光定量PCR 儀進行檢測。熒光定量PCR 結(jié)果用2-ΔΔCT表示目標基因的相對表達量。

表2 GATA-3 和T-bet mRNA 引物Tab.2 The primer of GATA-3 and T-bet mRNA

（2）用ELISA 法檢測細胞培養(yǎng)上清液中細胞因子IL-4 和IFN-γ 的水平：將上述PBMCs 培養(yǎng)分離的上清液，再次離心。嚴格按ELISA 試劑盒說明檢測細胞培養(yǎng)上清液中IL-4 和IFN-γ 的表達量。

（3）Western bloting 技術(shù)檢測PBMCs 中GATA-3 和T-bet 蛋白相對表達量。目標基因的相對表達水平用目標基因與GAPDH 灰度值比率表示。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 慢病毒載體的制備

成功地構(gòu)建了抑制 GATA-3 基因的慢病毒載體LV3-GATA3-Mus-1615（si-GATA-3），并進行了包裝、純化及慢病毒載體濃度滴定，si-GATA-3 的滴度為5×108TU/mL。LV3NC（si-NC）陰性對照（滴度為3×108TU/mL）。

2.2 AR 小鼠模型的制備

末次激發(fā)后30min 內(nèi)，AR 模型組30 只小鼠中出現(xiàn)撓鼻、噴嚏、流涕等癥狀，癥狀積分為（7±1.2）分；而對照組小鼠上述癥狀均不明顯，癥狀積分為（3±1.4）分，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.002），表示造模成功。鼻黏膜病理（HE 染色）顯示，AR 小鼠鼻黏膜嗜酸性粒細胞較正常對照組增多，見圖1。從病理上證實造模成功。

圖1 病黏膜病理（HE）。AR 組小鼠鼻黏膜中嗜酸性粒細胞較正常組小鼠增多（×200）Fig.1 Nasal mucosa pathology in normal mice and allergic rhinitis mice（×200）

2.3 si-GATA-3 的細胞轉(zhuǎn)染

研究發(fā)現(xiàn)，si-GATA-3 感染AR 小鼠外周血PBMCs 的倒置熒光顯微鏡圖像中有較好的轉(zhuǎn)染效率，見圖2A；含有GFP 的LV3NC（si-NC）的陰性對照圖像，PBMCs 中仍可見大量的LV3NC 轉(zhuǎn)染細胞，見圖2B；使用qPCR 鑒定GATA-3 慢病毒轉(zhuǎn)染效率，與對照組相比，AR+si-GATA-3 組中GATA-3 mRNA 表達量顯著降低，顯示si-GATA-3 有較好的PBMCs 的感染效率，見圖2C。

圖2 si-GATA-3 感染AR 小鼠外周血PBMCs 效率的檢測Fig.2 Detection of transfecting effeciency of si-GATA-3 for PBMCs in allergic rhinitis mouse

2.4 si-GATA-3 對AR 小鼠外周血PBMCs 中GATA-3 mRNA 和T-bet mRNA 及其相應(yīng)蛋白表達的調(diào)控

研究結(jié)果顯示：GATA-3 mRNA 相對表達量：si-GATA-3 組GATA-3 mRNA 相對表達量明顯低于AR 組和si-NC 組，AR 組和si-NC 組均明顯高于正常對照組（P<0.01），但AR 組和si-NC 組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見圖3A。Tbet mRNA 相對表達量：si-GATA-3 組T-bet mRNA 相對表達量明顯高于AR 組和si-NC 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；AR 組和si-NC 組均明顯低于正常對照組，AR 組和si-NC 組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見圖3B。Western blotting 灰度圖像，si-GATA-3 組T-bet 蛋白相對表達量較AR 組和si-NC 組明顯增強，均少低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖4A；而AR 組和si-NC 組無變化；而si-GATA-3 組GATA-3 蛋白的相對表達量較AR 組和si-NC 組明顯降低，與正常對照組相比無變化，AR組和si-NC 組較正常對照組明顯增強，但二組無明顯變化。GATA-3 蛋白相對表達量，見圖4B：si-GATA-3 組GATA-3 蛋白相對表達量較AR 組和si-NC 組明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），AR 組和si-NC 組，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），si-GATA-3 組與正常對照組，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。T-bet 蛋白的相對表達量，見圖4C：si-GATA-3 組T-bet 蛋白相對表達量較AR 組和si-NC 組明顯增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），AR 組和si-NC 組，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），si-GATA-3 組與正常對照組，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。因此，si-GATA-3 能顯著上調(diào)AR 小鼠PBMCs 中T-bet mRNA 及其蛋白的表達，顯著下調(diào)GATA-3 mRNA 及其蛋白的表達。si-GATA-3 能夠從轉(zhuǎn)錄水平糾正Th2/Th1細胞免疫失衡。

圖3 si-GATA-3 對AR 小鼠外周血PBMCs 中GATA-3 mRNA 和T-bet mRNA 表達的調(diào)控Fig.3 Regulation of si-GATA-3 on relative expressions of GATA-3 and T-bet mRNA in PBMCs of allergic rhinitis mouse

圖4 si-GATA-3 對AR 小鼠外周血PBMCs 中GATA-3 和T-bet 蛋白表達的調(diào)控Fig.4 Regulation of si-GATA-3 on Relative expressions of GATA-3 and T-bet protein in PBMCs of allergic rhinitis mouse

2.5 si-GATA-3 對AR 小鼠外周血PBMCs 培養(yǎng)上清液中IL-4 和IFN-γ 的調(diào)控

結(jié)果顯示：上清液中IL-4 含量，見圖5A：AR 組與si-NC 組IL-4 含量明顯高于正常對照組和si-GATA-3 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），但AR 組與si-NC 組間，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），si-GATA-3 組稍高于AR 組，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。上清液中IFN-γ 的含量，見圖5B：si-GATA-3 組IFN-γ 的含量明顯高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；AR 組與si-NC 組明顯高于AR 組和si-GATA-3 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。因此，si-GATA-3 能明顯下調(diào)PBMCs 中IL-4 的表達，與AR 組相比也下調(diào)了IFN-γ 表達，與正常對照組相比，明顯上調(diào)了IFN-γ 表達。上述T-bet mRNA 及其蛋白的表達上調(diào)不一致?？傊?，si-GATA-3 能夠調(diào)節(jié)Th2、Th1 細胞因子的表達，糾正Th2/Th1 細胞免疫失衡。

圖5 si-GATA 對AR 小鼠外周血PBMCs 培養(yǎng)上清液液中IL-4 和IFN-γ 的調(diào)控Fig.5 Regulation of si-GATA-3 on Relative expressions of IL-4 and IFN-γ in supernatant of the cultured PBMCs of allergic rhinits mouse

3 討論

變應(yīng)性鼻炎（AR）是特應(yīng)性體質(zhì)的患者對外界致敏原所發(fā)生的變態(tài)反應(yīng)的鼻部表現(xiàn)，其發(fā)病機制復(fù)雜且尚不完全清楚。目前研究認為Th1 和Th2 類細胞及其相應(yīng)的細胞因子可能在變應(yīng)性炎癥過程中起關(guān)鍵性作用。Th2 細胞免疫增強而Thl 細胞免疫降低，以Th2 細胞免疫反應(yīng)為主的炎癥性反應(yīng)造成變應(yīng)性疾病[8]。GATA-3 是Th2細胞分化，增殖，存活的關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，能促使Th2 細胞因子IL-4，IL-5，IL-13 的表達[12]。T-bet 是Th1 細胞分化的關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，GATA-3 是調(diào)節(jié)Th2 細胞分化的重要的轉(zhuǎn)錄因子，能使Th0 細胞向Th2 細胞分化，能抑制向Th1 細胞分化，并逆轉(zhuǎn)分化的Th1 細胞向Th2 細胞分化[19?20]。研究發(fā)現(xiàn)：季節(jié)性AR 患者鼻甲黏膜標本中FOXP3 +、GATA-3+細胞數(shù)量增多，激素能減少GATA-3+細胞數(shù)量，而T-bet+細胞數(shù)量不變，且不受花粉和鼻用激素的影響[21]。筆者研究[13]發(fā)現(xiàn)：在AR 動物模型中PBMCs 中GATA-3 mRNA表達增強，T-bet mRNA 表達減弱。大蒜新素能降低GATA-3 mRNA 表達，增強T-bet mRNA 的表達，恢復(fù)二者的免疫平衡，改善小鼠AR 癥狀。因此，筆者認為在外界致敏原的作用下轉(zhuǎn)錄基因GATA-3 的過表達可能是AR 發(fā)生的分子免疫學(xué)基礎(chǔ)。其它研究結(jié)果[14?15]也證實這一結(jié)論?？傊D(zhuǎn)錄因子GATA-3 可能在AR 的發(fā)病機制中起著重要作用，以Th2 細胞免疫增強為主Th1/Th2 細胞免疫失衡可能是AR 的發(fā)病機制之一。

目前AR 的治療多以藥物治療為主，能有效控制臨床癥狀，但用藥時間長，患者依從性較差，并加重家庭和社會經(jīng)濟負擔。免疫治療是近年來研究的熱點，療效佳，但治療時間較長，費用昂貴，且部分患者依從性較差，疫苗的種類較少，不能滿足所有的AR 患者的需求。為探索過敏性疾病的治療方法，一些學(xué)者進行了有益的探索。轉(zhuǎn)錄因子GATA-3 的反義寡鏈核苷酸，可以減少哮喘小鼠體內(nèi)Th2 型細胞因子的產(chǎn)生，降低氣道高反應(yīng)性，減少嗜酸性粒細胞的浸潤[22]。IL-5的siRNA，可以顯著降低哮喘小鼠氣道高反應(yīng)性，降低支氣管灌洗液中extonin 水平，以及肺組織中IL-5 的水平[23]。加大Th1 型相關(guān)細胞因子的表達也是改變Th 細胞平衡的方法之一，如卵清蛋白致敏小鼠內(nèi)轉(zhuǎn)染重組基因，可以抑制Th2 型細胞免疫反應(yīng)，Th2 相關(guān)細胞因子IL-4，IL-5，血清特定IgE 水平、嗜酸性粒細胞肺含量均顯著降低，氣道高反應(yīng)性得以抑制[24?25]。miRNA-135a 干預(yù)AR 小鼠，結(jié)果顯示miRNA-135a 能增強小鼠鼻黏膜中GATA-3 mRNA 和IL-4 mRNA 及其相應(yīng)蛋白的表達，減弱小鼠鼻黏膜中T-bet mRNA 和IFN-γ mRNA 及其相應(yīng)蛋白的表達[26]。以上研究從不同方面糾正GATA-3 mRNA、TbetmRNA 及其相應(yīng)蛋白與相應(yīng)細胞因子的表達，都顯示一定的調(diào)節(jié)作用，都可能通過某一途徑對關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子起作用，都可能作為治療過敏性疾病的一種方法。因為T-bet 是Th1 細胞分化的關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子；GATA-3 是調(diào)節(jié)Th2 細胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，能使Th0 細胞向Th2 細胞分化，能抑制向Th1 細胞分化，并逆轉(zhuǎn)分化的Th1 細胞向Th2 細胞分化；新近的文獻[27]表明調(diào)節(jié)Th2 細胞分化的機制仍不清楚，非編碼RNA 可能對GATA-3 的表達起關(guān)鍵作用，進一步證明GATA-3 在AR 的發(fā)病機制中起重要作用。慢病毒介導(dǎo)的 RNAi 具有對分裂和非分裂細胞均有感染作用、容納外源性基因片段大、感染后可以整合到受感染細胞的基因組進行長時間的穩(wěn)定表達且未見病理損害現(xiàn)象等顯著優(yōu)點[28]。因此，筆者設(shè)計針對GATA-3 mRNA 的siRNA 慢病毒載體在體外干預(yù)AR 小鼠的PBMCs，研究si-GATA-3 是否能夠有效調(diào)節(jié)PBMCs 中GATA-3 mRNA 與T-betmRNA及其相應(yīng)蛋白的表達，進而調(diào)節(jié)IL-4 與IFN-γ的表達尚不清楚。本研究結(jié)果顯示：si-GATA-3對AR 中PBMCs 無毒害，且有較高的轉(zhuǎn)染效率，能顯著地減弱GATA-3 mRNA 及其蛋白的表達，進而下調(diào)其下游細胞因子IL-4 的表達；能顯著地增強PBMCs 中T-bet mRNA 及其蛋白的表達。但，本實驗結(jié)果顯示AR 小鼠PBMCs 培養(yǎng)液IFN-γ表達增強，與筆者以往的研究結(jié)果[13]不一致，且與本實驗中T-bet mRNA 及其蛋白表達水平也不一致，究其什么原因，值得進一步研究。因此，si-GATA-3 在體外實驗中能特異而有效、穩(wěn)定地阻斷PBMCs 中靶基因GATA-3mRNA 及其蛋白的表達，進而減少IL-4 的表達，逆轉(zhuǎn)了Th2 細胞的過表達，同時增強了Th1 細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Tbet mRNA 的表達，進而增強T-bet 蛋白的表達，從特異性轉(zhuǎn)錄糾正了以Th2 細胞免疫增強為主的Thl/Th2 細胞免疫失衡。這也為進一步研究si-GATA-3 能否體內(nèi)調(diào)節(jié)AR 小鼠PBMCs 中的GATA-3 mRNA 與T-betmRNA 及其相應(yīng)蛋白的表達打下堅實的實驗基礎(chǔ)，提供理論依據(jù)。

本研究創(chuàng)新之處是：根據(jù)Thl 和Th2 細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子T-bet 和GATA-3 在特定的條件下能相互抑制對方的表達的特性，筆者利用si-GATA-3 在體外對AR 小鼠PBMCs 進行干預(yù)，研究si-GATA-3 是否能同時調(diào)節(jié)GATA-3mRNA、T-bet mRNA 及其相應(yīng)蛋白的表達，結(jié)果顯示，si-GATA-3 能同時調(diào)節(jié)GATA-3mRNA、T-bet mRNA及其相應(yīng)蛋白的表達，糾正Thl/Th2 細胞免疫失衡，這與以往文獻[22?26]報道的通過某一途徑對關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子起作用不同。

總之，si-GATA-3 在體外能夠有效地抑制AR 小鼠PBMCs 中GATA-3 mRNA 及其蛋白的表達，進而減少IL-4 的表達；增強T-betmRNA 及其蛋白的表達，糾正以Th2 細胞免疫增強為主的Th1/Th2 細胞免疫失衡。利用RNA 干擾技術(shù)對AR 發(fā)病機制中起關(guān)鍵作用的過表達基因進行有效的基因沉默，恢復(fù)免疫平衡，以達到免疫治療的目的，為AR 患者提供一種新的治療思路和方法，為臨床從基因水平進行免疫治療提供理論依據(jù)。si-GATA-3 在體內(nèi)能否有效的調(diào)節(jié)AR 小鼠BMCs 中GATA-3 mRNA、T-bet mRNA 及其相應(yīng)蛋白的表達，恢復(fù)免疫平衡，消除臨床癥狀，仍有待繼續(xù)研究，為探索對人AR 從基因水平進行臨床免疫治療提供理論基礎(chǔ)。