王冠賢 李寶林 唐愛民 黃永湘

(儋州市人民醫(yī)院骨科，海南 儋州 571700)

骨缺損是常見的臨床問題，主要由創(chuàng)傷，生理性、病理性骨吸收導致〔1〕。在整形外科中，需要通過骨再生修復缺損提高患者的生活質量，而在一些骨疾病中，需要通過骨再生治療恢復丟失的骨量〔2，3〕。人骨髓間充質干細胞(hBMSC)是具有多種分化潛能的細胞，主要向成骨細胞、脂肪細胞分化，對調控骨組織重建、代謝有重要作用〔4，5〕。微小RNA(miRNA)是一類由18～25個核苷酸組成的非編碼小分子RNA，通過調控靶基因的表達，影響細胞的增殖、凋亡、分化等過程〔6〕。研究發(fā)現(xiàn)，miR-21在hBMSC的成骨分化調控中起重要作用〔7〕。長鏈非編碼RNA(lncRNA)生長特異抑制物(GAS)5作為一種lncRNA，與miR-21存在互補區(qū)域，可以競爭性與miR-21結合形成沉默復合體，進而影響miR-21發(fā)揮作用〔8〕。但lncRNA GAS5在成骨分化方面尚缺乏研究。本研究旨在探討lncRNA GAS5調控miR-21對hBMSC成骨分化的影響。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器 hBMSC細胞(批號：os101059)購自美國ATCC細胞庫；α-MEM培養(yǎng)基(批號：MEP10-10LT)購自美國Caisson Labs公司；Lipofectamine 2000轉染試劑(批號：11668019)購自美國Invitrogen公司；TRIzol試劑、逆轉錄試劑盒(批號：R0016、D7168S)購自上海碧云天生物技術有限公司；蛋白提取試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白測定試劑盒(批號：BB-3009、BB2108)購自上海貝博生物科技公司；實時熒光定量-聚合酶鏈反應(qRT-PCR)試劑盒(批號：K1002S)購自美國Promega公司；成骨分化試劑盒(批號：A1007201)購自美國GIBCO公司；堿性磷酸酶(ALP)染色試劑盒(批號：121862)購自北京凱瑞基生物科技有限公司；ALP活性測定試劑盒(批號：8258)購自美國Sciencell公司；Runt相關轉錄因子(RUNX)2抗體、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)2抗體、骨唾液蛋白(BSP)抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體(批號：ab76956、ab14933、ab52128、ab181602)購自英國Abcam公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗(批號：0295G-HRP)購自美國Santa公司；negative control-GAS5、GAS5 mimic、nonsense siRNA、GAS5 siRNA序列及GAS5、miR-21、RUNX2、BMP2、BSP、ALP、U6、GAPDH引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；恒溫培養(yǎng)箱(型號：MIR-162-PC/MIR-262-PC)購自日本松下公司；顯微鏡(型號：CX31)購自日本Olympus公司；酶標儀(型號：ChemiDocXRS)、化學發(fā)光成像系統(tǒng)(型號：MODEL550)購自美國Bio-Rad公司；熒光定量PCR儀(型號：ABI 7500)購自美國Applied Biosystems公司。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 含有10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基將hBMSC制成單細胞懸液，接種于多聚賴氨酸包被的T-75培養(yǎng)瓶，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。次日更換培養(yǎng)基，此后每3天更換1次培養(yǎng)基。待細胞融合率達到85%左右時，用胰蛋白酶消化、傳代培養(yǎng)。將對數(shù)期hBMSC以1×104個/孔接種于96孔培養(yǎng)板，分為：對照組、mimic NC組、GAS5 mimic組、siRNA NC組和GAS5 siRNA組，其中對照組hBMSC不進行轉染，mimic NC組、GAS5 mimic組、siRNA NC組和GAS5 siRNA組hBMSC使用Lipofectamine 2000轉染試劑分別轉染negative control-GAS5、GAS5 mimic、nonsense siRNA、GAS5 siRNA。

1.2.2qRT-PCR檢測各組hBMSC中l(wèi)ncRNA GAS5、miR-21及成骨相關因子mRNA表達情況 將轉染處理后的hBMSC培養(yǎng)48 h，收集細胞，qRT-PCR檢測lncRNA GAS5、miR-21表達水平，內參基因為U6、GAPDH；將轉染處理后的hBMSC誘導成骨分化培養(yǎng)7 d，收集細胞，qRT-PCR檢測RUNX2、BMP2、BSP、ALP mRNA表達水平，內參基因為GAPDH。使用TRIzol試劑提取細胞總RNA，逆轉錄合成cDNA，反應程序：95℃預變性10 min；95℃變性10 s，55℃退火35 s，72℃延伸1 min，循環(huán)40次。引物lncRNA GAS5上游：5′-AAGCCATTGGCACAGGCATTAG-3′，下游：5′-AGAACCATTAAGCTGGTCCAGGCA-3′；miR-21上游：5′-TAGCTTATCAGACTGATGTTGA-3′，下游：5′-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3′；內參U6上游：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；內參GAPDH上游：5′-GTCGGTGTGAACGGATTTG-3′，下游：5′-TCCCATTCTCAGCCTTGAC-3′；RUNX2上游：5′-TTCACCTTGACCATAACCGTC-3′，下游：5′-GGCGGTCAGAGAACAAACTAG-3′；BMP2上游：5′-GGTATCACGCCTTTTACTGCC-3′，下游：5′-ACACCCACAACCCTCCACAA-3′；BSP上游：5′-CACTGGAGCCAATGCAGAAGA-3′，下游：5′-TGGTGGGGTTGTAGGTTCAAA-3′；ALP上游：5′-AGAATCTGGTGCAGGAATGG-3′，下游：5′-TCGTATTTCATGTCTCCAGGC-3′。相對表達量均以2-ΔΔCt法表示，Ct值為擴增產物的熒光信號達到臨界閾值時對應的循環(huán)數(shù)。

1.2.3各組hBMSC ALP染色情況 經轉染處理后，將hBMSC誘導成骨分化培養(yǎng)7 d，按ALP染色試劑盒說明書進行ALP染色。棄上清液，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，4%多聚甲醛固定30 s，PBS洗滌，每孔加500 μl顯色反應液，37℃避光孵育30 min，蒸餾水漂洗直至不再脫色，顯微鏡照相。

1.2.4各組hBMSC ALP活性檢測 經轉染處理后，將hBMSC誘導成骨分化培養(yǎng)7 d，PBS洗滌，加入30 μl/孔細胞裂解液振蕩裂解30 min，加入50 μl/孔緩沖液及50 μl/孔基質液，混勻后37℃恒溫水浴15 min，加入150 μl顯色劑，在酶標儀520 nm波長處測定每孔的ALP活性。

1.2.5Western印跡檢測各組hBMSC中成骨相關因子蛋白表達 經轉染處理后，將hBMSC誘導成骨分化培養(yǎng)7 d，收集細胞，使用蛋白提取試劑盒提取各組細胞總蛋白，使用BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度并進行定量。電泳分離等量蛋白質并轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉1 h，分別加入RUNX2抗體、BMP2抗體、BSP抗體、GAPDH抗體(均為1∶500)，4℃孵育過夜，TBST洗滌后加辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗(1∶5 000)，室溫孵育1 h，免疫反應化學發(fā)光法顯色，Tanon 600圖像分析系統(tǒng)拍攝圖像并分析條帶灰度，目的蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/內參GAPDH灰度值。

1.3統(tǒng)計學分析 采用SPSS24.0軟件進行單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1各組hBMSC中l(wèi)ncRNA GAS5、miR-21表達情況 對照組、mimic NC組、siRNA NC組間hBMSC中l(wèi)ncRNA GAS5、miR-21表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與mimic NC組相比，GAS5 mimic組hBMSC中l(wèi)ncRNA GAS5水平顯著升高(P<0.05)，miR-21水平顯著降低(P<0.05)；與siRNA NC相比，GAS5 siRNA組hBMSC中l(wèi)ncRNA GAS5水平顯著降低(P<0.05)，miR-21水平顯著升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組hBMSC中l(wèi)ncRNA GAS5、miR-21表達水平比較

2.2各組hBMSC中成骨相關因子mRNA表達情況 對照組、mimic NC組、siRNA NC組間hBMSC中RUNX2、BMP2、BSP、ALP mRNA表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與mimic NC組相比，GAS5 mimic組hBMSC中RUNX2、BMP2、BSP、ALP mRNA水平顯著降低(均P<0.05)；與siRNA NC相比，GAS5 siRNA組hBMSC中RUNX2、BMP2、BSP、ALP mRNA水平顯著升高(均P<0.05)。見表2。

2.3各組hBMSC中ALP染色情況 對照組、mimic NC組、siRNA NC組間hBMSC細胞ALP染色無明顯差異；與mimic NC組相比，GAS5 mimic組hBMSC細胞ALP染色明顯減弱；與siRNA NC組相比，GAS5 siRNA組hBMSC細胞ALP染色明顯增強。見圖1。

2.4各組hBMSC中ALP活性 對照組、mimic NC組、siRNA NC組間hBMSC中ALP活性差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與mimic NC組相比，GAS5 mimic組hBMSC中ALP活性顯著降低(P<0.05)；與siRNA NC相比，GAS5 siRNA組hBMSC中ALP活性顯著升高(P<0.05)。見表2。

2.5各組hBMSC中成骨相關因子蛋白表達情況 對照組、mimic NC組、siRNA NC組間hBMSC中RUNX2、BMP2、BSP蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與mimic NC組相比，GAS5 mimic組hBMSC中RUNX2、BMP2、BSP蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)；與siRNA NC相比，GAS5 siRNA組hBMSC中RUNX2、BMP2、BSP蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。見表3、圖2。

表2 各組hBMSC中RUNX2、BMP2、BSP、ALP mRNA水平及ALP活性比較

圖1 各組hBMSC中ALP染色

表3 各組hBMSC中RUNX2、BMP2、BSP蛋白表達水平比較

1～5：對照組、mimic NC組、GAS5 mimic組、siRNA NC組、GAS5 siRNA組圖2 各組hBMSC中RUNX2、BMP2、BSP蛋白表達情況

3 討 論

骨缺損是全球性的健康問題，與創(chuàng)傷及骨質疏松、骨折等多種骨疾病的發(fā)生有關。研究表明，骨主要包括促進骨形成的成骨細胞和促進骨吸收的破骨細胞，是一個連續(xù)的動態(tài)平衡組織，在正常的骨組織中，兩種細胞處于平衡狀態(tài)，一旦平衡打破，成骨細胞的骨生成低于破骨細胞的骨吸收，就會導致骨破壞疾病的發(fā)生〔9，10〕。骨再生是由成骨細胞、破骨細胞、其他多種細胞及細胞因子共同參與的復雜修復過程，是破骨細胞介導骨吸收及成骨細胞介導的骨形成的一個動態(tài)平衡過程。hBMSC是骨組織工程的重要種子細胞，具有自我克隆增殖及向成脂細胞、成骨細胞等分化的能力，臨床常通過體外誘導使hBMSC分化成軟骨、成骨細胞等，在多種疾病的治療中發(fā)揮作用〔11〕。lncRNA是一類長度超過200個核苷酸的RNA分子，缺乏較明顯的開放閱讀框，具有較低甚至不具有翻譯蛋白質的功能，通過介導表觀遺傳修飾、轉錄調控、轉錄后調控及其他的特定調控模式發(fā)揮作用〔12〕。研究發(fā)現(xiàn)，許多l(xiāng)ncRNA與成骨細胞、破骨細胞相關，參與骨再生過程的調控，同時與骨關節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展有著密切的聯(lián)系〔13,14〕。Li等〔15〕發(fā)現(xiàn)lncRNA GAS5的表達在骨關節(jié)炎軟骨中上調，并且可能通過上調基質金屬蛋白酶(MMP)-9、MMP-13、BMP-2和ADAMTS5 mRNA表達水平促進骨關節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展。Song等〔16〕發(fā)現(xiàn)lncRNA GAS5在骨關節(jié)炎軟骨細胞中表達上調，可能通過增加幾種MMPs的表達水平，影響軟骨退化和骨關節(jié)炎進展。本研究結果提示GAS5可能影響成骨分化過程中ALP、RUNX2、BMP2、BSP等成骨分化標志基因的轉錄、翻譯水平，在hBMSC成骨分化過程中起負向調節(jié)作用〔17〕。研究表明，miRNA在細胞凋亡、分化等生理病理過程中有重要作用。彭建強等〔18〕研究表明，miR-21可外調控MC3T3-E1細胞成骨分化，在骨形成過程發(fā)揮作用。宋琪玲等〔19〕研究表明，miR-21可以通過增強BMP9/Smad信號通路的激活程度，促進hBMSC C3H10T1/2細胞成骨分化過程。而鄭偉等〔20〕研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA-GAS5作為miR-21的“分子海綿”，通過“吸收”miR-21從而調控miR-21對靶基因的抑制。本研究結果提示在hBMSC中，GAS5可能通過調控miR-21，進而影響hBMSC細胞的成骨分化過程。

綜上，lncRNA GAS5在hBMSC成骨分化過程中發(fā)揮負向調控作用，可能與抑制miR-21表達有關。lncRNA GAS5有望作為成骨分化的調控靶點，但將其應用在骨再生臨床治療中，還需進一步在體內進行驗證。