褚 巖 駱長永 鄒 喬 陳一凡 孔煜榮 陳 瑜 李 雁△

（1.北京市朝陽區(qū)雙橋醫(yī)院，北京 100121；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，北京 100078）

急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）屬于一種臨床危重癥，病死率極高，臨床表現(xiàn)以呼吸窘迫、進(jìn)行性的低氧血癥為主。ARDS的病死率極高，重癥患者的病死率為40%以上，幸存者仍存在認(rèn)知功能下降、持續(xù)骨骼肌肉無力和抑郁的風(fēng)險[1]。目前本病尚無特效藥物，以支持肺保護(hù)性機(jī)械通氣治療為主。隨著中醫(yī)藥研究的進(jìn)展，中藥單藥、成藥、自擬方等對ARDS體現(xiàn)出確切療效[2]。益氣化瘀解毒方是杜懷棠教授治療ARDS的經(jīng)驗方，該方由黃芪、黃芩、金銀花、三七、赤芍、炒枳實(shí)、葶藶子和桑白皮組成。前期我們通過多次動物實(shí)驗研究對該方進(jìn)行藥效學(xué)評價，結(jié)果均證明益氣化瘀解毒方能有效減輕ARDS大鼠模型的肺損傷，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)免疫、炎癥等通路相關(guān)[3-6]。為進(jìn)一步探索該方中不同治法對ARDS大鼠模型的炎癥抑制作用，本研究對益氣化瘀解毒方進(jìn)行拆分，構(gòu)建ARDS大鼠模型，探討不同拆方組合對ARDS大鼠模型TLR4-NLRP3通路及炎性因子的影響，旨在探索益氣化瘀解毒方中發(fā)揮主要炎癥抑制作用的最佳藥物組合，為科學(xué)簡化處方、中藥新藥研發(fā)提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗動物 大鼠購自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號：SCXK（京）2019-0008，雄性SD大鼠30只，SPF級，體質(zhì)量（180±10）g。動物飼養(yǎng)于中醫(yī)內(nèi)科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗室中心屏障動物房，溫度22～24℃，濕度50%～70%。本動物實(shí)驗通過北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院實(shí)驗動物福利與倫理委員會審批通過（審批號：19-54）。

1.2 試藥與儀器 益氣化瘀解毒方拆方——益氣解毒：黃芪30 g，黃芩10 g，金銀花15 g。益氣化瘀解毒方拆方——益氣化瘀：黃芪30 g，三七10 g，赤芍15 g。益氣化瘀解毒方拆方——益氣逐飲組：黃芪30 g，葶藶子15 g，桑白皮15 g，炒枳實(shí)15 g。藥材由中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所提供，并制作成中藥濃縮浸膏。大腸桿菌內(nèi)毒素脂多糖（L6511，Sigma公司）、大鼠Toll樣受體4（TLR4）、NLRP3、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-18（IL-18）ELISA試劑盒（MB-1762A/MB-6880A/MB-1588B/MB-1735B，江蘇酶標(biāo)生物科技有限公司）、藥物天平（HCTP1110，上海精密儀器儀表有限公司）。

1.3 分組及給藥 將30只SD大鼠隨機(jī)分為5組，即空白對照組、模型組、益氣解毒組、益氣化瘀組、益氣逐飲組，每組6只，分別稱量并記錄?？瞻讓φ战M、模型組大鼠予1 mL/100（g·d）蒸餾水灌胃，益氣解毒組、益氣化瘀組、益氣逐飲組分別予對應(yīng)其治法的1 mL/（100 g·d）中藥液灌胃，按12.2 g/（kg·d）（劑量換算方法：按照成人按體質(zhì)量60 kg計算，以大鼠與成人6倍系數(shù)換算所得，給藥劑量為生藥劑量）予中藥溶液灌胃給藥。各組連續(xù)灌胃7 d。

1.4 模型制備 第7日灌胃后6 h造模，造模方法采用一次尾靜脈注射脂多糖誘導(dǎo)全身炎癥反應(yīng)所致ARDS模型[4]。給予模型組、益氣解毒組、益氣化瘀組、益氣逐飲組大鼠脂多糖溶液（2 mg/kg）一次性經(jīng)尾靜脈注射，對照組相應(yīng)給予0.9%氯化鈉注射液（2 mg/kg）尾靜脈注射。

1.5 標(biāo)本采集及檢測 1）肺組織病理：造模16 h后，腹腔注射3%戊巴比妥鈉（0.1 mL/100 g）進(jìn)行麻醉，取大鼠右下肺，制成病理切片后進(jìn)行HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察組織學(xué)形態(tài)，包括：肺泡間隔變化情況，局部炎癥細(xì)胞浸潤程度，肺毛細(xì)血管充血、水腫情況等。2）酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測TLR4-NLRP3通路及炎性因子相關(guān)蛋白：IL-1β、IL-18采取腹主動脈血，TLR4、NLRP3采取肺泡灌洗液及肺組織勻漿，采集的樣本進(jìn)行ELISA檢測，操作步驟參考試劑盒說明完成。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析應(yīng)用Graphpad Prism7軟件完成。本實(shí)驗結(jié)果均為計量資料，采用（）進(jìn)行描述性展示，采用單因素方差分析整體進(jìn)行差異性檢驗，兩兩組間比較時先進(jìn)行方差齊性檢驗（Levene法），方差齊則釆用LSD-t檢驗，方差不齊則釆用Dunnetts-t檢驗。P＜0.05被認(rèn)為具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肺組織病理學(xué)觀察 空白對照組大鼠的肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔內(nèi)未見組織液，肺間質(zhì)無水腫，肺組織中見少量炎性細(xì)胞浸潤。模型組大鼠的肺泡及肺間質(zhì)水腫，肺泡壁增厚，大多數(shù)肺泡腔縮小變形，部分肺泡塌陷，伴隨有炎性細(xì)胞大量浸潤，細(xì)支氣管腔和肺泡腔內(nèi)可見分泌物，偶見紅細(xì)胞。各拆方組大鼠的肺泡及間質(zhì)水腫較模型組有所改善，肺泡結(jié)構(gòu)較為完整，肺泡腔塌陷較少，出血、滲出減少，見圖1。

圖1 各組大鼠肺組織病理情況（HE染色，200倍）

2.2 各組大鼠肺勻漿中TLR4、NLRP3表達(dá)水平比較 見表1。與空白對照組相比，模型組肺勻漿中TLR4表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，益氣解毒組、益氣化瘀組、益氣逐飲組肺勻漿中TLR4表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。與空白對照組相比，模型組肺勻漿中NLRP3表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，益氣化瘀組肺勻漿中NLRP3表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），益氣解毒組、益氣逐飲組肺勻漿中NLRP3表達(dá)平均水平有所降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠肺勻漿中TLR4、NLRP3表達(dá)水平比較（ng/mL，±s）

表1 各組大鼠肺勻漿中TLR4、NLRP3表達(dá)水平比較（ng/mL，±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與空白對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組別空白對照組模型組益氣解毒組益氣化瘀組益氣逐飲組n 6 6 6 6 6 TLR4 770.53±88.27 993.71±60.78△△816.88±54.19**802.21±141.44 878.49±48.56*NLRP3 7.03±0.30 7.37±0.82△7.11±0.38 7.03±0.33*7.13±0.28

2.3 各組大鼠肺泡灌洗液中TLR4、NLRP3表達(dá)水平比較 見表2。與空白對照組相比，模型組肺泡灌洗液中TLR4表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，益氣解毒組、益氣化瘀組、益氣逐飲組肺泡灌洗液中TLR4表達(dá)水平有不同程度地降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與空白對照組相比，模型組肺泡灌洗液中NLRP3表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，益氣解毒組、益氣化瘀組、益氣逐飲組肺泡灌洗液中NLRP3表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.01）。

表2 各組大鼠肺泡灌洗液中TLR4、NLRP3表達(dá)水平比較（±s）

表2 各組大鼠肺泡灌洗液中TLR4、NLRP3表達(dá)水平比較（±s）

組別空白對照組模型組益氣解毒組益氣化瘀組益氣逐飲組n 6 6 6 6 6 TLR4（ng/mL）288.70±27.48 331.44±10.50△△311.42±31.04 321.73±15.78 305.31±24.38 NLRP3（pg/mL）63.03±2.42 71.92±2.68△△62.13±4.99**65.14±1.61**65.10±2.63**

2.4 各組大鼠血清IL-1β、IL-18水平比較 見表3。與空白對照組相比，模型組血清IL-1β水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，益氣解毒組、益氣化瘀組、益氣逐飲組血清IL-1β表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。與空白對照組相比，模型組IL-18水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，益氣解毒組、益氣化瘀組、益氣逐飲組IL-18水平顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。

表3 各組大鼠血清中IL-1β、IL-18表達(dá)水平比較（pg/mL，±s）

表3 各組大鼠血清中IL-1β、IL-18表達(dá)水平比較（pg/mL，±s）

組別n IL-1βIL-18空白對照組模型組益氣解毒組益氣化瘀組益氣逐飲組6 6 6 6 6 114.43±18.14 154.65±29.55△△109.49±23.96**87.83±19.82**118.90±27.77*170.01±11.06 197.38±24.23△△165.95±10.26**173.72±17.79*176.40±15.21*

3 討論

近年來，ARDS的發(fā)病率呈上升趨勢[7]。ARDS的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，炎癥反應(yīng)貫穿始終，炎癥反應(yīng)失控是ARDS的關(guān)鍵病理環(huán)節(jié)[8]。研究表明，TLR4-NLRP3通路在ARDS的過度炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，微生物產(chǎn)物或細(xì)胞損傷相關(guān)的內(nèi)源性分子能通過與TLR4結(jié)合，激活先天免疫系統(tǒng)[9]。如細(xì)菌內(nèi)毒素脂多糖可激活TLR4受體，并通過核轉(zhuǎn)錄因子-κB途徑來上調(diào)NLRP3炎癥小體的表達(dá)[10]，進(jìn)一步促進(jìn)下游IL-1β和IL-18的成熟和釋放[11]，進(jìn)而引起急性肺損傷導(dǎo)致ARDS。

根據(jù)ARDS呼吸困難、喘促氣急等臨床表現(xiàn)，可將其歸屬為中醫(yī)“暴喘”“肺衰”等范疇。本病與“虛”“瘀”“毒”“飲”密切相關(guān)，主要病機(jī)為感受外來邪氣或遭受外傷，肺失宣降，水液代謝異常，飲邪停肺；肺宣降失司，氣機(jī)逆亂，還可致氣血運(yùn)行不暢，氣滯血瘀，外邪與飲邪、瘀血阻肺，久而化熱，邪熱壅滯肺內(nèi)，耗傷氣陰，瘀滯愈重，瘀熱、飲邪釀而為毒，毒邪阻結(jié)于肺，損傷肺絡(luò)，致使肺氣驟虛、衰敗，進(jìn)而影響全身臟腑功能，甚則危及生命[12]。因此，“瘀飲化毒，肺氣衰敗”是ARDS的核心病機(jī)所在，而本病的治法應(yīng)以“解毒、化瘀、逐飲、大補(bǔ)肺氣”為主。

本研究將益氣化瘀解毒湯拆分為益氣解毒方、益氣化瘀方和益氣逐飲方，3方中均重用黃芪以大補(bǔ)肺氣，挽驟衰之本。研究表明，黃芪可通過降低細(xì)胞間黏附分子-1及血管細(xì)胞間黏附分子-1表達(dá)水平，從而減輕肺損傷[13]。此外，針對“毒”“瘀”“飲”病理因素，不同拆方配以“解毒”“化瘀”“逐飲”治法。益氣解毒方以黃芩、金銀花清熱解毒，研究證明，黃芩苷可抑制脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷大鼠TLR4/JNK/ERK/NF-κB通路，發(fā)揮炎癥抑制作用以減輕肺損傷[14]。金銀花提取物可通過抑制IL-1、IL-6和TNF-α炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子，發(fā)揮保護(hù)ARDS大鼠模型肺組織的作用[15]。益氣化瘀方以三七、赤芍活血化瘀，三七皂苷Rb1可降低ARDS模型大鼠炎癥程度，通過改善肺組織線粒體結(jié)構(gòu)與功能發(fā)揮肺保護(hù)作用[16]，赤芍可通過促進(jìn)微循環(huán)，改善組織血流灌注，提高ARDS動物模型的血液氧合功能[17]。益氣逐飲方以葶藶子、桑白皮瀉肺逐飲，有研究表明葶藶子具有改善ARDS患者心臟功能，減少血管外肺水的作用[18]。

本研究結(jié)果提示，各拆方均可降低ARDS大鼠模型炎性因子IL-1β和IL-18的表達(dá)水平，其機(jī)制可能是通過抑制TLR4的表達(dá)進(jìn)而減少NLRP3的產(chǎn)生來發(fā)揮炎癥抑制作用，其中益氣解毒組對于TLR4-NLRP3通路的抑制作用更為明顯。大量炎癥細(xì)胞活化及炎癥介質(zhì)的釋放可視為中醫(yī)的邪毒化火，本研究證實(shí)益氣解毒方在各拆方組中抑制炎癥通路及炎癥因子表達(dá)的作用最為顯著。此外，ARDS病理環(huán)節(jié)中毒與血瘀和飲邪密切相關(guān)，故化瘀、逐飲可損毒之源，益毒之解，本研究亦證實(shí)益氣化瘀方、益氣逐飲方確有一定抗炎作用。

綜上所述，益氣解毒化瘀方不同拆方均可抑制ARDS大鼠模型TLR4、NLRP3的表達(dá)，進(jìn)一步降低IL-1β和IL-18的表達(dá)水平，改善肺組織病理學(xué)形態(tài)，減輕肺損傷，其中益氣解毒方可能發(fā)揮主要作用。因此，TLR4-NLRP3通路可能是益氣解毒化瘀方不同拆方發(fā)揮抗炎作用干預(yù)ARDS的重要機(jī)制之一。