王欣榮 唐智超 曾茂 呂正 翟龍飛 張新宜 劉超蘭 褚以文 王克華 黃挺,*

(1 成都大學(xué)藥學(xué)院，抗生素研究與再評(píng)價(jià)四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610106；2 華北制藥集團(tuán)愛諾有限責(zé)任公司，石家莊 052165)

多殺菌素(spinosad)是一類由土壤放線菌刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa,S.spinosa)經(jīng)有氧發(fā)酵產(chǎn)生的大環(huán)內(nèi)酯類化合物[1-5]。天然的多殺菌素類化合物的母核由一個(gè)12元大環(huán)內(nèi)酯與一個(gè)鼠李糖和一個(gè)福樂糖胺通過糖苷鍵相連構(gòu)成，根據(jù)連接的化學(xué)基團(tuán)的差異而將其主要活性成分分為spinosad A和spinosad D[6-7]。多殺菌素具有新穎的作用機(jī)制，它以昆蟲的神經(jīng)系統(tǒng)為作用靶標(biāo)，引起害蟲持續(xù)的肌肉收縮、顫抖和麻痹，導(dǎo)致害蟲癱瘓死亡，因其獨(dú)特的攝食及觸殺毒性，其廣泛的作用譜涵蓋鱗翅目、纓翅目、雙翅目、鞘翅目以及膜翅目等多類害蟲[8-10]。多殺菌素兼具生物農(nóng)藥的安全性和化學(xué)合成農(nóng)藥的速效性，作為農(nóng)用抗生素的杰出代表，有望為我國生物農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)提供一個(gè)新的經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)點(diǎn)。但多殺菌素的生產(chǎn)開發(fā)一直由美國陶氏益農(nóng)公司和禮來公司所壟斷，國內(nèi)研究起步晚，發(fā)展水平和產(chǎn)量較低，推廣應(yīng)用難度大。

本實(shí)驗(yàn)室前期通過對(duì)刺糖多孢菌進(jìn)行多輪理化改造，獲得一株多殺菌素高產(chǎn)突變株SS-168。分子生物學(xué)技術(shù)手段的發(fā)展成熟為刺糖多孢菌的理性改造提供了更可靠的手段。目前，刺糖多孢菌的全基因組測(cè)序工作已全部完成[11]，并闡明了多殺菌素的相關(guān)生物合成途徑[12-13]。多殺菌素生物合成基因大部分聚集在刺糖多孢菌基因組上約80kb大小的區(qū)域中，包含Ⅰ型聚酮合酶的編碼基因、鼠李糖轉(zhuǎn)移和修飾基因和福樂糖胺的合成及轉(zhuǎn)移基因。其中負(fù)責(zé)鼠李糖合成的基因gtt、gdh/kre和epi位于染色體的不同位置[14]。研究表明，通過增加多殺菌素合成相關(guān)基因拷貝數(shù)，即提高多殺菌素生物合成基因簇內(nèi)某些基因的表達(dá)水平可提高菌株的多殺菌素產(chǎn)量[15]。蔡妹等[16]構(gòu)建了含有bldD基因和紅霉素強(qiáng)啟動(dòng)子(PermE)的重組載體pUC-spn-PermE-bldD和遺傳性能穩(wěn)定的重組菌株S.spinosa-BldD。其結(jié)果顯示，重組菌株多殺菌素(A+D)產(chǎn)量相比對(duì)照菌株提高了1.35倍。了解刺糖多孢菌在發(fā)酵過程中各個(gè)時(shí)期與多殺菌素生物合成直接相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄水平，并對(duì)不同菌株間的差異進(jìn)行比對(duì)分析是刺糖多孢菌的理性改造的重要前提[17]。

本研究通過對(duì)刺糖多孢菌野生型菌株SS-WT和高產(chǎn)突變株SS-168在發(fā)酵過程中轉(zhuǎn)錄本的變化進(jìn)行分析和對(duì)比，發(fā)現(xiàn)氨基酸生物合成通路發(fā)生了顯著變化。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證了甘氨酸/絲氨酸/蘇氨酸代謝通路中差異基因的表達(dá)，并結(jié)合發(fā)酵發(fā)現(xiàn)部分氨基酸的添加能夠直接提高多殺菌素產(chǎn)量。這些有趣的結(jié)果將為進(jìn)一步提高刺糖多孢菌的多殺菌素產(chǎn)量提供重要的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種

刺糖多孢菌(S.spinosa)SS-WT(SSIA-1802)和高產(chǎn)突變株SS-168(ESA-611)由本研究組保藏[18]。

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

1.2.1 培養(yǎng)基[18]

(1)種子培養(yǎng)基：玉米淀粉，1%；酵母浸粉，1.6%；葡萄糖，0.4%；七水硫酸鎂，0.28%；pH 6.7～7.0。

(2)斜面培養(yǎng)基：葡萄糖，0.5%；全脂奶粉，2%；酵母浸粉，0.3%；七水硫酸鎂，0.28%；瓊脂，1.6%。

(3)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖，12%；水溶性棉籽餅粉，2.5%；酶水解N-Z-Amine A，0.6%；牛奶蛋白胨，0.5%；酵母浸粉，0.5%；七水硫酸鎂，0.28%；碳酸鈣，0.3%；豆油，1%；pH 7.0。

1.2.2 培養(yǎng)條件

溫度：29℃；相對(duì)濕度：35%；轉(zhuǎn)速：220 r/min。

1.3 試劑與儀器

玉米淀粉、酵母浸粉、全脂奶粉、水溶性棉籽餅粉、酶水解N-Z-Amine A、牛奶蛋白胨等為生化試劑，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

主要使用儀器設(shè)備及其型號(hào)廠商如下：AE240型精密電子分析天平，瑞士Mettler-Toledo公司；LDZM-80KCS-Ⅱ型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-1FD型凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；HPS-160型生化培養(yǎng)箱，哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)公司；THZ-92A汽浴恒溫振蕩器，上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司；Legend Micro 17R 高速冷凍離心機(jī)，Thermo Scientific 公司。

1.4 刺糖多孢菌發(fā)酵樣品制備及測(cè)序

使用斜面培養(yǎng)基分別培養(yǎng)刺糖多孢菌SS-WT菌株和SS-168菌株，靜置于29℃培養(yǎng)7 d；取適量孢子接入種子培養(yǎng)基中，置于搖床中220 r/min，29℃培養(yǎng)3 d；再按8%接種量將種子培養(yǎng)液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于搖床中220 r/min，29℃培養(yǎng)7 d；使用Cell Total RNA Isolation Kit(成都福際生物技術(shù)有限公司)提取分別刺糖多孢菌SS-WT菌株和SS-168菌株的總RNA后構(gòu)建互補(bǔ)DNA文庫，再利用Illumina Hiseq2000測(cè)序技術(shù)進(jìn)行測(cè)序(北京諾禾致源生物信息科技有限公司)，每個(gè)菌株3個(gè)重復(fù)[19]。

1.5 轉(zhuǎn)錄組組裝和差異基因表達(dá)分析

組裝方法參考已報(bào)道的文獻(xiàn)[19]。利用Stringtie軟件進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)分析，再利用Gene Ontology(GO)數(shù)據(jù)庫分析差異表達(dá)的基因功能相似性[20]。此外，再使用Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)數(shù)據(jù)庫(http://www.genome.jp/kegg/)和KOBAS(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/)軟件進(jìn)行差異基因在KEGG通路的富集分析[19]。

1.6 層次聚類分析

為了進(jìn)一步分析高產(chǎn)刺糖多孢菌菌株的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，應(yīng)用層次聚類將相似的元素聚集在二叉樹中。再從基因表達(dá)譜中提取DEGs的表達(dá)數(shù)值并應(yīng)用pheatmap軟件進(jìn)行層次聚類分析[19]。

1.7 熒光定量PCR

分別提取發(fā)酵7 d的刺糖多孢菌SS-WT菌株和SS-168菌株的RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA(RT EasyTMⅡKit, 成都福際生物技術(shù)有限公司)，選擇顯著差異的甘氨酸/絲氨酸/蘇氨酸代謝通路的7個(gè)DEGs進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證。使用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)的引物列于表1中，引物序列由成都擎科偉業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。20 μL熒光定量PCR反應(yīng)體系為：2×SYBR green mix 10 μL，cDNA 模板1 μL，正反向引物各0.4 μL，ddH2O 8.2 μL(Real Time PCR EasyTM-SYBR Green I Kit, 成都福際生物技術(shù)有限公司)。熒光定量PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min，95℃變性15 s，58℃退火并延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。溶解曲線參數(shù)為: 65℃～95℃，每10 s 上升0.5℃。以Sigma因子sigA作為內(nèi)參基因[17]，采用2-ΔΔCt法分析比較同一目的基因不同時(shí)期的相對(duì)表達(dá)水平，內(nèi)參基因和目的基因都做3個(gè)復(fù)孔。

表1 本研究使用的熒光定量PCR引物Tab.1 Fluorescent quantitative PCR primers used in this study

1.8 氨基酸種類及其添加濃度對(duì)多殺菌素產(chǎn)量的影響

參照本實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵方法[18]，在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加不同濃度的甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸(0，0.2，1，5，10和15 mmol/L)(北京索萊寶科技有限公司)，于發(fā)酵第11天取發(fā)酵液1.0 mL，加入5 mL無水乙醇，震搖10 min，高速離心得上清液，HPLC分析多殺菌素的含量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示。數(shù)據(jù)均由SPSS 17.0軟件處理，采用單因素方差分析(ANOVA)，組間差異采用t檢驗(yàn)。P＜0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 測(cè)序與組裝

為了獲得刺糖多孢菌的完整轉(zhuǎn)錄組，本研究構(gòu)建了發(fā)酵7 d的SS-168及SS-WT樣品組成的cDNA文庫并對(duì)其進(jìn)行測(cè)序，共計(jì)得到了6個(gè)測(cè)序文庫。每個(gè)組中均生成了超過1.8×107條原始序列。在過濾和清除不可信數(shù)據(jù)后，各組分別產(chǎn)生了2.79G、4.23G、3.06G、2.85G、2.7G、3.18G數(shù)據(jù)。Q20的平均百分比和GC含量均超過了97%和67%(表2)。

表2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和組裝結(jié)果Tab.2 Summary of transcriptome analysis

2.2 基因表達(dá)水平分析

基因表達(dá)以FPKM計(jì)算。為了表征刺糖多孢菌SS-168及SS-WT菌株的mRNA的表達(dá)模式，使用FPKM值構(gòu)建了熱圖，以確定兩個(gè)菌株的總體轉(zhuǎn)錄組差異(圖1)。結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)錄組中有超過75%的基因表達(dá)了(FPKM＞1)，紅色表示高表達(dá)基因，藍(lán)色表示低表達(dá)基因。

2.3 差異基因分析

通過數(shù)據(jù)預(yù)處理，計(jì)算這些基因的log2FoldChange和FDR值，以分析刺糖多孢菌SS-168及SS-WT的差異基因。與SS-WT菌株相比，共在SS-168菌株樣本中鑒定出1341個(gè)差異基因，包括255個(gè)上調(diào)基因和1086個(gè)下調(diào)基因(圖2)。

2.4 差異基因的GO分析和KEGG分析

在提取差異基因的表達(dá)值后，對(duì)差異基因進(jìn)行層次聚類分析。GO注釋將這些差異表達(dá)基因參與的生物學(xué)功能分為2類：生物過程(biological process)和分子功能(molecular function)(圖3)。生物過程主要參與氧化還原過程和脂質(zhì)代謝。而分子功能方面則包括氧化還原酶活性和輔因子結(jié)合及輔酶結(jié)合等。GO注釋在不同功能類別中的分布表明了差異基因的實(shí)質(zhì)多樣性(圖3)。

此外，我們確定了由單基因類別代表的生化途徑。差異基因的KEGG注釋表明，它們分布在與丙氨酸/天冬氨酸/谷氨酸代謝(16個(gè)基因)、脂肪酸降解(23個(gè)基因)、精氨酸/脯氨酸代謝(23個(gè)基因)、甘氨酸/絲氨酸/蘇氨酸代謝(26個(gè)基因)(表3)。在已確定的功能類別中，微生物多樣環(huán)境代謝和氨基酸生物合成的比例最高，其次是纈氨酸亮氨酸及異亮氨酸降解、苯丙氨酸代謝和苯丙酮鹽代謝。

表3 差異基因富集的顯著性KEGG通路Tab.3 The KEGG pathways annotated in the transcriptome

2.5 熒光定量PCR分析

為了比較高產(chǎn)菌株SS-168與原始菌株SS-WT中氨基酸生物合成基因的轉(zhuǎn)錄水平差異，選擇顯著差異的甘氨酸/絲氨酸/蘇氨酸代謝通路的7個(gè)DEGs進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。由圖4可知，與原始菌株SS-WT相比，各7個(gè)DEGs的轉(zhuǎn)錄水平在高產(chǎn)菌株SS-168中均顯著上調(diào)，高產(chǎn)菌中soxG、soxB和soxD基因的轉(zhuǎn)錄水平分別比原始菌株提高更為顯著(圖4)。這些比較分析表明，qPCR數(shù)據(jù)和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的一致率為100%，證實(shí)了RNA-seq數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。

2.6 氨基酸種類及其添加濃度對(duì)多殺菌素產(chǎn)量的影響

基于上述轉(zhuǎn)錄組分析和熒光定量PCR分析，本研究進(jìn)一步探究了氨基酸及其添加濃度對(duì)高產(chǎn)菌株SS-168中多殺菌素產(chǎn)量的影響。如圖5所示，甘氨酸在添加濃度為1 mmol/L時(shí)對(duì)多殺菌素產(chǎn)量的促進(jìn)作用最為顯著，添加濃度繼續(xù)增加時(shí)則會(huì)降低多殺菌素產(chǎn)量(圖5A)。而添加低濃度的絲氨酸對(duì)多殺菌素產(chǎn)量的提高無明顯效果，只有在添加濃度為15 mmol/L時(shí)對(duì)多殺菌素產(chǎn)量有顯著促進(jìn)作用(圖5B)。蘇氨酸的添加濃度為5～15 mmol/L之間時(shí)對(duì)刺糖多孢菌產(chǎn)多殺菌素產(chǎn)量顯著提高，添加濃度低于5 mmol/L時(shí)對(duì)多殺菌株產(chǎn)量無明顯的促進(jìn)作用(圖5C)。通過對(duì)添加3種氨基酸的發(fā)酵液的HPLC譜圖分析發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵液中多殺菌素的含量顯著提高，詳細(xì)譜圖見圖6(甘氨酸)、圖7(絲氨酸)和圖8(蘇氨酸)。

3 討論

刺糖多孢菌SS-168是本實(shí)驗(yàn)室前期篩選獲得的一株多殺菌素產(chǎn)量較高的突變菌株[18]，該菌株基因組中含有23個(gè)多殺菌素合成相關(guān)基因，包含從丙酸開始的聚酮鏈合成、大環(huán)內(nèi)酯核分子內(nèi)的交聯(lián)反應(yīng)、鼠李糖糖基的轉(zhuǎn)移和甲基化以及福樂糖胺糖基的合成和連接的全部基因。除此之外，還含有參與鼠李糖合成的gtt、gdh、kre、epi基因[11]。在SS-168轉(zhuǎn)錄組樣本中鑒定出1341個(gè)差異基因，包括255個(gè)上調(diào)基因和1086個(gè)下調(diào)基因。分析認(rèn)為這些基因表達(dá)水平的差異可能影響了高產(chǎn)菌株SS-168合成多殺菌素的能力。

將SS-168與SS-WT轉(zhuǎn)錄組的GO注釋進(jìn)行對(duì)比。其結(jié)果反映SS-168在氧化還原相關(guān)基因中具有相對(duì)較高的遺傳多樣性水平。這表明在多殺菌素生物合成過程中，相關(guān)酶的合成代謝活動(dòng)旺盛。而KEGG功能分布結(jié)果顯示在SS-168菌株中的微生物多樣環(huán)境代謝和氨基酸生物合成代謝通路發(fā)生顯著性變化。盡管與氨基酸生物合成相比，與微生物多樣環(huán)境代謝相關(guān)的轉(zhuǎn)錄物數(shù)量要多一些，但微生物多樣環(huán)境代謝中的大多數(shù)途徑都參與氨基酸生物合成并在合成系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。KEGG注釋表明，DEGs主要分布在與丙氨酸/天冬氨酸/谷氨酸代謝通路、脂肪酸降解通路、精氨酸/脯氨酸代謝通路、甘氨酸/絲氨酸/蘇氨酸代謝通路。其中富集在甘氨酸/絲氨酸/蘇氨酸代謝通路的DEGs最多，因此本研究選擇了該通路做進(jìn)一步的發(fā)酵優(yōu)化。

伍小穎等[21]考察了18種氨基酸添加對(duì)多殺菌素產(chǎn)量的影響,其研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅精氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、蘇氨酸、甘氨酸和絲氨酸的添加對(duì)多殺菌素產(chǎn)量有顯著的促進(jìn)作用，組氨酸、谷氨酸、亮氨酸和脯氨酸的添加對(duì)多殺菌素產(chǎn)量變化沒有影響，而另外8種氨基酸的添加會(huì)降低多殺菌素產(chǎn)量，但并不清楚這些氨基酸與多殺菌素生物合成的內(nèi)在聯(lián)系。本研究是基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)選擇了具有顯著性差異的甘氨酸/絲氨酸/蘇氨酸代謝通路，并發(fā)現(xiàn)了這些氨基酸添加濃度的變化能影響多殺菌素產(chǎn)量。因此本研究建立的聯(lián)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)和發(fā)酵優(yōu)化的方法更具有指向性和可操作性。分析認(rèn)為氨基酸除直接參與多殺菌素合成過程中關(guān)鍵酶的合成，還能通過某些代謝途徑轉(zhuǎn)化成中間代謝產(chǎn)物進(jìn)入到三羧酸循環(huán)中，進(jìn)一步提供刺糖多孢菌生長(zhǎng)及其合成代謝所需的能量，這可能是本研究中部分氨基酸(如甘氨酸和蘇氨酸)能促進(jìn)多殺菌素產(chǎn)量的原因；而某些氨基酸如低濃度的絲氨酸對(duì)多殺菌素的產(chǎn)量提高作用不顯著，可能是由于刺糖多孢菌能夠自身合成該氨基酸或利用轉(zhuǎn)氨基作用及時(shí)補(bǔ)充。此外有些氨基酸也會(huì)抑制多殺菌素的合成，可能是因?yàn)榘被岬奶砑邮沟门囵B(yǎng)基的pH或某些理化因素發(fā)生變化，影響刺糖多孢菌的生長(zhǎng)，進(jìn)而導(dǎo)致多殺菌素產(chǎn)量降低。

在類似的聚酮類抗生素如紅霉素和阿維菌素等，某些前體物質(zhì)如油脂類的添加，也能顯著的提升抗生素的發(fā)酵產(chǎn)量。例如在紅霉素的發(fā)酵過程中添加豆油作為輔助性碳源，在有效避免發(fā)酵液中葡萄糖濃度過大引起的葡萄糖效應(yīng)的同時(shí)促進(jìn)次級(jí)代謝產(chǎn)物如紅霉素的合成，其具體原理是菌體分解豆油產(chǎn)生的短鏈脂肪酸與甘油在經(jīng)過β-氧化和EMP途徑轉(zhuǎn)化后能夠形成乙酰輔酶A，改變了葡萄糖濃度過高時(shí)的菌體生長(zhǎng)代謝的代謝流向，從而使紅霉素發(fā)酵產(chǎn)量提高[22]。此外，徐瑤[23]發(fā)現(xiàn)在阿維菌素的次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成代謝階段添加豆油可以提高阿維菌素的發(fā)酵產(chǎn)量，且添加濃度僅在0.5%～1.5%范圍內(nèi)與阿維菌素的發(fā)酵產(chǎn)量的提高呈現(xiàn)正相關(guān)。這一點(diǎn)在其他的研究發(fā)現(xiàn)中也得到了例證，如馬坤[24]在多殺菌素的發(fā)酵優(yōu)化中發(fā)現(xiàn)菜籽油的添加能增強(qiáng)脂肪酶基因及多殺菌素合成基因的表達(dá)豐度，促進(jìn)多殺菌素的合成。油脂代謝可以提供短鏈脂肪酸作為大環(huán)內(nèi)酯抗生素合成單元，提高產(chǎn)物合成，本研究中的突變株可以更多地利用特殊氨基酸提高多殺菌素的合成，這些氨基酸可能也是作為短鏈脂肪酸的前體發(fā)揮作用。相較于傳統(tǒng)的發(fā)酵優(yōu)化，有選擇性地優(yōu)化某一類前體物質(zhì)為微生物來源的抗生素合成提供了一種高效可行的發(fā)酵優(yōu)化策略。

4 結(jié)論

本研究構(gòu)建了刺糖多孢菌高產(chǎn)突變株SS-168及野生型SS-WT轉(zhuǎn)錄組譜。并生成了一個(gè)差異基因庫，通過對(duì)差異基因的GO和KEGG的功能分類確定了多種生物過程和信號(hào)通路，包括甘氨酸/絲氨酸/蘇氨酸代謝通路。實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證了該通路中部分DEGs的轉(zhuǎn)錄水平，并通過發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化發(fā)現(xiàn)甘氨酸與蘇氨酸的添加能顯著提高多殺菌素產(chǎn)量，而添加低濃度的絲氨酸對(duì)多殺菌素產(chǎn)量變化無明顯效果。本研究為改良刺糖多孢菌菌株和優(yōu)化發(fā)酵工藝提供重要的理論基礎(chǔ)和參考依據(jù)。