王濤，馬迅，沈于蘭，申蘭慧

脂肪乳氨基酸（17）葡萄糖（11%）注射液是一種被廣泛應(yīng)用于重癥醫(yī)學(xué)科、腫瘤科、外科等科室患者的腸外營(yíng)養(yǎng)復(fù)方制劑［1］，由脂肪乳注射液、復(fù)方氨基酸注射液和葡萄糖注射液三腔袋組成；其中復(fù)方氨基酸注射液主要為患者提供17種氨基酸與鈉、鉀、鈣、鎂、磷5種人體必需的常量及微量元素［2］。目前，脂肪乳氨基酸（17）葡萄糖（11%）注射液中的磷元素被普遍認(rèn)為以有機(jī)磷（甘油磷酸鈉）的形式存在［3］，現(xiàn)行檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)中也只涉及總磷含量的檢測(cè)，檢測(cè)方法復(fù)雜而且未涉及無(wú)機(jī)磷（游離磷酸鹽）的檢測(cè)。但甘油磷酸鈉遇熱會(huì)分解產(chǎn)生游離磷酸鹽，而注射液中的游離磷酸鹽易和體內(nèi)鈣元素反應(yīng)生成磷酸鈣結(jié)晶，引起中心靜脈導(dǎo)管阻塞、肺鈣化等疾病，目前已有多種注射藥品提出對(duì)游離磷酸鹽限度進(jìn)行控制［4-5］。因此，建立一種檢測(cè)脂肪乳氨基酸（17）葡萄糖（11%）注射液內(nèi)游離磷酸鹽的方法十分必要。

離子色譜法作為一種可快速便捷檢測(cè)離子型物質(zhì)的分析手段，具有較高的使用價(jià)值［5-6］。

本研究采用IonPac AS18-HC陰離子交換柱和KOH淋洗液梯度洗脫、抑制電導(dǎo)檢測(cè)的分離方式，實(shí)現(xiàn)了脂肪乳氨基酸葡萄糖注射液內(nèi)氨基酸注射液的游離磷酸鹽、α-甘油磷酸根、β-甘油磷酸根、氯離子和硫酸根的分離及測(cè)定，可同時(shí)控制脂肪乳氨基酸（17）葡萄糖（11%）注射液中有機(jī)磷及其他無(wú)機(jī)離子的含量。

1 材料

1.1 藥品與試劑

脂肪乳氨基酸（17）葡萄糖（11%）注射液3批 （批號(hào)10NF9063、10NC5276、10NE7472）；α-甘油磷酸根對(duì)照品（Sigma公司，批號(hào)BCCD2114，純度100.0%）；β-甘油磷酸根對(duì)照品（Macklin公司，批號(hào)C10844010，純度98.0%）；磷酸二氫鉀（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)100745-201804，純度100.0%）；氯化鈉（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20190307，純度99.5%）；無(wú)水硫酸鈉（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20180320，純度99.0%）；去離子水由Milli-Q純水系統(tǒng) 制備。

1.2 主要儀器

Thermo ICS-5000+離子色譜系統(tǒng)［包括自動(dòng)進(jìn)樣器（ASAP）、泵（DP）、電導(dǎo)檢測(cè)器（DC）、Chromeleon7.2色譜工作站，賽默飛世爾科技公司］；XPE205電子分析天平（瑞士Mettler公司）；Milli-Q超純水儀（美國(guó)Millipore公司）；S100H超聲波清洗器（德國(guó)ELma公司，500W，50kHz）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用IonPac AS18-HC陰離子交換色譜柱（250mm×4mm，9μm），AG18-HC保 護(hù) 柱（50mm×4mm）以不同濃度的KOH水溶液進(jìn)行梯度洗脫（0~8min，25mmol/L KOH；8~15min，50mmol/L KOH ；15~25min，50mmol/l KOH）；流速：1.0ml/min；進(jìn)樣量：25μl；檢測(cè)方式為抑制電導(dǎo)檢測(cè)；檢測(cè)器溫度為35℃，柱溫30℃。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液儲(chǔ)備液制備

分別取α-甘油磷酸根、β-甘油磷酸根、磷酸二氫鉀、氯化鈉、硫酸鈉加去離子水溶解制成約含α、β-甘油磷酸根各0.45mg/ml、游離磷酸鹽0.13mg/ml、 氯離子2.3mg/ml、硫酸根0.6mg/ml的對(duì)照品溶液。

2.2.2 對(duì)照品溶液制備

取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液儲(chǔ)備液加去離子水稀釋10倍。

2.2.3 供試品溶液制備

精密量取脂肪乳氨基酸（17）葡萄糖（11%）注射液中復(fù)方氨基酸注射液1ml置于25ml量瓶，加去離子水稀釋至刻度，搖勻。

2.3 系統(tǒng)適用性及專(zhuān)屬性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下制備的對(duì)照品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，色譜圖見(jiàn)圖1。在上述色譜條件下，供試品中的α-甘油磷酸根、β-甘油磷酸根、游離磷酸鹽、氯離子、硫酸根之間均能達(dá)到基線(xiàn)分離，說(shuō)明方法專(zhuān)屬性良好。

圖1 系統(tǒng)適用性及專(zhuān)屬性試驗(yàn)離子色譜圖

2.4 線(xiàn)性范圍考察

精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液，逐級(jí)稀釋配置一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)行檢測(cè)。測(cè)定游離磷酸鹽、α-甘油磷酸根、β-甘油磷酸根、氯離子、硫酸根峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。線(xiàn)性關(guān)系見(jiàn)表1。

表1 游離磷酸鹽、α-甘油磷酸根、β-甘油磷酸根、氯離子、硫酸根的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)與線(xiàn)性范圍

2.5 檢測(cè)限與定量限

取對(duì)照品溶液逐級(jí)稀釋?zhuān)M(jìn)行測(cè)定，游離磷酸鹽、α-甘油磷酸根、β-甘油磷酸根、氯離子、硫酸根的檢測(cè)限（信噪比為3）和定量限（信噪比為10），見(jiàn)表2。

表2 游離磷酸鹽、α-甘油磷酸根、β-甘油 磷酸根、氯離子、硫酸根的檢測(cè)限和 定量限試驗(yàn)結(jié)果

2.6 精密度試驗(yàn)

取對(duì)照品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次（見(jiàn)表3），α-甘油磷酸根、β-甘油磷酸根、游離磷酸鹽、氯離子、硫酸根的峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果表明精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

按照“2.2.3”項(xiàng)下方法，利用脂肪乳氨基酸（17）葡萄糖（11%）注射液（批號(hào)10ND9063）平行制備6份供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，α-甘油磷酸根、β-甘油磷酸根、游離磷酸鹽、氯離子、硫酸根的峰面積RSD（見(jiàn)表3），結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取重復(fù)性項(xiàng)下的供試品溶液，分別在0、1、2、4、8和12h進(jìn)樣計(jì)算峰面積，α-甘油磷酸根、β-甘油磷酸根、游離磷酸鹽、氯離子、硫酸根的峰面積RSD（見(jiàn)表3），結(jié)果表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。

表3 游離磷酸鹽、α-甘油磷酸根、β-甘油 磷酸根、氯離子、硫酸根的精密度、 重復(fù)性與穩(wěn)定性 n=6

2.9 回收率試驗(yàn)

精密量取供試品脂肪乳氨基酸（17）葡萄糖（11%）注射液（批號(hào)10NF9063）中復(fù)方氨基酸注射液為母液，加去離子水稀釋2.5倍為溶液1。精密量取9份“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液儲(chǔ)備液1ml置于20ml量瓶中，再分別精密量取0.8、1和1.2ml溶液1各3份加入其中，加去離子水稀釋定容搖勻。按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，α-甘油磷酸根、β-甘油磷酸根、游離磷酸鹽、氯離子以及硫酸根的回收率均值與RSD結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 游離磷酸鹽、α-甘油磷酸根、β-甘油磷酸根、氯離子、硫酸根的回收率

續(xù)表

2.10 樣品測(cè)定

取3批脂肪乳氨基酸（17）葡萄糖（11%）注射液，按照“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，3批樣品中游離磷酸鹽含量、α-甘油磷酸根含量、β-甘油磷酸根含量、氯離子含量以及硫酸根含量檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 3批樣品中游離磷酸鹽、α-甘油磷酸根、β-甘油磷酸根、氯離子、硫酸根含量檢測(cè)結(jié)果（mmol/L）

2.11 色譜柱的選擇

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)［7-8］，對(duì)色譜柱IonPac AS11-HC與IonPac AS18-HC分別進(jìn)行嘗試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IonPac AS11-HC色譜柱無(wú)法對(duì)供試品溶液中α-甘油磷酸根、β-甘油磷酸根進(jìn)行有效的分離，色譜圖見(jiàn)圖2。而通過(guò)采用IonPac AS18-HC色譜柱可以使各離子色譜峰完全分離，見(jiàn)圖1。

圖2 IonPac AS11-HC色譜圖

3 討論

游離磷酸鹽、α-甘油磷酸根、β-甘油磷酸根、氯離子與硫酸根都具有較高的水合能，在堿性條件下均以陰離子形式存在，因此選用陰離子交換色譜法，以KOH水溶液為淋洗液進(jìn)行分離。本研究同時(shí)比較了多種色譜柱，最終發(fā)現(xiàn)IonPac AS18-HC陰離子交換色譜柱對(duì)上述5種陰離子的分離效果較好。推測(cè)是因AS18柱容量較高，可使用氫氧化物梯度淋洗液以及大體積進(jìn)樣來(lái)測(cè)定復(fù)雜基體樣品中低濃度級(jí)別的無(wú)機(jī)陰離子，同時(shí)其作為氫氧化物選擇性陰離子交換柱，可以快速分離各類(lèi)常無(wú)機(jī)陰離子。因此，本研究最終選用IonPac AS18-HC陰離子交換色譜柱。

由表4可知，脂肪乳氨基酸（17）葡萄糖（11%）注射液內(nèi)復(fù)方氨基酸的游離磷酸鹽含量均值為3.55mmol/l。由于本品為三腔袋，給藥前需三腔袋混合，給藥途徑為靜脈注射［9-10］，故在注射入靜脈時(shí)游離磷酸鹽含量為0.74mmol/L。而目前2020年版《中國(guó)藥典》對(duì)甘油磷酸鈉注射液的游離磷酸鹽限度規(guī)定為0.03mol/L［4］，甘油磷酸鈉注射液在使用時(shí)需按說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行靜脈給藥，取10ml加入500ml復(fù)方氨基酸注射液或葡萄糖注射液中，其通過(guò)靜脈給藥實(shí)際游離磷酸鹽濃度＜0.6mmol/L。表明3批肪乳氨基酸（17）葡萄糖（11%）注射液內(nèi)甘油磷酸鈉降解產(chǎn)生的游離磷酸鹽均較高，超過(guò)了甘油磷酸鈉注射液對(duì)游離磷酸鹽的含量限度規(guī)定，應(yīng)引起重視［11-12］。

綜上所述，本研究所開(kāi)發(fā)的離子色譜法無(wú)需繁雜的樣品處理方法，操作簡(jiǎn)便，可快速、精確、靈敏地測(cè)定游離磷酸鹽、α-甘油磷酸根、β-甘油磷酸根濃度，可用于檢測(cè)甘油磷酸鈉的降解水平，有助于脂肪乳氨基酸（17）葡萄糖（11%）注射液的投料工藝監(jiān)測(cè)和藥品質(zhì)量監(jiān)管。本檢測(cè)方法也可同時(shí)測(cè)定氯離子和硫酸根的濃度，有助于提高藥品檢測(cè)效率。