岳海艷，劉小杰?，孫 敏，李 娜，劉占峰

（1. 上海城建職業(yè)學(xué)院，上海 201415；2. 上海化工研究院有限公司，上海 200062）

蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）為綠藻門小球藻屬普生性單細(xì)胞綠藻，是一種球形單細(xì)胞淡水藻類，通常以光合自養(yǎng)生長繁殖，分布極廣。蛋白核小球藻含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)、食物纖維、核酸、不飽和脂肪酸及葉綠素等，具有降脂、降壓、降血糖、預(yù)防和改善動(dòng)脈粥狀硬化等功能[1-2]，尤其小球藻特有的生長因子，使其具有排除體內(nèi)毒素、促進(jìn)新陳代謝、補(bǔ)充人體營養(yǎng)、提高細(xì)胞再生能力以及增強(qiáng)人體免疫力等功效[3-5]；美國和日本將小球藻作為優(yōu)良食品和動(dòng)物飼料添加劑已有30多年的歷史，近年來，東亞和歐洲每年生產(chǎn)數(shù)千噸的小球藻作為飼料添加劑、保健食品和營養(yǎng)補(bǔ)充食品[6]。2012年底《中華人民共和國食品安全法》和《新資源食品管理辦法》將蛋白核小球藻列為新資源食品[7]，豐富了國內(nèi)藻類健康食品種類，已經(jīng)應(yīng)用于大米、釀酒、豆腐、發(fā)酵乳制品、面條、餅干和面包等[8-12]，將來在功能性食品中必然有著更廣闊的應(yīng)用前景[13]。

目前蛋白核小球藻培養(yǎng)方法很多，其培養(yǎng)方式包括密閉無菌培養(yǎng)法、開放半無菌培養(yǎng)法、開放藻菌混養(yǎng)法等[14-20]。生長方式有自養(yǎng)和異養(yǎng)生長兩種，隨著碳氮比（C/N）和光照條件變化在自養(yǎng)和異養(yǎng)之間自由轉(zhuǎn)變[21]。由于開放和半開放培養(yǎng)方式容易使雜菌，尤其是有害細(xì)菌進(jìn)入，并繁殖，使菌體遭到污染，不宜食用；自養(yǎng)向異養(yǎng)轉(zhuǎn)化過程伴有葉綠素和葉綠體的消失，類胡蘿卜素和葉黃素降低，蛋白質(zhì)含量減少以及脂肪急劇增加等問題[22]。因此本文探索一種利用氣升反應(yīng)器高密度培養(yǎng)食品用蛋白核小球藻的方法，即采用密閉無菌的自養(yǎng)方式，并首次將獲得的蛋白核小球藻用于青團(tuán)制作。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

FAZHB-5小球藻：中科院水生生物研究所；硝酸鈉（AR）、硫酸鉀（AR）、檸檬酸鐵銨（CP）、鎢酸鈉（AR）、濃硫酸（AR）、硝酸（AR）等：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；磷酸氫二鉀（AR）、氯化鈣（AR）、乙二胺四乙酸二鈉（AR）：上海展云化工有限公司；鉬酸鈉（≥99%）：上?；瘜W(xué)試劑有限公司；硫酸鎂（AR）：上海強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司；鐵質(zhì)除氧劑：上?；ぱ芯吭河邢薰?；糯米粉、水晶餃子粉以及豆沙餡等：市售；AccQ.Tag分析蛋白水解氨基酸方法試劑包：濟(jì)南賽暢科學(xué)儀器有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

IRH-IS160二氧化碳培養(yǎng)/振蕩培養(yǎng)一體箱：北京陸?？萍加邢薰?；大容量離心機(jī)：UNION 5KR Hanil Science Industrial Co., Ltd；CX41顯微鏡：Olympus Optical Co.，LTD；TGL-16aR臺(tái)式冷凍離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；BCD626WD11HP容聲冰箱：海信容聲（廣東）冰箱有限公司；MP1002電子天平：上海民橋電子儀器廠；HX12L-0179立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司；GY-FYQ-1812-ZZ微藻培養(yǎng)光生物反應(yīng)器：上海光語生物科技有限公司；海能K1100全自動(dòng)凱氏定氮儀：上海力晶科學(xué)儀器有限公司；L8900全自動(dòng)氨基酸分析儀：廣州儀德精密儀器股份有限公司；電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀（ICP-OES）：PerkinElmer Avio200，MA，USA。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 蛋白核小球藻培養(yǎng)工藝

將FAZHB-5小球藻接種于無菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝置密閉，氣體裝置內(nèi)循環(huán)，根據(jù)設(shè)置自動(dòng)通入無菌二氧化碳，保持裝置內(nèi)二氧化碳2%濃度，氧氣21%，溫度25 ℃，12 h光照/d，培養(yǎng)8 d。

1.3.2 碳源和氮源優(yōu)化

采用單因素實(shí)驗(yàn)，以FAZHB-5小球藻為出發(fā)菌株，BG11為培養(yǎng)基，100 mL/250mL錐形瓶裝液量，轉(zhuǎn)速100 r/min，在二氧化碳培養(yǎng)/振蕩培養(yǎng)一體箱中12 h光照/24 h培養(yǎng)4 d，考察二氧化碳不同濃度對(duì)小球藻生長的影響。

采用單因素實(shí)驗(yàn)，以FAZHB-5小球藻為出發(fā)菌株，2%二氧化碳作為碳源，固定BG11培養(yǎng)基中除硝酸鈉以外其他成分，100 mL/250 mL錐形瓶裝液量，轉(zhuǎn)速100 r/min，在二氧化碳培養(yǎng)/振蕩培養(yǎng)一體箱中12 h光照/24 h培養(yǎng)4 d，觀察不同硝酸鈉加入量對(duì)菌體生長影響。

1.3.3 培養(yǎng)基以及均勻設(shè)計(jì)

BG11培養(yǎng)基（g/L）：NaNO31.5，K2HPO40.04，MgSO4·7H2O 0.075，CaCl2·2H2O 0.036，檸檬酸0.006，檸檬酸鐵銨0.006，EDTANa20.001，Na2CO30.02，A51 mL。

A5（痕跡金屬，g/L）：H3BO32.86，MnCl2·4H2O 1.86，ZnSO4·7H2O 0.22，Na2MoO4·2H2O 0.39，CuSO4·5H2O 0.08，Co(NO3)2·6H2O 0.05，pH 7.1。

在二氧化碳含量、溫度、光照以及培養(yǎng)時(shí)間不變，借鑒BG11培養(yǎng)基并參考相關(guān)文獻(xiàn)[14-20]，采用10因素12水平均勻設(shè)計(jì)，見表1。依次改變硝酸鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鎂等培養(yǎng)基成分含量，測定不同培養(yǎng)基組成條件下的干菌體質(zhì)量。

表1 均勻設(shè)計(jì)要素Table 1 The essential factor for the uniform design

1.3.4 光源選擇

設(shè)備配備了內(nèi)置和外置LED光源，白色：10 000 lux；紅∶藍(lán)為4∶1的彩光：5 000 lux。

1.3.5 超量氧氣去除方法

采用鐵質(zhì)除氧劑吸收過量氧氣。

1.3.6 干菌體重量將一定體積的培養(yǎng)液經(jīng)4 000 r/min離心20 min，棄上清液，收集濕菌體，經(jīng)80 ℃烘干至恒重，利用精密電子天平稱重。

1.3.7 蛋白核小球藻營養(yǎng)成分測定

1.3.7.1 采用全自動(dòng)凱氏定氮儀檢測蛋白核小球藻蛋白質(zhì)含量 依據(jù)GB5009.5—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測定》第一法，將10 mL濃硫酸和1片催化劑（0.5 g硫酸銅和6 g硫酸鉀）加入到裝有0.5 g蛋白核小球藻粉的消化管中，200 ℃消化1 h，然后420 ℃繼續(xù)消化1 h；消化液冷卻后上機(jī)。

1.3.7.2 利用全自動(dòng)氨基酸分析儀測定氨基酸組成和含量 將50 mg小球藻粉加入到1 mL 6 mol/L鹽酸中，110 ℃酸解24 h。取200 μL液體加入535 μL 2 mol/L氫氧化鈉中和，用AccQ·Tag Ultra Borate緩沖液稀釋2倍。取上述溶液10 uL加入70 μL AccQ·Tag Ultra Borate緩沖液和20 μL AccQ·Tag試劑中，55 ℃加熱10 min，冷卻后上機(jī)。

1.3.7.3 采用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀（ICP-OES）測定礦物質(zhì)元素含量 稱取25 mg小球藻，加入到裝有1 mL硝酸溶液的硝煮管中，沸水蒸煮1 h，加去離子水定容至10 mL，用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀（ICP-OES）測定礦物質(zhì)元素。

光譜條件：低波范圍5；高波范圍5；最大積分時(shí)間30 s；樣品沖洗時(shí)間30 s；重復(fù)次數(shù)3；泵延時(shí)間 5 s。

1.3.8 蛋白核小球藻青團(tuán)配方

基礎(chǔ)配方（g）：糯米粉150，水晶餃子粉（澄面）50，豬油10，海藻糖 30，水180，豆沙餡250。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源對(duì)菌體生長影響

自養(yǎng)培養(yǎng)的小球藻，二氧化碳既作為碳源，又是光合作用的底物，其濃度影響著菌體的生長以及淀粉的累積，在一定范圍內(nèi)，光合作用速率隨二氧化碳濃度升高而加快，但達(dá)到一定濃度后，光合作用速率不再加快，這主要是因?yàn)楦邼舛鹊亩趸家资古囵B(yǎng)基酸化，抑制了菌體生長。

二氧化碳不同濃度對(duì)小球藻生長的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。從表2的結(jié)果可以看出，二氧化碳濃度在0.4%到2%區(qū)間內(nèi)，隨著二氧化碳濃度提高，小球藻菌體量（以O(shè)D值表示）不斷提高，但當(dāng)二氧化碳濃度超過2%后，反而不利用于菌體生長，因此下面的研究中，選擇2%濃度二氧化碳作為碳源的最適濃度。

表2 二氧化碳通氣量對(duì)小球藻生長影響Table 2 Effect of carbon dioxide aeration rate on the growth of Chlorella pyrenoidosa

2.2 氮源對(duì)菌體生長影響

小球藻能夠利用硝酸鹽作為氮源，進(jìn)行生長，并合成蛋白質(zhì)、淀粉等[23]，不同硝酸鈉加入量對(duì)菌體生長的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。從表3的結(jié)果可以看出，10 g/L的硝酸鈉更適合小球藻生長。繼續(xù)提高硝酸鈉的添加量，菌體生長反而受到抑制，其作用機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

表3 硝酸鈉加入量對(duì)小球藻生長影響Table 3 Effect of sodium nitrate addition on the growth of Chlorella pyrenoidosa

2.3 培養(yǎng)基優(yōu)化

小球藻培養(yǎng)基主要以碳源、氮源和無機(jī)鹽為主，在以FAZHB-5小球藻為出發(fā)菌株，2%二氧化碳作為碳源，100 mL/250 mL錐形瓶裝液量，轉(zhuǎn)速100 r/min，在二氧化碳培養(yǎng)/振蕩培養(yǎng)一體箱中12 h光照/24 h培養(yǎng)4 d，通過對(duì)磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硝酸鈉、硫酸鉀、檸檬酸鐵胺、氯化鈣、維生素B1、EDTANa2、鎢酸鈉、氯化鎳進(jìn)行如表1的10因素12水平均勻?qū)嶒?yàn)，獲得了優(yōu)化后的培養(yǎng)基成分，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見表4。

對(duì)表4的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式逐步回歸分析，得出擬合線性回歸方程如下：

表4 均勻?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 The design and results of uniform experiment

Y=1.3X1+0.006X2+0.2X3+7.0X4+0.01X5+2.0X6+0.01X7+0.001X8+4×10-5X9+ 6×10-5X10，

其中：R2= 0.999 998，F(xiàn) = 159 230 7，P= 0.000 6。

從而可以獲得優(yōu)化后的培養(yǎng)基組成：磷酸氫二鉀0.6 g/L，硫酸鎂0.2 g/L，硝酸鈉11 g/L，硫酸鉀0.8 g/L，檸檬酸鐵胺0.006 g/L，氯化鈣0.05 g/L，維生素B10.11 g/L，EDTANa20.01 g/L，鎢酸鈉0.08×10-3g/L，氯化鎳0.02×10-3g/L，理論上可以獲得8.500 g/L干菌體。

以2%二氧化碳為碳源，按照優(yōu)化培養(yǎng)基組成，利用密閉的氣升式生物反應(yīng)器為培養(yǎng)裝置，在控制無菌二氧化碳進(jìn)入情況下，氣體內(nèi)部循環(huán)，進(jìn)行3次重復(fù)培養(yǎng)，測得菌體干重分別為8.539、8.648和8.407 g/L，基本達(dá)到甚至超過優(yōu)化水平，與模型預(yù)測值較接近，說明該回歸方程較可靠。

2.4 光源種類和位置對(duì)小球藻菌體干重的影響

葉綠素是與光合作用有關(guān)的最重要的色素，它可從光中吸收能量，用來將二氧化碳轉(zhuǎn)變?yōu)樘妓衔锏矸?。葉綠素a、葉綠素b的吸收光譜有兩個(gè)，分別為波長630～680 nm的紅光區(qū)和波長為400～460 nm的藍(lán)紫光區(qū)[24]。常用的LED白光，本身發(fā)出的是450 nm的光，相較于葉綠素所需，紅光部分利用率偏低。

實(shí)驗(yàn)采用上述優(yōu)化培養(yǎng)基配方，利用密閉的氣升式生物反應(yīng)器為培養(yǎng)裝置，在控制無菌二氧化碳進(jìn)入情況下，氣體內(nèi)部循環(huán)，光源為LED白光（10 000 lux）和紅藍(lán)彩光（4∶1，5 000 lux），放置在裝置內(nèi)中心位置和四周位置。通過調(diào)整光源種類和位置，考察光源種類和位置對(duì)小球藻菌體干重的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5所示。

表5 不同光源和位置的光照實(shí)驗(yàn)Table 5 Experiments of different light sources and positions

從表5的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，增加四周光照后，菌體干重比僅有中心光源增加了70%，而中心彩色LED燈的更換，使菌體干重提高了1.8倍，比最初提高了3倍以上，效果非常明顯；實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，四周及中心全部采用彩光，菌體干重提高效果并不理想。將來全光譜的LED燈會(huì)更好地應(yīng)用到藻類培養(yǎng)中。

2.5 氧氣量對(duì)小球藻菌體干重的影響

氧氣濃度過高，抑制小球藻生長[25]。如果不加控制，發(fā)酵8 d，氧氣量最高可到40%左右，因此采用除氧劑吸收過量的氧氣。不同氧氣濃度對(duì)菌體干重的影響如表6所示，從表6的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，氧氣量20%更適合菌體生長，幾乎是空氣中氧氣濃度。氧氣量過高或過低都產(chǎn)生抑制，這與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。

表6 不同氧氣量對(duì)菌體生長影響Table 6 Effect of different oxygen content on cell growth

2.6 蛋白核小球藻營養(yǎng)成分檢測

2.6.1 蛋白核小球藻蛋白質(zhì)含量測定

根據(jù)GB5009.5—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測定》第一法，采用全自動(dòng)凱氏定氮儀，測得蛋白核小球藻蛋白質(zhì)含量高達(dá)58 g/100g，驗(yàn)證了密閉自養(yǎng)培養(yǎng)方式，可以獲得蛋白質(zhì)含量更高的蛋白核小球藻，這與前人的研究報(bào)道一致[26]。

2.6.2 氨基酸含量測定

利用氨基酸測定儀檢測了蛋白核小球藻氨基酸含量，結(jié)果表明蛋白核小球藻含有豐富的氨基酸，測定結(jié)果見表7。

表7 蛋白核小球藻氨基酸含量Table 7 Amino acid content of Chlorella pyrenoidosa

從蛋白質(zhì)和氨基酸檢測結(jié)果可以看出，蛋白核小球藻均高于世界衛(wèi)生組織（WHO）和聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）頒布的用于人類營養(yǎng)的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，是一種優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)資源[27]。

2.6.3 蛋白核小球藻礦物質(zhì)元素含量測定

根據(jù)GB5009.268—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中多元素的測定》，采用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀（ICP-OES）檢測該蛋白核小球藻中礦物質(zhì)的含量。測定結(jié)果顯示：礦物質(zhì)元素K、Ca、Mg等含量豐富；重金屬Pb、Cr和Cd含量均未超標(biāo)，符合新資源食品要求，具體結(jié)果見表8。

表8 蛋白核小球藻中主要礦物質(zhì)元素含量Table 8 Main mineral element content in Chlorella pyrenoidosa

2.7 蛋白核小球藻青團(tuán)制作

根據(jù)基礎(chǔ)配方，在其它配料用量不變，通過改變蛋白核小球藻的添加量，已經(jīng)獲得了顏色翠綠、不油膩、彈性好、口感好、無堿味等優(yōu)點(diǎn)的蛋白核小球藻青團(tuán)。

3 結(jié)論

1）單因素優(yōu)化獲得碳源為2%二氧化碳，氮源為10 g/L的硝酸鈉；均勻設(shè)計(jì)獲得優(yōu)化的培養(yǎng)基：磷酸氫二鉀0.6 g/L，硫酸鎂0.2 g/L，硝酸鈉11 g/L，硫酸鉀0.8 g/L，檸檬酸鐵胺0.006 g/L，氯化鈣0.05 g/L，維生素B10.11 g/L，EDTANa20.01 g/L，鎢酸鈉0.08×10-3g/L，氯化鎳0.02×10-3g/L。

2）實(shí)驗(yàn)證明氧氣量為20%時(shí)，是菌體最適宜的生長環(huán)境，LED紅藍(lán)4∶1彩光替代白光，有效地彌補(bǔ)了白光中紅藍(lán)色的不足，更有利于光合作用進(jìn)行。

3）蛋白核小球藻粉蛋白質(zhì)含量高達(dá)58 g/100g，同時(shí)含有豐富的賴氨酸、胱氨酸、丙氨酸、礦物質(zhì)元素K、Ca、Mg等。

4）利用獲得的蛋白核小球藻，制作了蛋白核小球藻青團(tuán)，拓展了蛋白核小球藻在食品工業(yè)中的應(yīng)用領(lǐng)域。