白 云，李 蕾，吳月蓉，鐘蘭萍

（云南省第一人民醫(yī)院/昆明理工大學(xué)附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，云南 昆明 650032）

反復(fù)種植失?。╮epeated implantation failure，RIF）目前多將其定義為在輔助生殖治療中移植3次以上或移植高評(píng)分卵裂期胚胎數(shù)4～6 個(gè)或高評(píng)分囊胚數(shù)3 個(gè)及以上均失敗者[1]。因?yàn)镽IF 涉及病因種類多、范圍廣是體外受精-胚胎移植術(shù)（in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET）治療中的難題，胚胎的著床依賴于優(yōu)質(zhì)的胚胎和具有容受性的子宮內(nèi)膜。目前隨著輔助生殖胚胎實(shí)驗(yàn)室技術(shù)的發(fā)展和胚胎種植前遺傳學(xué)檢測(cè)（preimplantation genetic testing，PGT）的廣泛應(yīng)用，在選擇優(yōu)質(zhì)胚胎方面已獲得較大進(jìn)展。但對(duì)于子宮內(nèi)膜容受性的評(píng)估尚缺乏有效手段。國(guó)內(nèi)億康基因公司于2019 年開(kāi)發(fā)的子宮內(nèi)膜容受性檢測(cè)（endometrial receptivity test，ERT）技術(shù)，是基于RNA-seq 的子宮內(nèi)膜容受性檢測(cè)，通過(guò)分析子宮內(nèi)膜組織中萬(wàn)余個(gè)基因的表達(dá)量，結(jié)合AI 機(jī)器學(xué)習(xí)的大數(shù)據(jù)分析方法，區(qū)分容受前期、容受期、容受后期3 個(gè)時(shí)期的樣本，在患者下一個(gè)月經(jīng)周期按照ERT 結(jié)果制定個(gè)性化移植方案時(shí)間，得到胚胎最佳的移植時(shí)期，指導(dǎo)在種植窗移植胚胎，以期提高移植成功率[2]。通過(guò)該技術(shù)能否確實(shí)提高RIF 患者的成功率，內(nèi)膜種植窗口期發(fā)生移位的患者有什么臨床特點(diǎn)？是否能通過(guò)臨床信息挖掘找尋種植窗移位的相關(guān)原因從而預(yù)防RIF 的發(fā)生？目前此方面研究尚少，本研究首先通過(guò)分析RIF 患者行ERT 后胚胎移植的妊娠結(jié)局了解該技術(shù)的有效性，其次分析胚胎種植窗移位患者的臨床特點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2020 年12 月至2021 年11 月在云南省第一人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科診斷為反復(fù)種植失敗后再次接受冷凍胚胎移植病例。入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）取卵年齡小于40 歲；（2）反復(fù)種植失敗的患者，即既往≥3 次的移植（包括新鮮胚胎移植和冷凍胚胎移植）失敗，累積移植：①優(yōu)質(zhì)D3 胚胎4～6個(gè)②高評(píng)分囊胚（4BB 及以上囊胚）3 個(gè)及以上均失?。唬?）診斷RIF 后再次行冷凍胚胎移植。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）男女雙方染色體核型異常；（2）有子宮內(nèi)膜病變者（包括宮腔粘連、子宮內(nèi)膜增殖癥、子宮內(nèi)膜息肉、子宮內(nèi)膜炎、子宮內(nèi)膜結(jié)核等）未治療；（3）有輸卵管積水且未行輸卵管近端結(jié)扎者；（4）有粘膜下肌瘤未處理。根據(jù)是否接受ERT 并完成個(gè)性化移植分為接受組和未接受組。本研究已通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批，受試者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 研究方法

1.2.1 內(nèi)膜監(jiān)測(cè)及手術(shù)時(shí)間安排月經(jīng)來(lái)潮8～10 d，B 超監(jiān)測(cè)卵泡及內(nèi)膜厚度，若有優(yōu)勢(shì)卵泡發(fā)育監(jiān)測(cè)至排卵，排卵+5d 或出現(xiàn)LH 峰+7 d安排內(nèi)膜取材；若無(wú)優(yōu)勢(shì)卵泡發(fā)育，予激素替代周期，口服戊酸雌二醇（補(bǔ)佳樂(lè)，德國(guó)拜耳）4 mg/d，激素使用10～14 d，內(nèi)膜≥8 mm 時(shí)給予黃體酮軟膠囊（安i 琪坦，法國(guó)Capsugel）400 mg/d、地屈孕酮片（達(dá)芙通，荷蘭Abbott，）20 mg/d，轉(zhuǎn)化內(nèi)膜6 d 后安排內(nèi)膜取材。

1.2.2 內(nèi)膜取材手術(shù)當(dāng)天行陰道分泌物、血常規(guī)檢查。手術(shù)室患者取膀胱截石位，常規(guī)消毒鋪巾，宮頸鉗鉗夾宮頸上下唇固定宮頸，探針探查宮深，順子宮位置方向輕柔插入內(nèi)膜取材取樣器，待取樣器底部達(dá)宮底處，左手握住并固定管套，右手握住手柄，快速向外拉管芯使宮腔形成負(fù)壓吸取內(nèi)膜組織。將取樣管中的子宮內(nèi)膜組織排除至無(wú)菌紗布上，挑選干凈無(wú)血污染的內(nèi)膜組織直接放入裝有RNA 保存液的保存管，放入-20℃保存，聯(lián)系送檢取樣。

1.2.3 再次冷凍移植根據(jù)ERT 結(jié)果安排再次冷凍移植，依照取內(nèi)膜周期內(nèi)膜準(zhǔn)備方式再次行冷凍移植內(nèi)膜準(zhǔn)備，根據(jù)ERT 結(jié)果安排患者個(gè)性化移植時(shí)間。

1.2.4 妊娠判定移植后2 周測(cè)定血β-人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG），若β-hCG≥10 mIU/mL 為生化妊娠，于移植后28～35 d 行經(jīng)陰道腔內(nèi)B 超檢查是否有宮內(nèi)孕囊，有孕囊者判定臨床妊娠。

1.2.5 研究變量患者的一般資料包括年齡、BMI、不孕類型、合并多囊卵巢綜合癥、合并子宮內(nèi)膜異位癥、移植胚胎個(gè)數(shù)、移植胚胎類型、移植日內(nèi)膜厚度、臨床結(jié)局包括臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%；種植率=孕囊數(shù)/移植胚胎胚胎數(shù)×100%（若單胚移植出現(xiàn)多孕囊，記為1）。納入種植窗移位多因素回歸分析的研究變量參考目前研究顯示與胚胎種植相關(guān)的臨床因素。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研究統(tǒng)計(jì)分析采用R 語(yǔ)言（Version 3·6·3;）。采用表示符合正態(tài)分布的計(jì)量資料。當(dāng)方差齊時(shí)，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較組間差異，當(dāng)方差不齊時(shí)采用Cochran 矯正t檢驗(yàn)比較組間差異。計(jì)數(shù)資料用百分率表示，采用卡方檢驗(yàn)或Fisher確切概率法進(jìn)行分析。不符合取自然對(duì)數(shù)變換再行t 檢驗(yàn)，仍不符合正態(tài)分布，應(yīng)用Mann-WhitneyU 檢驗(yàn)。針對(duì)建模人群，采用單因素/多因素Logistic 模型分析影響種植窗移位的因素。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。回歸分析中將原發(fā)不孕賦值為“1”，繼發(fā)不孕賦值為“2”；將宮外孕史、合并多囊卵巢綜合征、合并子宮內(nèi)膜異位癥中不合并賦值為“0”，合并賦值為“1”；將發(fā)生卵泡不破裂黃素化賦值為“1”，未發(fā)生賦值為“0”。

2 結(jié)果

2.1 2 組病例一般臨床資料比較

接受ERT 組43 例，未接受組29 例，2 組間患者的年齡、BMI、不孕類型、多囊卵巢綜合征占比、子宮內(nèi)膜異位癥占比、移植胚胎數(shù)、囊胚占比、移植日子宮內(nèi)膜厚度相比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 2 組病例一般資料的比較[（）/n（%）]Tab.1 Comparison of general data of two groups of cases [（）/n（%）]

表1 2 組病例一般資料的比較[（）/n（%）]Tab.1 Comparison of general data of two groups of cases [（）/n（%）]

2.2 2 組病例臨床妊娠率和胚胎種植率比較

接受ERT 并完成個(gè)性化移植的病例臨床妊娠率及胚胎種植率均明顯高于未接受組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 2 組病例臨床妊娠率和胚胎種植率比較n[（%）]Tab.2 Comparison of clinical pregnancy rate and embryo implantation rate between two groups [n（%）]

2.3 內(nèi)膜種植窗移位相關(guān)因素多因素分析

接受ERT 檢測(cè)的43 例病例中有16 例ERT 結(jié)果為內(nèi)膜容受性發(fā)生移位。其余29 例ERT 檢測(cè)結(jié)果提示內(nèi)膜位于容受期內(nèi)。

納入既往研究發(fā)現(xiàn)與胚胎種植相關(guān)的影響因素包括：年齡、BMI、不孕類型、有無(wú)宮外孕史、合并多囊卵巢綜合征（ploycystic ovary syndrome，PCOS）、合并子宮內(nèi)膜異位癥、是否發(fā)生卵泡未破裂黃素化（luteinized unruptured follicle，LUF）、移植（取材）日子宮內(nèi)膜厚度、移植（取材）日血孕酮水平。單因素Logistic 回歸分析結(jié)果顯示，合并PCOS、發(fā)生LUF 以及取材日血孕酮水平會(huì)影響內(nèi)膜種植窗；多因素模型檢驗(yàn)，合并PCOS、發(fā)生LUF 是內(nèi)膜種植窗移位的影響因素，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 影響種植窗移位的多因素回歸分析結(jié)果Tab.3 Regression analysis results of multiple factors affecting the displacement of planting window

3 討論

子宮內(nèi)膜容受性是指子宮內(nèi)膜接受胚胎植入的能力，也是指內(nèi)膜的一種狀態(tài)也稱為胚胎著床“窗口期”。一般認(rèn)為在正常的月經(jīng)周期中，只有在周期的第20～24 天或黃體生成素峰（luteinizing hormone，LH）后第7 天（LH+7）或P +5 子宮內(nèi)膜具備對(duì)胚胎的接受能力[3]。既往認(rèn)為種植窗是恒定的，然而越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)并非在所有患者中都成立，有的表現(xiàn)為種植窗提前退后或縮短[4-5]。目前臨床上檢測(cè)內(nèi)膜容受狀態(tài)最常用的是超聲指標(biāo)，根據(jù)內(nèi)膜厚度、分型、血流，同時(shí)參考雌激素及LH 等激素指標(biāo)。此外還有形態(tài)學(xué)標(biāo)志物：胞飲突；分子生物學(xué)標(biāo)志物；整合素等，可以一定程度評(píng)估子宮內(nèi)膜容受性，但是因其存在局限性且重復(fù)性差故存在爭(zhēng)議。尋求一種全面客觀的檢測(cè)方法以評(píng)估子宮內(nèi)膜容受性顯得尤為迫切和重要

本研究分析既往因RIF 接受ERT 檢測(cè)并進(jìn)行個(gè)體化移植的病例資料提示，相比較同期未接受ERT 移植組，臨床妊娠率（53.49% vs 24.14%）和胚胎種植率（46.67% vs 20.00%）均有顯著提高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這與既往國(guó)內(nèi)研究結(jié)果相符[2,6]，這個(gè)結(jié)果驗(yàn)證了對(duì)于RIF 人群，ERT 準(zhǔn)確識(shí)別種植窗對(duì)于改善這類患者結(jié)局具有重要意義，為生殖領(lǐng)域引入個(gè)體化種植窗及個(gè)體化移植概念，打破以往種植窗恒定的想法，能夠使RIF患者達(dá)到更有利的生殖結(jié)局，這也為生殖醫(yī)學(xué)中的精準(zhǔn)醫(yī)療提供了新的思路。

多囊卵巢綜合征（ploycystic ovary syndrome，PCOS）是一種以排卵功能障礙和雄激素過(guò)多為特征的內(nèi)分泌代謝紊亂疾病。生理情況下女性排卵后，子宮內(nèi)膜在雌孕激素的作用下向分泌期轉(zhuǎn)換，子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞在分泌中期發(fā)生自發(fā)性蛻膜化，這是進(jìn)入內(nèi)膜種植窗的標(biāo)志，雌孕激素對(duì)于子宮內(nèi)膜的作用是前提[7]。目前有研究已證實(shí)PCOS患者子宮內(nèi)膜容受性下降與孕激素抵抗效應(yīng)有關(guān)[8-9]。Savaris 等[10]通過(guò)微陣列比較正常妊娠女性和PCOS 接受人工激素替代周期或接受克羅米芬藥物促排的子宮內(nèi)膜基因表達(dá)發(fā)現(xiàn)，PCOS 患者子宮內(nèi)膜中受孕激素調(diào)控基因如GRB2 相關(guān)結(jié)合蛋白1（GAB1）、MIG6、白血病抑制因子（LIF）等表達(dá)明顯低于正常妊娠女性。PCOS 患者內(nèi)膜發(fā)生孕激素抵抗的機(jī)制可能為孕激素缺乏、孕激素受體表達(dá)改變、孕激素受體信號(hào)通路異常及胰島素抵抗[8]。另外，在胚胎移植內(nèi)膜準(zhǔn)備方案中，因?yàn)镻COS 患者稀發(fā)排卵或無(wú)排卵的原因需采用激素替代方案準(zhǔn)備內(nèi)膜，孕激素均由外源藥物天然孕酮提供，相較于自身發(fā)育卵泡形成黃體的內(nèi)源性孕激素，用藥后血藥濃度不穩(wěn)定以及孕激素作用內(nèi)膜時(shí)間縮短可能是這類患者發(fā)生種植窗移位的潛在因素。這為臨床中對(duì)于合并PCOS 的RIF 患者的診療提供了新的思路：孕前充分的生活方式干預(yù)和藥物治療改善胰島素抵抗是改變這類患者妊娠結(jié)局的基石，此外對(duì)于重復(fù)相同激素替代周期方案的PCOS 患者，再次移植可選擇促進(jìn)卵泡發(fā)育的促排周期或誘導(dǎo)排卵周期改善黃體功能以降低孕激素抵抗對(duì)種植窗移位產(chǎn)生的影響。

1975 年首次報(bào)道發(fā)育正常的成熟卵泡不破裂而黃素化（luteinized unruptured follicle，LUF），提示黃體形成并非所有經(jīng)過(guò)排卵過(guò)程[11]，部分卵泡未完成排卵即形成黃素化囊腫。而孕激素水平較低是LUF 的激素變化特點(diǎn)。Xu 等[12]發(fā)現(xiàn)相較于正常排卵對(duì)照組女性，兩者血清雌二醇水平無(wú)顯著差異，但LUF 患者血清孕酮水平明顯降低，LUF 患者子宮內(nèi)膜整合素αvβ3 表達(dá)強(qiáng)度顯著低于對(duì)照組，且與血清孕酮水平相關(guān)。整合素αvβ3 表達(dá)具有細(xì)胞周期特異性，與子宮內(nèi)膜容受性密切相關(guān)，被認(rèn)為是最具代表性的黏附分子和內(nèi)膜容受性的標(biāo)志物。雖然LH 峰出現(xiàn)至排卵的時(shí)間有個(gè)體差異，但LUF 周期 LH 峰低且較正常排卵者出現(xiàn)晚，這可能導(dǎo)致子宮內(nèi)膜轉(zhuǎn)型不充分蛻膜化程度低，從而影響胚胎種植窗。但余蘭等[13]通過(guò)比較凍融胚胎在自然排卵周期和LUF 周期的臨床結(jié)局認(rèn)為對(duì)于LUF 周期以明確的LH 峰降低為依據(jù)來(lái)確定解凍移植周期以及加強(qiáng)LUF 周期的黃體支持能使LUF 周期獲得與自然排卵周期相似的臨床結(jié)局。

同時(shí)，本研究存在一定的局限性，由于研究樣本例數(shù)的限制，有部分結(jié)果缺乏統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，后期擬進(jìn)一步擴(kuò)大研究范圍，完善相關(guān)參數(shù)的比較。

綜上所述，ERT 結(jié)合個(gè)性化移植方案對(duì)于改善RIF 助孕結(jié)局具有肯定意義；合并PCOS 和發(fā)生LUF 是子宮內(nèi)膜種植窗移位的危險(xiǎn)因素。