劉漢林，李世榮，簡春

（重慶市萬州區(qū)疾病預(yù)防控制中心，重慶 404000）

黃曲霉毒素（AF）是廣泛存在于自然界中的一種真菌有毒代謝產(chǎn)物，主要由黃曲霉菌和寄生曲霉菌分泌產(chǎn)生。目前已發(fā)現(xiàn)的黃曲霉毒素有20 多種[1]，其中已確定化學(xué)結(jié)構(gòu)的有18 種，包括黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2等。黃曲霉毒素B1毒性最強(qiáng)，并具有致癌性[2-3]。黃曲霉毒素M1是黃曲霉毒素B1的羥基化代謝產(chǎn)物，兩者毒性相當(dāng)，在動(dòng)物的乳汁中較為常見[4-5]，因此測定乳及乳制品中的黃曲霉毒素M1含量具有重要意義[6]。目前測定黃曲霉毒素M1的方法主要有酶聯(lián)法、放射免疫法、液相色譜法、高效液相色譜法、免疫親和柱-熒光分光光度法、免疫親和柱-高效液相色譜法等[7-11]。其中免疫親和柱-高效液相色譜法具有操作簡單、快速靈敏、回收率高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。

測量不確定度是指由于測量誤差的存在，對被測量值不能肯定的程度，是判定測定結(jié)果準(zhǔn)確程度的依據(jù)，也是實(shí)驗(yàn)室工作重要的質(zhì)量指標(biāo)[12]。為了客觀、科學(xué)地評價(jià)檢品質(zhì)量，需要引入測量不確定度，測量結(jié)果的可靠性極大程度上取決于不確定度的大小[13]，因此附有不確定度的測定結(jié)果才是完整且具有意義的。筆者采用免疫親和柱-高效液相色譜法對奶粉中黃曲霉毒素M1含量進(jìn)行測定，對測定結(jié)果的不確定度進(jìn)行評定，該評定結(jié)果對于檢測方法的優(yōu)化和提高實(shí)驗(yàn)室測定結(jié)果的準(zhǔn)確性具有重要意義[14]。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Ulaimate 3000 型，配備全自動(dòng)進(jìn)樣器、熒光檢測器，美國賽默飛世爾科技公司。

分析天平：JE502 型，感量為0.01 g，上海浦春計(jì)量儀器有限公司。

容量瓶、刻度試管、單標(biāo)線吸管：A 級(jí)，天津市天博玻璃儀器有限公司。

進(jìn)樣瓶：2 mL，美國安捷倫科技有限公司。

真空泵：GM-0.5A 型，極限壓力為0.08 MPa，天津津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)溶液：CAS 號(hào)為6795-23-9，質(zhì)量濃度為10 μg/mL，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.5%，美國默克公司。

免疫親和柱：AFM1免疫親和柱，AFM1吸附量小于25 ng，青島普瑞邦生物工程有限公司。

乙腈：色譜純，山東禹王實(shí)業(yè)有限公司化工分公司。

實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

1.2 樣品處理

稱取10.0 g 樣品，置于50 mL 燒杯中，用去離子水溶解并定容至100 mL 容量瓶中，以7 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心15 min，收集50 mL 樣品溶解液。用移液管移取50 mL 樣品溶解液至50 mL 注射器中，注射器筒與親和柱頂部相連，調(diào)節(jié)真空系統(tǒng)，以2 mL/min恒定流速過柱，用真空泵抽干親和柱，加入4 mL 乙腈洗脫至5 mL 刻度試管中，氮吹至0.2 mL，加水稀釋至2 mL，待測。

1.3 溶液配制

黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)中間液：100 ng/mL，準(zhǔn)確移取0.5 mL 黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)溶液于50 mL 容量瓶中，加入乙腈水（10+90）溶液定容至標(biāo)線，搖勻。

黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)使用液：5 ng/mL，移取0.5 mL 黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)中間液于10 mL 容量瓶中，加入乙腈水溶液（10+90）定容至標(biāo)線，搖勻。

黃曲霉毒素M1系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別移取黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)使用液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 于6 只2 mL 進(jìn)樣瓶中，再分別加入乙腈水（10+90）溶液0.9、0.8、0.6、0.4、0.2、0 mL，混勻，配成黃曲霉毒素M1的質(zhì)量濃度分別為0.50、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ng/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

依據(jù)國家食品污染物和有害因素風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測工作手冊中《乳及乳制品中黃曲霉毒素M1的免疫親和柱層析凈化HPLC 法測定的標(biāo)準(zhǔn)操作程序》，測定樣品的熒光強(qiáng)度，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品中黃曲霉毒素M1的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2 數(shù)學(xué)模型

樣品中黃曲霉毒素M1質(zhì)量分?jǐn)?shù)按式(1)計(jì)算。

式中：ωp——黃曲霉毒素M1的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，μg/kg；

m——50 mL 樣品溶液中所含乳粉的質(zhì)量，g；

ρ——由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算的樣品溶液中黃曲霉毒素M1的質(zhì)量濃度，ng/mL；

V——樣品測試液體積，mL。

3 不確定度來源

按照實(shí)驗(yàn)方法測定奶粉中黃曲霉毒素M1的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，測量不確定度主要來源于標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合、樣品稱量、樣品溶液定容、重復(fù)性測量等過程。

4 不確定度評定

4.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度u1，rel

（1） 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度u1，rel，1。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書，黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為10 μg/mL，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.5%（k=2），則標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

（3）黃曲霉毒素M1系列標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度u1，rel，3。黃曲霉毒素M1系列標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程中共使用A 級(jí)1 mL 刻度吸管11次，按上述評定方法，A 級(jí)1 mL 刻度吸管引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(V1mL)=0.004 65，則曲霉毒素M1系列標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

將上述三項(xiàng)不確定度分量合成，得標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度u2，rel

分別測定系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中黃曲霉毒素M1的熒光強(qiáng)度，測定結(jié)果見表1。以樣品中黃曲霉毒素M1質(zhì)量分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)、熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，回歸方程斜率b=364 32，截距a=1 122.5，相關(guān)系數(shù)r=0.999 9。取顯著水平為1%，置信概率為99%，自由度為4，查表得臨界相關(guān)系數(shù)r0.01，4=0.917 2，則r＞r0.01，4，表明標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好。

表1 黃曲霉毒素M1 系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液測定結(jié)果

按式(2)和式(3)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

將以上數(shù)據(jù)帶入式(2)和式(3)，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u2=0.011 0 ng/mL。

對已經(jīng)處理好的樣品溶液進(jìn)行8 次測定，計(jì)算得黃曲霉毒素M1的平均質(zhì)量濃度為1.27 ng/mL，準(zhǔn)曲線擬合引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

4.3 樣品稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度u3，rel

4.4 樣品溶液定容引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度u4，rel

合并上述3 項(xiàng)不確定度分量，得樣品溶液定容過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

4.5 重復(fù)性測量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度u5，rel

按實(shí)驗(yàn)方法對樣品溶液重復(fù)測定8 次，計(jì)算得樣品中黃曲霉毒素M1平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.522 μg/kg，8 次測定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差s=0.019 2，則重復(fù)性測量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

4.6 合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel

以上各不確定度分量彼此獨(dú)立，互不相關(guān)，則合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

4.7 擴(kuò)展不確定度及結(jié)果表示

取95%置信區(qū)間，包含因子k=2，擴(kuò)展不確定度U=2×0.026×0.522=0.027 μg/kg。

高效液相色譜法測定奶粉中黃曲霉毒素M1含量的測定結(jié)果可表示為(0.522±0.027) μg/kg，k=2。

5 結(jié)語

依據(jù)國家食品污染物和有害因素風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測工作手冊中《乳及乳制品中黃曲霉毒素M1的免疫親和柱層析凈化HPLC 法測定的標(biāo)準(zhǔn)操作程序》，測定奶粉中黃曲霉毒素M1含量，對測定結(jié)果的不確定度進(jìn)行評定。當(dāng)樣品中黃曲霉毒素M1的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.522 μg/kg 時(shí)，其擴(kuò)展不確定度為0.027 μg/kg(k=2)。測定結(jié)果的不確定度主要來源于標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制，與趙薇[16]、陳夢[17]等研究一致；重復(fù)性測量和樣品溶液定容過程的影響也較大，而標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合影響較小，可能與系列標(biāo)準(zhǔn)溶液各濃度點(diǎn)分別測定3 次后制作回歸曲線有關(guān)。在實(shí)際工作中，可以通過選用A 級(jí)標(biāo)準(zhǔn)玻璃器具、優(yōu)化樣品處理方法、選擇高純度的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，平行測定樣品和系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，減小結(jié)果的不確定度，提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。