陳銳 熊壯 陳仁富

1徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科（江蘇 徐州 221000）；2徐州醫(yī)科大學(xué)研究生院（江蘇 徐州 221002）

腎細胞癌（renal cell carcinoma，RCC）是一種起源于腎小管和集合管上皮細胞的惡性腫瘤，約占腎惡性腫瘤的80%～90%［1］。臨床上主要通過手術(shù)切除治療RCC，但流行病學(xué)調(diào)查顯示約30%RCC患者在首次就診時已發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，且有10%～28%的RCC 患者在術(shù)后仍會出現(xiàn)轉(zhuǎn)移［2-3］。因此，積極尋找早期診斷RCC 的生物標志物，對于指導(dǎo)患者的臨床治療及改善預(yù)后具有重要意義。白細胞介素-1（Interleukin-1，IL-1）家族是一類能夠影響腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）進而導(dǎo)致腫瘤細胞逃逸宿主免疫細胞對其殺傷作用的重要調(diào)節(jié)因子，在腫瘤進展中發(fā)揮關(guān)鍵作用［4-5］。研究業(yè)已表明，IL-1 家族成員如IL-18、IL-37、IL-33、IL-1β 等均參與RCC 的發(fā)生發(fā)展，并且與RCC患者的生存預(yù)后密切相關(guān)［6-9］。IL-38 是新發(fā)現(xiàn)的一種IL-1 家族成員，在TME 中能夠發(fā)揮抑制炎癥的作用，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、惡性轉(zhuǎn)化、浸潤和轉(zhuǎn)移［10］?；诖?，本研究探討了IL-38 在RCC 中的表達水平，并分析其與RCC 患者臨床病理特征之間的關(guān)系，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象前瞻性選取2019年9月至2021年6月徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科住院的78 例行腹腔鏡腎癌根治性切除術(shù)的腎透明細胞癌患者作為腎癌組，其中男43 例，女35 例，年齡平均（57.12±10.91）歲。收集其臨床資料，血液及腫瘤和癌旁組織標本，癌旁組織為癌灶周2 cm 以外正常腎組織，并經(jīng)病理證實無癌細胞浸潤。納入標準：（1）經(jīng)病理診斷為腎透明細胞癌患者；（2）均為初診初治患者，術(shù)前均未行化療、放療、免疫靶向治療及手術(shù)治療；（3）臨床資料完整；（4）均簽署知情同意書。排除標準：（1）合并其他惡性腫瘤；（2）合并其他自身免疫性疾??；（3）存在全身感染性疾病者；（4）存在其他腎臟器質(zhì)性疾病者。另外，選擇同時期的60 例來我院體檢的健康志愿者作為對照組，其中男32 例，女28 例，年齡平均（54.10 ±11.81）歲。兩組受試者的性別、年齡相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。本研究經(jīng)徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會批準，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測血清IL-38水平腎癌組對象均于入院第2 天清晨空腹抽取3 mL 不抗凝靜脈血，水平離心機2 500 r/min 離心10 min，收集上層血清，-80 ℃保存待測。采用人IL-38 ELISA 試劑盒（美國R&D 公司）檢測研究組及對照組血清中IL-38 水平，所有操作步驟嚴格按照說明書介紹的方法進行。

1.2.2 流式細胞術(shù)檢測外周血單個核細胞（PBMC）中Treg 和Th17 細胞表達采集所有研究對象5 mL 抗凝靜脈血，采用人淋巴細胞分離液（天津灝洋生物公司）通過密度梯度離心法分離得到PBMC，一部分PBMC 經(jīng)PBS 洗滌離心后加入鼠抗人CD4-FITC 抗體，鼠抗人CD25-PE 抗體，鼠抗人CD127-Alexa Fluor 647抗體（美國BD公司），同時設(shè)同型對照管，室溫避光孵育30 min 后，采用LSRF ortessa型流式細胞儀（美國BD公司）檢測Treg細胞，其表型為CD4+CD25+CD127-。另一部分PBMC 加入2 μL Leukocyte Activation Cocktail，with BD GolgiPlug刺激劑（美國BD 公司），37 ℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育6 h；流式管收集細胞，加入鼠抗人CD4-BV421 抗體（美國BD 公司），室溫避光孵育30 min 后加入固定破膜液固定細胞10 min，洗滌離心后加入5 μL鼠抗人IL-17A-PE 抗體（美國BD 公司），室溫避光孵育30 min后，采用LSRF ortessa型流式細胞儀（美國BD公司）檢測Th17細胞，其表型為CD4+IL-17A+。

1.2.3 實時熒光定量PCR 法（qPCR）檢測IL-38 mRNA 水平Trizol 法提取腎癌組織及癌旁組織中總RNA，并將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，qPCR 檢測腎癌組織及癌旁組織中IL-38 mRNA 水平。qPCR 序列如下，IL-38 上游5′-TTATCCTTGTGGGCTCAGTT-3′，下游5′-AATCCGTTCCCTTGGCTTTT-3′；GAPDH 上游5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，下游5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料采用均數(shù)±標準差表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析；計數(shù)資料用例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；繪制ROC 曲線并計算IL-38診斷腎癌的敏感度、特異度及ROC 曲線下面積（AUC）。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 健康對照組和腎癌組血清IL-38 表達水平比較腎癌組血清中IL-38 為（107.44±37.84）pg/mL，健康對照組為（174.22 ± 49.34）pg/mL，兩組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=9.001，P＜0.001），見圖1。

圖1 兩組血清IL-38 的表達水平Fig.1 Serum IL-38 expression levels in the two groups

2.2 不同臨床病理特征腎癌患者血清IL-38 水平的比較不同年齡及性別患者血清中IL-38 水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；不同腫瘤TNM分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Fuhrman 分級及腫瘤大小患者的IL-38 水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），見表1。

表1 IL-38 表達水平與腎癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系Tab.1 The relationship between IL-38 expression level and clinicopathological features of renal cancer patients ±s

表1 IL-38 表達水平與腎癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系Tab.1 The relationship between IL-38 expression level and clinicopathological features of renal cancer patients ±s

項目性別例數(shù)血清IL-38（pg/mL）t 值-0.354 P 值0.724男 女43 35 106.07±35.47 109.13±41.02年齡＜60 歲≥60 歲TNM 分期-1.689 0.095 36 42 99.72±38.21 114.06±36.68 15.876＜0.001ⅠⅡⅢⅣ40 20 14 4 126.73±32.87 103.19±27.40 74.59±28.04 50.84±12.15淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是 否13 65 72.74±30.91 114.38±35.35 3.951＜0.001 Fuhrman 分級Ⅰ-ⅡⅢ-Ⅳ腫瘤大?。?.0 cm 4.0～6.9 cm＞7.0 cm 5.685＜0.001 53 25 121.55±32.82 77.55±29.82 20.345＜0.001 25 33 20 131.83±30.83 109.84±31.67 73.01±29.52

2.3 血清IL-38 水平對腎癌的診斷價值ROC 曲線分析顯示血清IL-38 為150.65 pg/mL 時，預(yù)測診斷腎癌的曲線下面積為0.863，靈敏度為71.7%，特異度為87.2%，見圖2。

圖2 血清IL-38 水平對于診斷腎癌的ROC 曲線Fig.2 ROC curve of serum IL-38 level for diagnosis of renal cancer

2.4 癌旁組織和腎癌組織中IL-38 mRNA 的表達腎癌組織中IL-38 mRNA 的表達水平低于癌旁組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），且隨腫瘤分期增加呈遞減趨勢，見圖3。

圖3 不同病理分期腎癌組織及癌旁組織中IL-38mRNA水平Fig.3 IL-38 mRNA levels in renal carcinoma tissues and adjacent tissues at different pathological stages

2.5 健康對照組和腎癌組外周血Treg和Th17細胞表達水平比較兩組外周血Treg 細胞、Th17 細胞流式細胞術(shù)設(shè)門圖見圖4A、B。腎癌組外周血中Treg 細胞表達水平為（3.23 ± 1.82）%，健康對照組為（5.26 ± 1.56）%，兩組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=6.909，P＜0.001），見圖4C。腎癌組外周血中Th17 細胞表達水平為（2.94 ± 1.54）%，健康對照組為（1.87 ± 0.71）%，兩組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-5.444，P＜0.001），見圖4D。

圖4 兩組外周血Treg 細胞和Th17 細胞百分率比較Fig.4 Comparison of the percentage of Treg cells and Th17 cells in peripheral blood between the two groups

2.6 腎癌組手術(shù)前后外周血Treg、Th17 細胞表達水平和血清IL-38 水平的比較腎癌組術(shù)前、術(shù)后Treg 細胞、Th17 細胞流式細胞術(shù)設(shè)門圖見圖5A、B。對78 例腎癌患者進行1 個月的術(shù)后隨訪，失訪21例，最終共計納入57 例腎癌患者。57 例腎癌患者術(shù)后外周血Treg 細胞表達水平為（4.51 ± 1.79）%，術(shù)前外周血Treg 細胞表達水平為（3.51 ± 1.65）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-12.79，P＜0.001），見圖5C；57 例腎癌患者術(shù)后外周血Th17 細胞表達水平為（1.42 ± 0.99）%，術(shù)前外周血Th17 細胞表達水平為（2.57 ± 1.55）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=10.309，P＜0.001），見圖5D；57 例腎癌患者術(shù)后血清IL-38水平為（139.18 ± 44.07）pg/mL，術(shù)前血清IL-38 水平為（111.71 ± 37.65）pg/mL，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-9.981，P＜0.001），見圖5E。

圖5 腎癌患者手術(shù)前后外周血Treg、Th17 細胞表達水平和血清IL-38 水平Fig.5 Expression levels of Treg and Th17 cells in peripheral blood and serum IL-38 levels in patients with renal cancer before and after surgery

3 討論

腎細胞癌是泌尿系統(tǒng)最為常見的一種惡性腫瘤，其起病隱匿、多變，患者臨床癥狀多不典型，絕大數(shù)患者初次就診時已處于腫瘤的中晚期，往往錯過最佳的治療時機，導(dǎo)致患者預(yù)后較差［11-12］。流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國腎癌發(fā)病率呈逐年上升趨勢，且發(fā)病年齡越來越年輕化，若不早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療，將嚴重降低患者生活的質(zhì)量并且導(dǎo)致患者預(yù)后不佳［13］。手術(shù)切除是治療腎癌的主要方案，但多數(shù)患者在首次就診時已發(fā)生局部進展或者遠處轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致手術(shù)難度加大，治療手段局限匱乏，且部分患者術(shù)后仍會出現(xiàn)術(shù)后轉(zhuǎn)移，嚴重影響患者的生存預(yù)后［14-15］。因此，尋找新的能夠早期篩查腎癌的生物標志物對于提高患者的臨床治療效果及預(yù)后有著極其重要的臨床意義。

IL-38 是新發(fā)現(xiàn)的IL-1 家族成員，因其在炎癥進程中發(fā)揮關(guān)鍵的抗炎作用，近年來其在腫瘤、自身免疫病等疾病中所扮演的角色越來越受關(guān)注［16-18］。IL-38 與多種腫瘤疾病具有相關(guān)性，如宮頸癌、胃癌及肺癌等均發(fā)現(xiàn)IL-38 的表達［19-21］?；诖耍狙芯勘容^了IL-38 在腎癌患者血清中的表達水平，發(fā)現(xiàn)腎癌患者血清中IL-38 表達水平明顯降低，提示IL-38 可能參與腎癌的發(fā)病。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)血清IL-38 水平與腫瘤分期、分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤大小密切相關(guān)，而腫瘤分期、分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤大小是評估腎癌患者預(yù)后的重要指標，所以本研究結(jié)果也間接提示腎癌患者血清中IL-38 水平可以在一定程度反映患者的預(yù)后。同樣在腎癌組織中也發(fā)現(xiàn)IL-38 mRNA 水平表達降低，且隨腫瘤分期增加呈遞減趨勢。然而，臨床上通過腎臟穿刺活檢檢測IL-38 mRNA 存在一定的困難，考慮到血清IL-38 檢測的便捷性，因此建議早期行血液學(xué)檢測。為此本研究進一步繪制了ROC 曲線，發(fā)現(xiàn)腎癌患者血清中IL-38 截點為150.65 pg/mL 時，曲線下面積為0.863，在診斷方面，其靈敏度為71.7%，特異度為87.2%，具有較好的敏感度和特異度。

研究發(fā)現(xiàn)，IL-38 能夠抑制Toll 樣受體介導(dǎo)的NF-κB 和MAPKs 炎癥通路，從而影響哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）激活，進而導(dǎo)致Th17 細胞分化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)STAT3 通路磷酸化水平受到抑制，減少Th17 細胞轉(zhuǎn)錄子RORγt 生成，最終抑制Th17 細胞產(chǎn)生和分化［22-23］。巨噬細胞作為維持免疫微環(huán)境平衡的關(guān)鍵調(diào)控者，另一項研究表明IL-38 能夠限制巨噬細胞的功能，進而打破巨噬細胞維持Th17/Treg 細胞免疫平衡的作用，參與腫瘤、炎癥性疾病的發(fā)?。?4］。免疫微環(huán)境的平衡與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，其中Th17 細胞和Treg 細胞一直以來是研究腫瘤免疫的熱點，Th17 細胞能夠促進腫瘤免疫反應(yīng)，而Treg 細胞能夠抑制腫瘤免疫反應(yīng)［25-27］。既往研究證實，在腎癌患者外周血中Th17 細胞表達增高，Treg 細胞表達降低，且與腎癌患者臨床分期和生存預(yù)后密切相關(guān)［28］。本研究結(jié)果與其報道一致，同樣發(fā)現(xiàn)腎癌患者外周血中Th17 細胞表達增高，Treg 細胞表達降低?；贗L-38 作為Th17/Treg 細胞平衡的重要調(diào)控因子，腎癌患者血清中IL-38 異常表達可能是導(dǎo)致腎癌患者免疫失衡進而影響疾病發(fā)生、發(fā)展的重要因素。

然而，本研究還存在一定的局限性，考慮到本研究為單中心研究，樣本量較少，以后還需進行多中心合作，進一步擴大樣本量；本研究的隨訪時間較短，下一步將進一步延長隨訪時間，觀察腎癌患者術(shù)后血清中IL-38 水平的動態(tài)變化，同時預(yù)測其與腎癌患者生存預(yù)后的關(guān)系；此外本研究為前瞻性隊列研究，比較了腎癌患者外周血和癌組織中IL-38 水平，沒有進一步深入研究IL-38在腎癌發(fā)病中發(fā)揮何種作用以及發(fā)病機制，未來可以進一步從功能層面深入探討IL-38 對腎癌細胞作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)IL-38 在腎癌患者外周血及組織中均明顯降低，血清中IL-38 水平與臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，術(shù)后患者血清IL-38 水平高于術(shù)前，且其對腎癌具有良好的預(yù)測性，有望成為新型生物學(xué)標志物。