王玉芝 吳燕虹 張斌 唐建兵 程飚 陳建武

南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院燒傷整形科（廣州 510010）

骨髓移植應用廣泛，而骨髓微環(huán)境對移植骨髓細胞功能的發(fā)揮至關重要，它由不同的基質(zhì)細胞組成，包括內(nèi)皮細胞、成纖維細胞、脂肪細胞和成骨細胞等。大量研究證實，骨髓細胞聯(lián)合成骨細胞、間充質(zhì)干細胞甚至去骨髓的骨瓣等均可促進骨髓植入，有利于清髓受體的造血重建及耐受誘導。同時，基質(zhì)細胞和骨髓細胞間存在MHC 限制性，即二者MHC相容才有利于骨髓植入［1-2］。而帶血管的骨髓移植（vascularized bone marrow transplantation，VBMT）是將含血供的骨組織通過顯微血管吻合的方式移植給受體，在不破壞骨髓天然的物理環(huán)境的情況下同時移植骨髓細胞和基質(zhì)細胞，也許可作為一種新的高效骨髓移植方法。本研究目的即利用前期構建的VMBT 模型［3-4］，探索其造血重建潛能。

1 材料與方法

1.1 實驗動物近交系Lewis（RT11）大鼠共27只、鼠齡6～8 周，210～230 g、雄性、購自維通利華，動物質(zhì)量合格證號：SCXK（京）2017-0008。飼養(yǎng)條件為SPF 級，實驗動物飼養(yǎng)設施合格證號：SYXK（粵）2019-0100。

1.2 試劑與儀器青霉素鈉（哈藥集團制藥總廠）；戊巴比妥（百瑞金生物）；紅細胞裂解液（BioLegend，美國）；1640 培養(yǎng)基和胎牛血清（Hyclone，美國）；小鼠抗大鼠PE-CD90 單抗（eBioscience，美國）；小鼠PE-IgG1 同型對照抗體（BioLegend，美國）；生物學X-ray 輻照儀（Rad Source，美國）；自動細胞計數(shù)儀（Inno-Alliance Biotech，美國）。

1.3 實驗分組以Lewis 近交系大鼠為動物進行同品系間的骨髓移植，受體移植前1 d 給予5 Gy（1 050 Gy/min）的X 線放射清髓，然后移植骨髓。根據(jù)骨髓移植方法的不同分為3 個組，每組6 只：VBMT 組（實驗組）移植完整的股骨；i.v.BMT 組（陽性對照組）靜脈注射與單根股骨骨髓含量相當?shù)墓撬杓毎s5 × 107/0.5 mL；Control 組（陰性對照組）注射等量生理鹽水。

1.4 骨髓移植

1.4.1 帶血管的骨髓移植手術步驟同前報道［5］。簡單說即切開供體腹股溝區(qū)，剝離皮下、暴露股動脈和膝關節(jié)；結扎股動脈發(fā)出的肌支、腹壁淺和隱動靜脈；剝離膝關節(jié)周圍的肌群；結扎腘動脈的其他分支僅保留分出的膝降動脈；然后分離股動靜脈，并保護股深動靜脈；最后切斷膝關節(jié)和髖關節(jié)周圍的肌肉和韌帶，游離出股骨。同樣，受體也于腹股溝區(qū)做一切口，剝離股動靜脈；然后移植供體股骨，股骨頭朝內(nèi)，置于受體腹股溝區(qū)，11-0 顯微線吻合供受體間的股動靜脈，關閉皮膚切口，手術結束（圖1）。術后連續(xù)3 d 腹腔注射青霉素，10 萬U/（kg·d）預防感染。

圖1 股骨移植后第10天可見表面肌肉紅潤、血管蒂搏動良好Fig.1 The transplanted femur was covered by pink muscle tissues with a patent vessel pedicle on postoperative day 10

1.4.2 靜脈骨髓移植取大鼠股骨和脛骨，以5 mL含2 %胎牛血清的1640 培養(yǎng)基反復沖洗骨髓腔，收集細胞懸液，200目篩網(wǎng)過濾；350 g離心5 min，去上清后加入2 mL 1×RBC lysis Buffer 裂紅3～5 min；再加10 mL PBS 終止裂紅，離心后PBS 重懸。然后將所得細胞懸液稀釋后，與0.2 %臺盼藍1∶1 等體積混合，自動細胞計數(shù)儀進行計數(shù)。根據(jù)計數(shù)結果吸取5 × 107/0.5 mL 的骨髓細胞，經(jīng)大鼠陰莖背靜脈注射骨髓細胞或生理鹽水。

1.5 檢測指標所有受體于清髓前、清髓后第5、10 和15 天，斷尾采血0.3～0.5 mL，血細胞分析儀上監(jiān)測受體外周血中各種群細胞數(shù)的變化。清髓后第10 天處死部分大鼠，剝離脾臟，去除周圍的脂肪和筋膜組織后于萬分之一電子天平稱重，計算脾臟指數(shù)。脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量（mg）/鼠質(zhì)量（10 g）。脾臟常規(guī)行HE 染色切片，而骨組織需甲醛固定后再用10%EDTA 脫鈣，每6 h 更換一次脫鈣液，直到大頭針能輕松刺進骨密質(zhì)為完成脫鈣標準，切片（3～5 μm），HE 染色。清髓后第10 天，分別制備受體股骨和脛骨的骨髓細胞懸液，細胞計數(shù)（方法同前）。同時從中吸取100 μL 的單細胞懸液（約106個細胞），加入Anti-Rat CD90 PE 或者IgG2a-PE，室溫避光染色15～30 min；流式洗液洗滌2～3 次后500 μL PBS 重懸，流式檢測。

1.6 統(tǒng)計學方法所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，應用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件分析行成組t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 外周血各種群細胞的恢復各組大鼠經(jīng)5 Gy的X 線照射后白細胞和血小板數(shù)均顯著減少，第5 天時已減少90%以上。之后VBMT 或i.v.BMT 組白細胞逐漸恢復，且恢復速度明顯快于對照組，到第15 天時VBMT 組已大致接近照射前水平，i.v.BMT 恢復雖然稍慢于VBMT，但差異無統(tǒng)計學意義。對照組未給予骨髓移植，白細胞恢復遲緩，與i.v.BMT（P=0.003）和VBMT（P＜0.001）相比差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖2A）。同樣，VBMT或i.v.BMT 組血小板恢復速度也明顯快于對照組（P＜0.05，圖2B）。

圖2 VBMT 和i.v.BMT 均促進了部分清髓受體白細胞和血小板的恢復Fig.2 Both VBMT and i.v.BMT accelerated recovery of the leukocytes and platelets of nonmyeloablative recipients

2.2 脾集落的生成脾集落是機體受到電離輻射后，造血干細胞遷移到脾臟起代償性造血的造血灶。它與骨髓中具有增殖分裂能力的造血干細胞數(shù)量呈良好的線性關系。在小鼠中脾集落形成較為明顯，但本實驗中由于放射劑量僅為5 Gy，且大鼠脾臟較大，表面結節(jié)不易觀察，故對比各組的脾臟指數(shù)。放射后10 d可見對照組脾臟明顯萎縮，脾臟指數(shù)也較低，僅為正常脾臟大小的1/2。i.v.BMT組也發(fā)生了輕度的萎縮，且與正常脾指數(shù)相比差異有統(tǒng)計學意義（P=0.003），但明顯高于對照組（P＜0.001）。而VBMT 組脾臟不但未萎縮，反而有增加趨勢，脾臟指數(shù)略高于正常脾，但差異無統(tǒng)計學意義（P=0.323，圖3）。

圖3 脾臟大體觀察及脾臟指數(shù)變化Fig.3 Gross appearance of the spleens and changes of spleen index after nonmyeloablative irradiation

病理學結果和大體觀察類似，正常脾白髓紅髓結構清楚，白髓內(nèi)可見明顯的淋巴小結，紅髓區(qū)脾索內(nèi)也可見大量淋巴細胞，脾血竇充血富含紅細胞。但照射后10 d 對照組發(fā)生了明顯的損傷性變化，白髓內(nèi)淋巴小結萎縮甚至消失，其中淋巴細胞數(shù)顯著減少，紅髓內(nèi)有核細胞也減少。而VBMT 組脾臟組織結構有好轉(zhuǎn)趨勢，如白髓內(nèi)雖然結構較紊亂但淋巴小結增多，周圍淋巴細胞也明顯增加，脾索內(nèi)可見大量有核細胞。i.v.BMT 組與VBMT 組表現(xiàn)類似（圖4）。

圖4 放射后10 d 脾臟HE 染色結果（×40）Fig.4 Hematoxylin and eosin staining results of spleen on 10th day after irradiation（×40）

2.3 造血系統(tǒng)的重建術后10 d 可見移植股骨表面肌肉紅潤，血管蒂通暢，見圖1。骨髓HE 染色與正常骨髓無異可見大量排列緊密的嗜堿性骨髓細胞，邊緣清晰，而放射后各組骨髓細胞顯著減少，尤其對照組骨髓細胞幾乎消失，大部分骨髓被類似脂肪空泡性組織所取代，僅散在的分布少數(shù)骨髓細胞。而VBMT 和i.v.BMT 組明顯優(yōu)于對照組，雖然髓腔內(nèi)也可見大量空泡性組織，但仍有稀疏的骨髓細胞分布（圖5）。

圖5 放射后10 d 骨髓HE 染色（×40）Fig.5 Hematoxylin and eosin staining results of bone marrow on 10th day after irradiation（×40）

骨髓細胞計數(shù)的結果與HE 染色類似，無論股骨還是脛骨，VBMT或i.v.BMT都加速了骨髓的再生或恢復，骨髓細胞數(shù)雖少于正常骨髓，但較對照組高一個數(shù)量級（P=0.002）。不過VBMT組雖有高于i.v.BMT 的趨勢但兩者間差異無統(tǒng)計學意義（圖6）。進一步比較各組CD90+干細胞數(shù)，發(fā)現(xiàn)VBMT、i.v.BMT及對照組分別為（21.3±3.5）%，（31.5±1.7）%，（30.1 ± 4.5）%均高于正常組（17.7 ± 2.8）%，且除VBMT 組外差異有統(tǒng)計學意義，提示放射后各組可能均處于活躍造血中。

圖6 放射后10 d 各組脛骨和股骨骨髓細胞計數(shù)結果Fig.6 Total number of BMCs in tibia and femur on 10th day after irradiation

3 討論

骨髓中除干細胞外還存在著由毛細血管竇組成的毛細血管網(wǎng)、骨髓內(nèi)骨架組成的骨小梁網(wǎng)和各種間質(zhì)（網(wǎng)狀）細胞組成的間質(zhì)細胞網(wǎng)等［6］。而造血細胞即填充于這些網(wǎng)絡間隙中，以灶狀造血結構的形式存在。周圍的各種基質(zhì)細胞除為造血細胞提供特殊的接觸表面外，同時還產(chǎn)生細胞外基質(zhì)（ECM）成分和造血生長因子，為造血細胞提供生長所需的空間和營養(yǎng)成分，對骨髓功能的正常發(fā)揮起著不可或缺的作用［7-8］。本研究在基本不破壞骨髓微環(huán)境前提下，同時移植骨髓細胞和微環(huán)境，成功加速重建了部分清髓受體的造血系統(tǒng)。這種移植方式有可能作為一種更加高效的骨髓移植方法。因為在其自身的微環(huán)境中，不存在MHC 限制性的問題，骨髓細胞可更好的保持自身增殖和分化能力，持續(xù)為清髓受體提供基質(zhì)細胞和造血干細胞。文獻報道，靜脈骨髓移植聯(lián)合供體去骨髓的骨瓣皮下或腎包膜下移植可顯著增加9 Gy 清髓受體的脾集落數(shù)，且可完全防止系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠疾病的發(fā)生，而單獨移植造血干細胞或骨瓣均無效［9-10］。同樣，國內(nèi)研究也發(fā)現(xiàn)骨髓細胞聯(lián)合成骨細胞或間充質(zhì)干細胞可促進清髓受體的造血或耐受的誘導［11-12］，說明了骨髓基質(zhì)環(huán)境的重要性。這也是門靜脈注射全骨髓細胞（含基質(zhì)細胞）優(yōu)于傳統(tǒng)的靜脈骨髓的原因之一，因為門脈注射的骨髓細胞和基質(zhì)細胞共同阻滯于肝臟內(nèi)，早期即可在局部相互作用形成了一個造血灶，然后再逐步遷移到全身［13-14］。這一點也與VBMT的造血模式比較相似，首先移植股骨內(nèi)自我造血，然后再逐步遷移到受體骨髓發(fā)揮造血作用。

然而，本研究雖然VBMT 有優(yōu)于i.v.BMT 的趨勢，但差異并無統(tǒng)計學意義，這與以往文獻報道的VBMT 優(yōu)于i.v.BMT 不同［4，15］。分析其原因，可能與實驗樣本數(shù)偏少有關。另外，可能也與本研究所采用的模型和放射劑量相關。因為以往是將大鼠后肢移植給經(jīng)致死劑量照射的大鼠，而本研究為了排除皮膚、皮下、淋巴等其他組織的影響，采用了一種成分更加單一的模型，即單純的股骨，從而使兩者更加具有可比性。另外，本研究僅給予5 Gy 的劑量照射，使受體體內(nèi)原有的基質(zhì)細胞得以存活，為靜脈骨髓細胞的生長增殖提供了有利條件［16］，對照組所有大鼠無需骨髓移植即可自我恢復充分說明了這一點。

目前，對于帶血管的骨髓移植主要集中異體復合組織移植。因為某些復合組織移植物如手、臉等本身即含有骨瓣，因而研究其中骨髓對于耐受誘導有重要的臨床意義［16］?，F(xiàn)在已有研究證實，復合組織中的骨瓣在特定的免疫誘導方案下，無需放射清髓和額外的骨髓移植即可自我誘導耐受［4，15］。而靈長類動物實驗也發(fā)現(xiàn)，在同樣的免疫抑制方案下臉移植時如果附帶骨瓣則可長期存活，而不帶骨瓣則早期排斥，都說明了骨瓣中骨髓的重要作用［17-19］。因此，課題組后續(xù)的實驗將重點探索帶血管的骨髓移植的免疫誘導潛能，從而為其臨床應用提供可能的理論基礎。