馬原，任小盈，馬存強(qiáng)，徐成成，馬冰凇3,，王子浩

（1.信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院信息工程學(xué)院，河南信陽(yáng) 464000）

（2.聊城高級(jí)財(cái)經(jīng)職業(yè)學(xué)校，山東聊城 252000）

（3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，江蘇南京 210095）

（4.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)院，云南昆明 650201）

（5.信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院茶學(xué)院，河南省豫南茶樹(shù)資源綜合開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南信陽(yáng) 464000）

茶葉（Camellia sinensisL.）是廣受世界上三分之二人口消費(fèi)的風(fēng)味、功能性的非酒精類飲料[1]，按照加工工藝分為綠茶、白茶、黃茶、烏龍茶、紅茶和黑茶等六大基本茶葉類型[2-4]。白茶是直接由茶樹(shù)鮮葉經(jīng)自然萎凋（Prolonged withering）和干燥（Drying）兩道工序加工而成的茶葉類型[5]，具有抗氧化、消炎、抗誘變、抗癌和神經(jīng)保護(hù)等保健功效[6-8]，這與白茶中兒茶素、黃酮類、酚酸類、嘌呤堿等品質(zhì)成分有關(guān)[9]。

自然萎凋是白茶加工的關(guān)鍵工序[10]。(+)-兒茶素（Catechin，C）、(+)-沒(méi)食子兒茶素（Gallocatechin，GC）、(-)-表兒茶素（Epicatechin，EC）、(-)-表沒(méi)食子兒茶素（Epigallocatechin，EGC）等非酯型兒茶素以及(-)-兒茶素沒(méi)食子酸酯（Catechin galllate，CG）、(-)-表兒茶素沒(méi)食子酸酯（Epicatechin gallate，ECG）、(-)-沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（Gallocatechin gallate，GCG）和(-)-表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（Epigallocatechin gallate，EGCG）等酯型兒茶素在白茶自然萎凋工序中均呈降低趨勢(shì)[10,11]，并受萎凋程度等因素的影響[12]。Chen 等[13,14]借助代謝組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)揭示了白茶加工中揮發(fā)性和非揮發(fā)性代謝組分變化規(guī)律。倉(cāng)儲(chǔ)、產(chǎn)地、茶樹(shù)品種、原料等級(jí)均對(duì)白茶品質(zhì)成分有一定影響[15-19]。然而，采制季節(jié)對(duì)白茶品質(zhì)成分影響尚不清楚。

福建福鼎、政和為白毫銀針、白牡丹、貢眉等白茶的原產(chǎn)地。如今，白茶的產(chǎn)地已擴(kuò)展到云南、湖北、廣東等產(chǎn)區(qū)。信陽(yáng)白茶是以當(dāng)?shù)卮蟀撞韬痛蠛敛璧热后w種茶樹(shù)鮮葉為原料經(jīng)自然萎凋、自然干燥或文火微焙等工序加工而成的輕發(fā)酵茶葉類型，具有湯色杏黃晶亮、滋味鮮爽甘醇的品質(zhì)特征，廣受國(guó)內(nèi)外消費(fèi)者的喜愛(ài)。本文結(jié)合高效液相色譜（High performance liquid chromatography，HPLC）等技術(shù)通過(guò)對(duì)信陽(yáng)白茶的兒茶素、黃酮類、嘌呤堿、游離氨基酸等品質(zhì)成分進(jìn)行研究，探究信陽(yáng)白茶的品質(zhì)特征以及春季、夏季、秋季等不同采制季節(jié)信陽(yáng)白茶中的品質(zhì)成分差異，為白茶采制季節(jié)的識(shí)別提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

信陽(yáng)市浉河區(qū)天云山茶場(chǎng)等地加工生產(chǎn)的信陽(yáng)白茶茶樣共18 款，如表1 所示，按采制季節(jié)分為春季、夏季和秋季白茶。白茶茶樣加工完成后在-20 ℃下密封保存。

表1 18 款不同采制季節(jié)的信陽(yáng)白茶茶樣信息表Table 1 Information of 18 Xinyang white tea samples collected and processed in different seasons

C、EC、EGC、GC、ECG、CG、GCG、EGCG、沒(méi)食子酸、鞣花酸、1,4,6-三-O-沒(méi)食子酰基-β-D-葡萄糖（水解單寧，1,4,6-tri-O-galloyl-β-D-glucose，TGG）等標(biāo)品（純度≥98%）購(gòu)自上海源葉生物科技；槲皮素、山奈酚、楊梅素、蘆丁、花旗松素和木犀草素等黃酮類標(biāo)品（純度≥98%）購(gòu)自成都曼斯特生物科技；咖啡堿、可可堿和茶堿標(biāo)品（純度≥98%）購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich 公司；色譜純級(jí)甲醇、乙腈購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Heraeus Fresco17 高速離心機(jī)，美國(guó)Thermo Fisher公司；JXFSTPRP-24 研磨儀，上海凈信科技；TU-1901紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析技術(shù)；1200 型HPLC儀，美國(guó)Agilent 公司。

1.3 方法

1.3.1 主要品質(zhì)成分分析

參照GB 5009.3-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測(cè)定》進(jìn)行茶葉中水分的測(cè)定。采用765 nm波長(zhǎng)下的福林酚比色法以沒(méi)食子酸為參照進(jìn)行茶葉中的茶多酚含量測(cè)定[20,21]。采用蒽醌試劑在620 nm 波長(zhǎng)下進(jìn)行茶葉中可溶性糖總量的測(cè)定[21,22]。參照GB/T 8314-2013《茶 游離氨基酸總量的測(cè)定》采用570 nm波長(zhǎng)下的茚三酮比色法進(jìn)行茶葉中游離氨基酸總量的測(cè)定?？傸S酮含量以蘆丁為參照，采用415 nm 波長(zhǎng)下的三氯化鋁比色法進(jìn)行測(cè)定[23,24]。

1.3.2 茶湯浸提

信陽(yáng)白茶茶樣經(jīng)研磨儀研磨，40 目篩網(wǎng)過(guò)篩后，-20 ℃保存?zhèn)溆谩７Q取1.0 g 茶葉研磨樣品，加入40 mL甲醇和4 mL 鹽酸于圓底燒瓶85 ℃回流浸提90 min，冷卻過(guò)濾后，通過(guò)甲醇定容至50 mL。0.45 μm 尼龍濾膜過(guò)濾后用于HPLC 檢測(cè)[25]。

1.3.3 HPLC 檢測(cè)

參照Nian 等[26]構(gòu)建的茶葉中活性成分HPLC 檢測(cè)方法，采用Agilent1200 型HPLC 儀連接Poroshell 120 EC-C18 色譜柱（100×4.6 mm，2.7 μm）和C18保護(hù)柱（10×4.6 mm，5 μm）。流動(dòng)相A 為0.261%磷酸、5%乙腈，流動(dòng)相B 為80%甲醇；洗脫梯度程序見(jiàn)表2。柱溫為30 ℃。0～20 min 檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm；20～36 min 檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm。進(jìn)樣體積為2 μL。采用內(nèi)標(biāo)法協(xié)助完成茶葉中8 種兒茶素、6 種黃酮類、2種酚酸、3 種嘌呤堿和TGG 的定性分析[25,27]。根據(jù)相關(guān)峰面積結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析[25]。

表2 HPLC 洗脫程序Table 2 Elution program of HPLC

1.3.4 感官審評(píng)方法

參照GB/T 23776-2018《茶葉感官審評(píng)方法》和GB/T 14487-2017《茶葉感官審評(píng)術(shù)語(yǔ)》對(duì)18 款不同采制季節(jié)的信陽(yáng)白茶進(jìn)行感官審評(píng)，依次評(píng)判茶葉的外形、湯色、香氣、滋味和葉底，分析總結(jié)春季、夏季和秋季等不同采制季節(jié)信陽(yáng)白茶的品質(zhì)特征。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理與分析

每個(gè)茶樣進(jìn)行三次測(cè)定技術(shù)重復(fù)。數(shù)據(jù)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析和獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析不同季節(jié)白茶中品質(zhì)成分的差異顯著性水平。采用Origin 9.0 軟件進(jìn)行主成分分析（Principal component analysis，PCA）和聚類分析（Hierarchical cluster analysis，HCA）以及數(shù)據(jù)歸一化處理后熱力圖的繪制。

2 結(jié)果分析

2.1 不同采制季節(jié)信陽(yáng)白茶的品質(zhì)特征

如表3 所示，感官審評(píng)顯示了不同采制季節(jié)信陽(yáng)白茶的品質(zhì)特征。整體而言，春季和秋季白茶滋味鮮醇甘厚，湯色嫩黃，鮮爽度較高。而夏季白茶滋味清甜醇正，湯色橙黃。不同采制季節(jié)信陽(yáng)白茶的鮮爽度、苦澀度和甜度差異可能與氨基酸、可溶性糖、兒茶素等品質(zhì)成分的分布有關(guān)。

表3 不同采制季節(jié)信陽(yáng)白茶的品質(zhì)特征Table 3 Quality characteristics of Xinyang white teas processed in various seasons

2.2 信陽(yáng)白茶的主成分分析（PCA）和聚類分析（HCA）

標(biāo)準(zhǔn)液相色譜圖和信陽(yáng)白茶的液相色譜圖如圖1所示，顯示了不同采制季節(jié)信陽(yáng)白茶的液相色譜圖存在一定差異。18 款信陽(yáng)白茶中兒茶素、黃酮類、酚酸、嘌呤堿等品質(zhì)成分詳情見(jiàn)表1。

基于HPLC 和分光光度計(jì)法測(cè)定的24 種品質(zhì)成分含量，對(duì)18 款白茶茶樣分別進(jìn)行了主成分分析（PCA）和聚類分析（HCA）。結(jié)果表明（圖2），PCA和HCA 均能將信陽(yáng)白茶茶樣按照采制季節(jié)不同進(jìn)行歸類，分為春季白茶、夏季白茶和秋季白茶三組，顯示了不同季節(jié)白茶的品質(zhì)成分差異。在PCA 中（圖2a），主成分1（PC1）和主成分2（PC2）的累積貢獻(xiàn)率為72.4%，表明前兩個(gè)主成分已能實(shí)現(xiàn)信陽(yáng)白茶的采制季節(jié)識(shí)別。另外，在HCA 中（圖2b），春季白茶和秋季白茶聚為一組，顯示了其與夏季白茶在品質(zhì)成分上的差異。PCA 和HCA 已廣泛應(yīng)用于不同類型茶葉的分類識(shí)別[28,29]。PCA 和HCA 結(jié)果與信陽(yáng)白茶采制季節(jié)相吻合，顯示了采制季節(jié)等因素對(duì)信陽(yáng)白茶中品質(zhì)成分的深刻影響。

2.3 不同采制季節(jié)信陽(yáng)白茶品質(zhì)成分的熱力圖分析

如圖3 所示，熱力圖分析揭示不同采制季節(jié)信陽(yáng)白茶中兒茶素、黃酮類、嘌呤堿等24 種品質(zhì)成分可基本分為3 組（I 組、II 組和III 組）。I 組包括6 種黃酮類化合物（山奈酚、槲皮素、木犀草素、蘆丁、楊梅素和花旗松素）、總黃酮和可溶性糖；在春季、夏季和秋季等不同采制季節(jié)中呈現(xiàn)先增加后減少的變化趨勢(shì)；夏季白茶中含量最高。II 組主要包括鞣花酸、CG、EGC 和GCG，其在春季和夏季白茶中含量較高；秋季白茶中含量最低。III 組包括TGG、5 種兒茶素（C、EC、GC、ECG和EGCG）、2 種嘌呤堿（咖啡堿、可可堿）、游離氨基酸、茶多酚和沒(méi)食子酸，其在不同采制季節(jié)中呈先減少后增加的變化趨勢(shì)；夏季白茶中含量最低。整體而言，夏季白茶中可溶性糖、6 種黃酮類化合物以及黃酮總量最高；而茶多酚、游離氨基酸、5 種兒茶素和沒(méi)食子酸含量明顯低于春季和秋季白茶。相對(duì)而言，春季和秋季白茶中茶多酚、游離氨基酸、EGCG、GC、ECG、EC和可可堿含量較高。雖然夏季茶樹(shù)鮮葉中茶多酚含量最高[30,31]，茶樹(shù)鮮葉等級(jí)和加工工藝參數(shù)潛在地影響了夏季白茶中茶多酚和兒茶素含量。由于夏季氣溫較高，白茶加工中酶活性增強(qiáng)，促使兒茶素大量水解、氧化、聚合等形成茶黃素，茶紅素等茶色素[32-34]。黃酮類含量在白茶加工中相對(duì)穩(wěn)定，部分黃酮類化合物在自然萎凋工序中或呈增加趨勢(shì)[25,35]，因而夏季白茶中黃酮類含量明顯高于春季和秋季白茶。

2.4 獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)品質(zhì)和單因素方差分析

如圖4 所示，獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)顯示了夏季與春季和秋季白茶在茶多酚、可溶性糖、游離氨基酸、總黃酮、總兒茶素和酯型兒茶素含量上的極顯著性差異（p＜0.001）；而夏季與秋季白茶在非酯型兒茶素含量上無(wú)顯著性差異（p≥0.01），僅與春季白茶存在極顯著性差異（p＜0.001）。另外，春季和秋季白茶在游離氨基酸、總黃酮、總兒茶素和非酯型兒茶素含量上存在極顯著性差異（p＜0.001），以及可溶性糖含量上的顯著性差異（p＜0.01）。單因素方差分析（見(jiàn)表4）顯示，除GC 和茶堿外，不同采制季節(jié)信陽(yáng)白茶中7 種兒茶素、6 種黃酮類、2 種酚酸、TGG 和2 種嘌呤堿含量均呈極顯著性差異（p＜0.001），揭示了采制季節(jié)對(duì)信陽(yáng)白茶品質(zhì)成分的深刻影響。總體來(lái)說(shuō)，春季白茶中EGC、EGCG 和鞣花酸含量極顯著性（p＜0.001）高于夏季或秋季白茶，含量分別為33.26、59.30 和2.81 mg/g。夏季白茶中CG、GCG、6 種黃酮類含量（即：花旗松素、蘆丁、楊梅素、山奈酚、槲皮素、木犀草素）含量極顯著性（p＜0.001）高于秋季白茶，含量分別為0.72、4.40、0.84、2.40、0.97、0.21、0.25 和0.11 mg/g。相反，秋季白茶中C、EC、ECG、沒(méi)食子酸、咖啡堿和可可堿含量極顯著性（p＜0.001）高于夏季或春季白茶，含量分別高達(dá)4.98、14.35、27.02、10.10、36.85 和1.53 mg/g。不同采制季節(jié)信陽(yáng)白茶中兒茶素、黃酮類、酚酸、嘌呤堿等品質(zhì)成分的顯著差異，借助PCA、HCA 等多元統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法，有助于實(shí)現(xiàn)對(duì)信陽(yáng)白茶采制季節(jié)的識(shí)別。

表4 不同采制季節(jié)信陽(yáng)白茶中品質(zhì)成分含量差異Table 4 Quality components differences in Xinyang white tea processed in various seasons

3 結(jié)論

3.1 前人借助HPLC 等方法完成了曬青綠茶[36]、信陽(yáng)毛尖[37]、普洱茶[37,38]基于兒茶素、黃酮類、酚酸、嘌呤堿等品質(zhì)成分的分類比較。本課題組采用HPLC 和紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)法對(duì)18 款不同采制季節(jié)信陽(yáng)白茶中的兒茶素、黃酮類、酚酸類、嘌呤堿以及茶多酚、可溶性糖、游離氨基酸等主要品質(zhì)成分進(jìn)行檢測(cè)，探明了信陽(yáng)白茶的品質(zhì)特征和不同采制季節(jié)信陽(yáng)白茶的品質(zhì)成分差異。

3.2 基于24 種品質(zhì)成分，PCA 和HCA 均能將18 款信陽(yáng)白茶茶樣按照采制季節(jié)進(jìn)行歸類，分為春季、夏季和秋季白茶三組。熱力圖分析將24 種品質(zhì)成分分為3 組（I 組、II 組和III 組），揭示了夏季白茶中可溶性糖和黃酮類含量最高，而春季和秋季白茶中游離氨基酸、茶多酚和兒茶素含量較高。獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和單因素方差分析顯示不同采制季節(jié)信陽(yáng)白茶在7 種兒茶素、6 種黃酮類、2 種酚酸、2 種嘌呤堿和TGG 含量上的極顯著性差異（p＜0.001），為白茶等茶葉采制季節(jié)的識(shí)別提供了科學(xué)依據(jù)。