周泳臣，劉穎，鄭文忠，高峻*，趙一明，茶鳳官，丁海琴，孔勝，呂才有

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)院，云南昆明 650201）

（2.云南省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)茶葉產(chǎn)業(yè)體系建設(shè)栽培研究室，云南昆明650201）

（3.普洱茶樹(shù)良種場(chǎng)，云南普洱 665000）

四千多年前，中國(guó)就有了關(guān)于茶的記載[1]。目前茶樹(shù)已在世界范圍內(nèi)普遍栽培，茶每日消耗量巨大，水是第一大飲料，而茶是第二大飲料[2]。茶中富含大量可溶性物質(zhì)[3]，有茶氨酸、茶多酚、兒茶素、咖啡堿、有機(jī)酸和維生素等。茶有非常多的好處[4]，如抗癌、抗炎、抗菌、抗氧化和降低膽固醇等。近年來(lái)，越來(lái)越多的人開(kāi)始關(guān)心茶葉的品質(zhì)[5]。影響茶葉品質(zhì)的主要因素有茶葉的內(nèi)含物、采摘季節(jié)、加工工藝和儲(chǔ)存方式[6]等，其中與茶葉品種的內(nèi)含物關(guān)系最為密切。基于此，鑒定出不同品種的茶葉內(nèi)含物對(duì)于其品質(zhì)的控制極其重要。

代謝組學(xué)是一種新起的技術(shù)手段[7]，目前，代謝組學(xué)的研究范圍覆蓋細(xì)胞代謝組學(xué)、藥物代謝組學(xué)、代謝性疾病的代謝組學(xué)、植物代謝組學(xué)領(lǐng)域[8]。代謝組學(xué)能夠更有效、更直觀、更準(zhǔn)確、更系統(tǒng)地反映生物體在不同生態(tài)條件下的變化，在研發(fā)新藥[9]、診斷疾病[10]、分析轉(zhuǎn)基因作物[11]、食品安全[12]等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。代謝組學(xué)研究就是分析生物樣品中的代謝產(chǎn)物，并鑒定和篩選出具有研究?jī)r(jià)值的顯著差異代謝物，最后解釋這些差異物的代謝過(guò)程和機(jī)制[13]。在茶葉中，代謝組學(xué)技術(shù)廣泛應(yīng)用于茶樹(shù)栽培、品種分類鑒別、茶葉加工工藝優(yōu)化、茶葉品質(zhì)控制、茶葉年份及品質(zhì)鑒別等[14]方面，對(duì)茶園土壤管理、茶樹(shù)育種的改良、提高茶樹(shù)抗逆性和嫁接砧穗的選擇等有著積極的作用。

在中國(guó)云南省普洱市普洱良種場(chǎng)，實(shí)驗(yàn)人員通過(guò)群體選育的方式獲得了兩個(gè)當(dāng)?shù)氐钠斩鑳?yōu)良品種，這兩個(gè)茶品種有著較高的經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益，適應(yīng)性較強(qiáng)，有一定的推廣價(jià)值，所具備的特點(diǎn)在普洱茶樹(shù)品種中具有一定的代表性。鑒于此，本研究利用代謝組學(xué)技術(shù)分析這兩個(gè)普洱茶品種的代謝差異，旨在為茶葉適制性和品質(zhì)控制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

茶葉樣品于2020年9月底在中國(guó)云南省普洱市普洱良種場(chǎng)的茶園采摘，均為枝條上一芽二葉的嫩芽，采后立即用液氮冷凍保存在-80 ℃環(huán)境中，直到進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)再取出進(jìn)行研究。本次共采了兩個(gè)樣品，對(duì)應(yīng)編號(hào)分別為B1 和B3，B1 代表品種1（桃形葉），B3代表品種3（云瑰），每個(gè)樣品有3 個(gè)重復(fù)。為了探索代謝物在不同樣本的差異，各樣品分組以及對(duì)應(yīng)信息在表1 種列出。

表1 樣品信息及編號(hào)Table 1 Sample information and numbers

品種1（桃形葉）：又名木蘭1 號(hào)、云桃。在云南大葉種茶樹(shù)群體中通過(guò)系統(tǒng)選育技術(shù)得到的優(yōu)良品種，無(wú)性系，喬木型，中葉類，遲生種。在普洱和西雙版納等地有大量試種成功，且在國(guó)內(nèi)其他茶區(qū)均有推廣。春茶一芽二葉干樣含茶多酚30.6%、水浸出物44.8%。該品種耐旱力較強(qiáng)，但抗病蟲(chóng)害能力一般，耐寒能力弱，且熟地適栽性差。

品種3（云瑰）：在云南大葉種茶樹(shù)群體中通過(guò)系統(tǒng)選育技術(shù)得到的優(yōu)良品種，無(wú)性系，植株高大，樹(shù)姿開(kāi)張，分枝角度大，低位分枝多，葉片稍上斜狀著生，葉長(zhǎng)橢圓形，葉色深綠，葉身稍內(nèi)折，葉緣微波，葉尖漸尖，葉齒深而明顯，葉色綠，葉背茸毛密集，芽肥壯。春茶一芽二葉蒸青樣含茶多酚34.10%、兒茶素190.27 mg/g、咖啡堿4.25%、水浸出物48.61%。該品種抗逆性強(qiáng)，生熟地適栽性較好。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)品與試劑

甲醇（色譜純），Merck 品牌；乙腈（色譜純），Merck 品牌；標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純），BioBioPha/Sigma-Aldrich 品牌。

1.3 實(shí)驗(yàn)流程

實(shí)驗(yàn)流程見(jiàn)圖1。

1.4 樣品提取流程

（1）生物樣品放置于凍干機(jī)（Scientz-100F）中真空冷凍干燥；

（2）利用研磨儀（MM 400，Retsch）研磨（30 Hz，1.5 min）至粉末狀；

（3）稱取100 mg 的粉末，溶解于1.2 mL 70%甲醇提取液中；

（4）每30 min 渦旋一次，每次持續(xù)30 s，共渦旋6 次，樣本置于4 ℃冰箱過(guò)夜；

（5）離心（轉(zhuǎn)速12000r/min，10 min）后，吸取上清，用微孔濾膜（0.22 μm pore size）過(guò)濾樣品，并保存于進(jìn)樣瓶中，用于UPLC-MS/MS 分析。

1.5 色譜、質(zhì)譜條件

本研究利用超高效液相色譜（UPLC）和串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行采集。

1.5.1 色譜條件

色譜柱：Agilent SB-C18 1.8 μm，2.1 mm×100 mm；流動(dòng)相A：超純水（加入0.1%的甲酸）；流動(dòng)相B：乙腈（加入0.1%的甲酸）；洗脫梯度：0 min B 相比例為5%，直到9 min，B 相比例線性增加至95%，同時(shí)持續(xù)95% 1 min，10～11 min，B 相比例驟降至5%，直至14 min，一直保持在5%；流速0.35 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量4 μL。

1.5.2 質(zhì)譜條件

LIT 和三重四極桿（QQQ）掃描是在三重四極桿線性離子阱質(zhì)譜儀（Q TRAP），AB4500 Q TRAP UPLC/MS/MS系統(tǒng)上獲得的，該系統(tǒng)配備了ESI Turbo離子噴霧接口，可由Analyst 1.6.3 軟件（AB Sciex）控制運(yùn)行正負(fù)兩種離子模式。ESI 源操作參數(shù)如下：離子源，渦輪噴霧；源溫度550 ℃；離子噴霧電壓（IS）5500 V（正離子模式）/-4500 V（負(fù)離子模式）；離子源氣體I（GSI），氣體II（GSII）和簾氣（CUR）分別設(shè)置為50、60 和25.0 psi，碰撞誘導(dǎo)電離參數(shù)設(shè)置為高。在QQQ 和LIT 模式下分別用10 和100 μmol/L聚丙二醇溶液進(jìn)行儀器調(diào)諧和質(zhì)量校準(zhǔn)。QQQ 掃描使用MRM 模式，并將碰撞氣體（氮?dú)猓┰O(shè)置為中等。通過(guò)進(jìn)一步的DP 和CE 優(yōu)化，完成了各個(gè)MRM 離子對(duì)的DP 和CE。根據(jù)每個(gè)時(shí)期內(nèi)洗脫的代謝物，在每個(gè)時(shí)期監(jiān)測(cè)一組特定的MRM 離子對(duì)。

1.6 代謝物定性定量原理

利用數(shù)據(jù)庫(kù)MWDB（metware database），使用二級(jí)譜信息對(duì)化合物定性，在分析時(shí)過(guò)濾掉同位素信息，其中包括K+離子、Na+離子、NH4+離子的重疊信息，還有本身為其他更大分子量化合物的碎片分子的重疊信息。

本研究采用了三重四級(jí)桿質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）對(duì)代謝物進(jìn)行定量分析。MRM 模式中，四級(jí)桿先檢測(cè)目標(biāo)物的前體分子（母離子），再剔除掉與其他分子量物質(zhì)對(duì)應(yīng)的分子以初步排除干擾;而前體分子在經(jīng)碰撞室的誘導(dǎo)電離后斷裂產(chǎn)生了很多碎片離子碎片離子再通過(guò)三重四級(jí)桿過(guò)濾選擇出所需要的一個(gè)特征碎片離子，排除非目標(biāo)離子干擾，使定量更為精準(zhǔn)，獲得更好的重復(fù)性。最后將得到的各個(gè)樣本的代謝物質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)進(jìn)行所有質(zhì)譜峰的峰面積積分，并完成質(zhì)譜峰的校正。

2 結(jié)果與分析

2.1 代謝物定性定量分析

利用軟件Analyst 1.6.3 處理質(zhì)譜數(shù)據(jù)。下圖所示為混樣質(zhì)控QC 樣本的總離子流圖（Total ions current，TIC，即每個(gè)時(shí)間點(diǎn)質(zhì)譜圖中所有離子的強(qiáng)度加和后連續(xù)描繪得到的圖譜）及MRM 代謝物檢測(cè)多峰圖（多物質(zhì)提取的離子流譜圖，XIC），橫坐標(biāo)為代謝物檢測(cè)的保留時(shí)間（Retention time，Rt），縱坐標(biāo)為離子檢測(cè)的離子流強(qiáng)度（強(qiáng)度單位為cps，count per second）。結(jié)果見(jiàn)圖2 和圖3。

基于數(shù)據(jù)庫(kù)MWDB（metware database），對(duì)樣本的代謝物進(jìn)行了質(zhì)譜定性定量分析。圖中多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式MRM 代謝物檢測(cè)多峰圖展示了樣本中能夠檢測(cè)到的物質(zhì)，每個(gè)不同顏色的質(zhì)譜峰代表檢測(cè)到的一個(gè)代謝物。通過(guò)三重四級(jí)桿篩選出每個(gè)物質(zhì)的特征離子，在檢測(cè)器中獲得特征離子的信號(hào)強(qiáng)度（CPS），用Multia Quant 軟件打開(kāi)樣本下機(jī)質(zhì)譜文件，進(jìn)行色譜峰的積分和校正工作，每個(gè)色譜峰的峰面積（Area）代表對(duì)應(yīng)物質(zhì)的相對(duì)含量，最后導(dǎo)出所有色譜峰面積積分?jǐn)?shù)據(jù)保存。為了比較所有檢測(cè)到的代謝物中每個(gè)代謝物在不同樣本中的物質(zhì)含量差異，根據(jù)代謝物保留時(shí)間與峰型的信息，對(duì)每個(gè)代謝物在不同樣本中檢測(cè)到的質(zhì)譜峰進(jìn)行校正，以確保定性定量的準(zhǔn)確。圖4 展示了隨機(jī)抽取的代謝物在不同樣本中的定量分析積分校正結(jié)果，橫坐標(biāo)為代謝物檢測(cè)的保留時(shí)間（min），縱坐標(biāo)為某代謝物離子檢測(cè)的離子流強(qiáng)度（cps）。

2.2 代謝物的定性定量分析-QC

質(zhì)控樣本（QC）由樣本提取物混合制備而成，用于分析樣本在相同的處理方法下的重復(fù)性。在儀器分析的過(guò)程中，每10 個(gè)檢測(cè)分析樣本中插入一個(gè)質(zhì)控樣本，以監(jiān)測(cè)分析過(guò)程的重復(fù)性。QC 樣本質(zhì)譜檢測(cè)的正負(fù)離子模式的TIC 重疊圖如圖5 和圖6 所示，橫坐標(biāo)表示代謝物檢測(cè)的保留時(shí)間，縱坐標(biāo)表示離子檢測(cè)的離子流強(qiáng)度。結(jié)果表明質(zhì)控樣本（QC）TIC 重疊圖中曲線的重疊性高，無(wú)干擾信號(hào)，儀器具有較高的穩(wěn)定性，檢測(cè)結(jié)果可靠。

2.3 主成分分析-PCA

PCA 可了解不同樣品間的變異度大小，PCA Plot不同樣品間代謝物的分離趨勢(shì)。主成分分析可解釋變異圖的橫坐標(biāo)表示各個(gè)主成分，縱坐標(biāo)表示可解釋變異，左圖為各個(gè)主成分相加所占的比例圖，累計(jì)可解釋變異，右圖為各個(gè)主成分的方差比例，每一點(diǎn)對(duì)應(yīng)著PC1 至PC5，左圖的PC1 則對(duì)應(yīng)著右圖的PC1，左圖的PC2 縱坐標(biāo)值等于右圖的PC1 貢獻(xiàn)率加上PC2貢獻(xiàn)率，左圖的PC3 縱坐標(biāo)值等于右圖中PC1、PC2和PC3 之和，依次類推，當(dāng)左圖中PC5 對(duì)應(yīng)的縱坐標(biāo)值越接近1，則PCA 的模型越可靠。

樣品B1 和B3，對(duì)應(yīng)的代謝物譜明顯分離，前兩個(gè)主要成分（PC1 和PC2）分別為66.4%和9.71%，PC1 值較大，說(shuō)明B1 和B3 具有較大差異，且圖中PC5 接近于1，且主成分貢獻(xiàn)率PC1＞PC2＞PC3＞PC4＞PC5，說(shuō)明PCA 模型解釋率很好，如圖7 和圖8所示。

2.4 OPLS-DA 分析

利用OPLS-DA 模型分析所得的數(shù)據(jù)，制出樣品B1 和B3 的得分圖，更加清晰地表示B1 和B3 的代謝物差異。在OPLS-DA 得分圖中，橫坐標(biāo)表示預(yù)測(cè)主成分，可以看出重復(fù)樣的差異；縱坐標(biāo)方向表示正交主成分，可看出樣品間的差距。如圖9 所示，B1 和B3 完全分離開(kāi)來(lái)，說(shuō)明OPLS-DA 可以很好地區(qū)分樣品B1 和B3。

OPLS-DA 的S-plot 圖能直觀地展示每個(gè)代謝物的貢獻(xiàn)率，它可以比較直觀地呈現(xiàn)出樣品間的顯著差異代謝物。代謝物在模型中各組樣品分類甄別中的影響強(qiáng)度用VIP 值表示。圖中紅色的點(diǎn)代表顯著差異代謝物，VIP 值大于等于1；綠色的點(diǎn)代表每個(gè)樣品都含有的通用代謝物，VIP 值小于1。如圖10 所示為樣品B1 和B3 的OPLS-Slopt 圖。

2.5 差異代謝物的聚類分析

為找出影響茶葉品質(zhì)比較大的化學(xué)成分，可對(duì)代謝物在不同樣本的積累模式進(jìn)行聚類分析。橫向?yàn)闃悠访Q，縱向?yàn)榇x物信息，Group 為分組，不同顏色為相對(duì)含量標(biāo)準(zhǔn)化處理后得到的數(shù)值。如圖11 所示，根據(jù)各樣品差異物的聚類熱圖分析，B1 和B3 對(duì)比有著明確的高表達(dá)或低表達(dá)的區(qū)域。

2.6 差異代謝物的篩選鑒定與分析

鑒于本研究結(jié)果具有生物學(xué)重復(fù)，故選擇FC 和VIP 值相結(jié)合的方法來(lái)選取差異代謝物，并要求同時(shí)符合FC≥2 或FC≤0.5 和VIP≥1 兩個(gè)要求。

火山圖上能夠很直接地看到樣品B1與B3的代謝物差異，圖中的點(diǎn)均有與其一一對(duì)應(yīng)的代謝物。綠色點(diǎn)為下降的差異代謝物，紅色點(diǎn)為上升的差異代謝物，灰色點(diǎn)為區(qū)別較不明顯的代謝物。如圖12 所示，是樣品B1 和B3 的不同代謝物火山示意圖。

樣品B1 共檢測(cè)和定量了798 種代謝物，樣品B3共檢測(cè)和定量了802 種代謝物。如圖12 所示，與B3相比，B1 的代謝產(chǎn)物中有202 種顯著變化的代謝物（SCMs），其中108 種SCMs 的豐度顯著降低，而94種顯著增加。根據(jù)表2，這些SCMs 按照數(shù)量的多少通?？梢苑譃辄S酮、酚酸類、脂質(zhì)、氨基酸及其衍生物、其他類、木脂素和香豆素、有機(jī)酸、生物堿、核苷酸及其衍生物和鞣質(zhì)，差異代謝物的上調(diào)或下調(diào)數(shù)量，展示在圖13 中。

表2 樣品B1 和B3 差異代謝物Table 2 The differential metabolites of sample B1 and B3

2.7 總體的代謝通路分析

差異代謝物在生物體內(nèi)相互作用，如圖14 所示為樣品B1 和B3 的KEGG 差異代謝物分類圖。對(duì)樣品B1 和B3 的路徑分析表明，差異代謝物在49 條KEGG通路中富集，大多數(shù)已經(jīng)鑒定的差異代謝物存在于苯丙烷類生物合成、苯丙氨酸代謝、類黃酮的生物合成、黃酮及黃酮醇的生物合成及氨基酸的生物合成等途徑中。

3 討論

劉海燕等[15]概述了黃酮具有很強(qiáng)的抗氧化效果，可將體內(nèi)的自由基清除，減緩細(xì)胞的退化，達(dá)到抗衰老的作用。黃酮有著很多的保健功效，可降膽固醇，抗病毒，增強(qiáng)免疫力等。因此，黃酮對(duì)茶葉非常的重要。在本研究實(shí)驗(yàn)中，品種1（桃形葉）共檢測(cè)到209種黃酮類物質(zhì)，品種3（云瑰）共檢測(cè)到211 種黃酮類物質(zhì)。其中品種1（桃形葉）與品種3（云瑰）相比，有37 種黃酮類物質(zhì)是含量較多的，有54 種黃酮類物質(zhì)是含量較少的。從黃酮對(duì)茶葉的影響來(lái)看，品種3（云瑰）制茶的品質(zhì)較好。

龔雨順等[16]認(rèn)為茶葉中酚酸主要有沒(méi)食子酸、鞣花酸、咖啡酸、間雙沒(méi)食子酸、對(duì)香豆酸、茶沒(méi)食子素、對(duì)香豆酰-3-奎尼酸，它們的生物活性對(duì)茶葉非常的重要，同時(shí)也有著非常高的生物利用度。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，品種1（桃形葉）共檢測(cè)到130 種酚酸類物質(zhì)，品種3（云瑰）共檢測(cè)到131 種酚酸類物質(zhì)，其中品種1（桃形葉）與品種3（云瑰）相比，有11 種酚酸類物質(zhì)是含量較多的，有25 種酚酸類物質(zhì)是含量較少的。因此，品種3（云瑰）的酚酸類含量較高，品質(zhì)較好。

趙燕妮等[17]利用脂質(zhì)組學(xué)的方法對(duì)黑茶和杜仲葉生殖生長(zhǎng)的不同階段內(nèi)含脂類成分的變化規(guī)律進(jìn)行研究，指出脂類物質(zhì)對(duì)茯茶香氣的形成有著積極的作用，其理論依據(jù)對(duì)茯茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展和品質(zhì)改善有著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，品種1（桃形葉）與品種3（云瑰）都檢測(cè)到93 種酚酸類物質(zhì)，其中品種1（桃形葉）與品種3（云瑰）相比，有20 種酚酸類物質(zhì)是含量較多的。所以品種1（桃形葉）比品種3（云瑰）在酚酸類物質(zhì)的含量上更有優(yōu)勢(shì)，對(duì)茶葉香氣等品質(zhì)的形成更有幫助。

黃秀瓊[18]研究表明，春季黃金茶1 號(hào)比春季適制綠茶的品種碧香早氨基酸要高，更適合制綠茶，說(shuō)明氨基酸與茶葉的適制性密切相關(guān)。通過(guò)代謝組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)品種1（桃形葉）與品種3（云瑰）都檢測(cè)到83種氨基酸及其衍生物，其中品種1（桃形葉）與品種3（云瑰）相比，有6 種氨基酸及其衍生物是含量較多的，有7 種氨基酸及其衍生物是含量較少的。故品種1（桃形葉）與品種3（云瑰）二者之間的氨基酸及其衍生物的含量差別不大，從氨基酸及其衍生物的含量方面分析不能很好地比較茶葉的適制性。

王春波等[19]利用代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)不同產(chǎn)地都勻毛尖茶的代謝差異進(jìn)行了分析，鑒定出咖啡堿在小圍寨團(tuán)山產(chǎn)地的樣品中含量最高，可作為區(qū)分都勻毛尖茶產(chǎn)地的科學(xué)依據(jù)，同時(shí)也指出咖啡堿對(duì)茶湯的爽口感起著積極的作用，能與茶湯中的兒茶素等物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，進(jìn)而改變茶湯的滋味。本實(shí)驗(yàn)研究同樣通過(guò)代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)不同品種的普洱茶進(jìn)行分析，結(jié)果表明品種1（桃形葉）與品種3（云瑰）的咖啡堿含量差異不明顯。故品種1（桃形葉）與品種3（云瑰）對(duì)茶湯滋味的影響程度不能很好的區(qū)分。

4 結(jié)論

中國(guó)制茶有著悠久的歷史，隨著市場(chǎng)的不斷發(fā)展，制茶工藝也在不斷的改進(jìn)，茶葉品質(zhì)也在不斷地符合人們的不同需求。影響茶葉品質(zhì)的主要因素有茶葉的內(nèi)含物、采摘季節(jié)、加工工藝和儲(chǔ)存方式等，其中茶葉的內(nèi)含物對(duì)茶葉不同品質(zhì)的形成影響最大。本研究采用代謝組學(xué)技術(shù)分析了兩個(gè)不同品種的普洱茶代謝物差異，結(jié)果表明，品種1（桃形葉）共檢測(cè)和定量了798 種代謝物，品種3（云瑰）共檢測(cè)和定量了802種代謝物，二者之間有202 種顯著變化的代謝物（SCMs），品種1（桃形葉）較品種3（云瑰）有108種SCMs 的豐度顯著降低，而有94 種顯著增加。這些SCMs 按照數(shù)量的多少通?？梢苑譃辄S酮、酚酸類、脂質(zhì)、氨基酸及其衍生物、其他類、木脂素和香豆素、有機(jī)酸、生物堿、核苷酸及其衍生物和鞣質(zhì)。且差異代謝物在49 條KEGG 通路中富集，大多數(shù)已經(jīng)鑒定的差異代謝物存在于苯丙烷類生物合成、苯丙氨酸代謝、類黃酮的生物合成、黃酮及黃酮醇的生物合成及氨基酸的生物合成等途徑中。這些代謝物的數(shù)量和差異分析可為人們根據(jù)不同的需求而選擇不同的茶葉品種進(jìn)行制茶和品質(zhì)控制提供理論依據(jù)和科學(xué)指導(dǎo)。