王琦，蒙麗丹，田潤(rùn)，王淑培，謝彩鋒,3，杭方學(xué),3，李凱,3*

（1.廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院，廣西南寧 530004）

（2.南寧師范大學(xué)環(huán)境與生命科學(xué)學(xué)院，廣西南寧 530001）

（3.糖業(yè)及綜合利用教育部工程研究中心，廣西制糖協(xié)會(huì)，廣西南寧 530004）

甘蔗是許多國(guó)家重要的農(nóng)業(yè)作物之一，目前主要用于蔗糖、燃料酒精生產(chǎn)[1,2]。事實(shí)上，甘蔗除了含有蔗糖與還原糖，還含有豐富的多糖、蛋白質(zhì)、氨基酸、必需微量元素、維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及有機(jī)酸、多酚等活性物質(zhì)，且口感清甜爽口，深受消費(fèi)者喜愛，應(yīng)用于飲料行業(yè)具有巨大的市場(chǎng)潛力。目前市場(chǎng)上甘蔗基飲料種類繁多，主要為甘蔗原汁、甘蔗原汁復(fù)配飲料及甘蔗濃縮汁加工的飲料等[3]。

然而，甘蔗基飲料在貯藏和商品流通過程易產(chǎn)生后混濁現(xiàn)象，影響了其飲料開發(fā)的感官價(jià)值。目前普遍認(rèn)為飲料產(chǎn)生后混濁主要原因是蛋白質(zhì)和多酚發(fā)生相互作用，形成肉眼可見的聚集物[4-7]，雖然不影響飲料的食用安全，但會(huì)影響消費(fèi)者的接受度，進(jìn)而不利于其市場(chǎng)的開拓。因此研究甘蔗原汁后混濁主要成分及后混濁作用機(jī)制對(duì)有效控制其后混濁問題是至關(guān)重要的[8-10]。近些年，大量研究發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)是導(dǎo)致飲料發(fā)生后混濁的重要原因，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度達(dá)到3～4 mg/L時(shí)，飲料就容易產(chǎn)生混濁或沉淀[11,12]。Zeng 等[13]研究?jī)?chǔ)藏過程荔枝汁成分變化，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)和酚類含量在上清液中下降最為明顯，在后混濁物則呈上升趨勢(shì)；Millet 等[9]發(fā)現(xiàn)蘋果基飲料混濁物的蛋白質(zhì)含量占混濁物的18%～24%。目前關(guān)于飲料后混濁的研究主要集中在葡萄酒、蘋果汁、啤酒、荔枝汁和茶等飲料[14-18]，而這些飲料在成分、含量及性質(zhì)上，與甘蔗原汁存在明顯差異，特別是在蛋白質(zhì)、多酚、多糖等易導(dǎo)致后混濁物質(zhì)的含量、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)上，因此其在貯存或流通過程發(fā)生的后混濁作用與其他飲料體系的可能不完全一樣。目前對(duì)于甘蔗原汁后混濁問題的研究，除了本研究團(tuán)隊(duì)前期分析了甘蔗濃縮汁中的后混濁物主要成分外[2]，尚未見有任何報(bào)道。因此本試驗(yàn)在分析甘蔗原汁后混濁主要成分基礎(chǔ)上，重點(diǎn)分析其蛋白質(zhì)的組分及二級(jí)結(jié)構(gòu)，以鑒別出易發(fā)生后混濁的蛋白質(zhì)種類及結(jié)構(gòu)特性，為解決甘蔗原汁后混濁問題提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甘蔗，廣西扶綏市甘蔗雙高基地提供，經(jīng)小型壓榨機(jī)榨汁后用有50 nm 孔徑的陶瓷膜過濾處理，獲得甘蔗清汁，置于-18 ℃冷庫(kù)中保存?zhèn)溆谩?/p>

硫酸銨、鹽酸、硫酸、氫氧化鈉、硫酸鉀、硫酸銅、甲醇和冰醋酸，成都市科龍化學(xué)品有限公司；SDS-PAGE 變性丙烯酰胺凝膠快速制備試劑盒、透析袋（3500 ku）和甘氨酸，索萊寶生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

YY-T1-10L 超純水儀，成都優(yōu)越科技有限公司；TLE-204E 分析天平，梅特勒-托利多中國(guó)有限公司；A-5082 Grodig 連續(xù)波長(zhǎng)多功能微孔檢測(cè)器，奧地利Untersbergstr.1A 公司；Mini-Protein3Cell 蛋白質(zhì)電泳系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad 公司；Orbitrap Elite 組合式質(zhì)譜，美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司；KjelMaster K-375凱氏定氮儀，德國(guó)Bruker 公司；IRTracer-100 傅立葉紅外光譜，日本島津公司；Gel Doc2000 凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad 公司；CenLee18R 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，湖南湘立科學(xué)儀器有限公司；L-8900 氨基酸分析儀，日本日立公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 甘蔗原汁后混濁物的收集

甘蔗汁置于-18 ℃儲(chǔ)藏6 個(gè)月，常溫解凍后經(jīng)8000 r/min 離心15 min，分離上清液和沉淀，超純水水洗沉淀，去除可溶性物質(zhì)，冷凍干燥48 h，獲得凍干粉末[9]，-18 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 后混濁物主要成分的測(cè)定

1.3.2.1 總糖的測(cè)定

稱量20 mg 沉淀物，用2 mol/L 的三氟乙酸水解沉淀中的糖，采用蒽酮硫酸法測(cè)總糖[19]。

1.3.2.2 總酚的測(cè)定沉淀中總酚的提取參考Mane 等[20]方法并作出一些修改。將2 mL 0.05%（V/V）三氟乙酸酸化的丙酮/水/甲醇混合溶液（51:34:15，V/V/V）加入到10 mg混濁物中，超聲提?。?50 W，90 min）后，離心，取上清液。采用Folin-Ciocalteu 法測(cè)定混濁物的總酚含量。

1.3.2.3 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

蛋白質(zhì)含量采用凱氏定氮法測(cè)定[21]。

1.3.2.4 灰分的測(cè)定

灰分測(cè)定采用灼燒法[22]。

1.3.3 甘蔗原汁上清液蛋白質(zhì)的收集

采用鹽析法收集甘蔗汁上清液中的蛋白質(zhì)[23]。具體操作為：在上清液中加入硫酸銨至80%飽和度，磁力攪拌至硫酸銨完全溶解，于4 ℃靜置3 h，離心分離（8000 r/min，4 ℃，15 min），收集沉淀，并將其置于超純水中透析48 h 去除鹽類及小分子雜質(zhì)，期間每12 h 更換一次水。將透析袋中樣品凍干，并置于-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 SDS-PAGE 凝膠電泳分析

SDS-PAGE 參考Lin 等[24]的方法并作出一些修改。將10 mg 上清液蛋白質(zhì)和后混濁蛋白質(zhì)復(fù)溶在8 mol/L 尿素中，在渦旋振蕩器上混勻，取上清20 μL與等量的上樣緩沖液混合均勻，煮沸5 min 后，離心，取上清液上樣。

電泳條件如下：濃縮膠和分離膠的濃度分別為5%和15%，上樣量30 μL，濃縮膠電壓80 V，持續(xù)30 min；分離膠電壓120 V 至當(dāng)樣品條帶遷移至凝膠底部時(shí)電泳結(jié)束。使用0.125%的考馬斯亮藍(lán)R250 溶液（甲醇:冰醋酸:水=3:1:6）對(duì)膠進(jìn)行染色，隨后用脫色液將膠的背景脫至無色，并使用凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.3.5 酶解及質(zhì)譜鑒定

將電泳條帶均勻切成小份,膠內(nèi)酶解參照Shevchenko[25]的方法。將膠條顆粒漂洗、褪色、脫水及還原烷基化處理后，按1:50 比例用胰蛋白酶酶解過夜，最后用LTQ Orbitrap Elite 組合式質(zhì)譜對(duì)酶解的肽段進(jìn)行分析。得到的質(zhì)譜圖用Proteome Discoverer 1.3軟件通過SEQUEST 算法比對(duì)Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行蛋白質(zhì)搜索。

1.3.6 甘蔗原汁后混濁物蛋白質(zhì)氨基酸組成分析

采用氨基酸分析儀分析蛋白質(zhì)的氨基酸組成[26,27]。具體操作為：取30 mg 蛋白樣品于具塞水解管內(nèi)，添加10 mL 6 mol/L HCl 置于110 ℃烘箱水解22 h，期間間斷性搖勻水解液，使樣品充分水解。水解完畢后冷卻過濾，取1 mL 濾液于60 ℃水浴蒸干，復(fù)蒸一次后，用0.02 mol/L HCl 沖洗蒸干物并定容至10 mL，過膜，氨基酸分析儀分析。

1.3.7 蛋白質(zhì)平均疏水性分析

甘蔗原汁上清液蛋白質(zhì)和后混濁蛋白質(zhì)的平均疏水性經(jīng)驗(yàn)計(jì)算公式如下[28]：

式中：

Xi——氨基酸占樣品中所有氨基酸的摩爾比例；

Hφi——氨基酸的疏水值。

1.3.8 傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）的測(cè)定

按照參考文獻(xiàn)[29,30]的方法對(duì)冷凍干燥后的蛋白質(zhì)進(jìn)行FT-IR 測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用SPSS 23.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（p＜0.05），利用Origin 2017 軟件作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 后混濁物主要成分的分析

甘蔗原汁后混濁物的主要成分如圖1 所示，包括蛋白質(zhì)、總糖、總酚和灰分等，表明蛋白質(zhì)、總糖、總酚和灰分都參與了甘蔗原汁后混濁過程。后混濁物中，總糖含量最高，達(dá)60.94%；其次是灰分和蛋白質(zhì)，分別為19.52%和18.43%；總酚含量最少，僅為0.62%。甘蔗原汁后混濁物中總糖含量最高，這可能是由于甘蔗原汁中可溶性糖含量高，在后混濁過程會(huì)有少量被包裹或夾帶在后混濁物中[6]。Belleau 等[31]在研究啤酒混濁物中也發(fā)現(xiàn)高含量的碳水化合物，認(rèn)為它們通過某種方式凝結(jié)或粘附在蛋白質(zhì)-多酚主鏈上而被包裹在后混濁物中的，并不是導(dǎo)致后混濁形成的主要因子，蛋白質(zhì)才是導(dǎo)致飲料混濁的重要因素[32-34]。在飲料中，蛋白質(zhì)能與多酚、多糖、咖啡堿及Ca2+等多種成分發(fā)生相互作用，逐漸聚集形成混濁[35]。

2.2 后混濁蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量分布

甘蔗原汁后混濁蛋白質(zhì)和上清液蛋白質(zhì)的SDS-PAGE 分析見圖2。甘蔗原汁上清液蛋白質(zhì)主要分子質(zhì)量在20 ku，而相應(yīng)后混濁蛋白質(zhì)分子質(zhì)量廣泛分布在42 ku 左右和20 ku 以下。這可能是由于該分子質(zhì)量范圍的蛋白質(zhì)容易參與后混濁，也可能是由小分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)聚集形成復(fù)雜的蛋白質(zhì)聚集體。許多針對(duì)果汁和葡萄酒的研究發(fā)現(xiàn)，后混濁物中蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量集中在一定的范圍內(nèi)，它們具有一定的相似性。大麥麥芽汁中混濁蛋白質(zhì)分子質(zhì)量主要集中在25～45 ku 及18.4 ku 兩部分[36]；葡萄酒后混濁蛋白質(zhì)則主要分布在18～26 ku 及41、53 和69 ku 處[11]。無論上清蛋白質(zhì)還是后混濁蛋白質(zhì)分子質(zhì)量均小于100 ku，這可能與甘蔗汁經(jīng)50 nm 陶瓷膜處理有關(guān)，大分子蛋白質(zhì)被截留。

2.3 質(zhì)譜鑒定

為了鑒定后混濁蛋白質(zhì)的種類，對(duì)圖2 的條帶a和b 進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，結(jié)果如表1 所示。條帶a 和b 分別鑒定出44 種和12 種蛋白質(zhì)，表明甘蔗原汁后混濁蛋白質(zhì)種類繁多。這些蛋白質(zhì)的理論等電點(diǎn)大都位于4～6 之間，與甘蔗原汁的初始pH 5.5 左右接近，因此等電點(diǎn)蛋白質(zhì)析出可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)參與后混濁。其中條帶a 豐度較高的幾種蛋白質(zhì)為PREDICTED：

表1 后混濁物蛋白質(zhì)譜鑒定Table 1 Identified haze proteins by LTQ-Orbitrap

續(xù)表1

calmodulin-7 isoform X1、protein Z、PREDICTED：calcium-dependent protein kinase 34 isoform X1，其理論分子量大部分位于15～25 ku 處，與電泳結(jié)果一致，而條帶b 豐度較高的蛋白質(zhì)為protein Z 和hypothetical protein SORBIDRAFT_01g014740，其理論分子量大都位于9～25 ku，明顯小于電泳結(jié)果，這進(jìn)一步證實(shí)了上述條帶b 處的蛋白質(zhì)一部分是由小分子蛋白質(zhì)聚集，最終蛋白質(zhì)呈多聚體形式存在導(dǎo)致其分子質(zhì)量變大。甘蔗原汁后混濁蛋白質(zhì)中鑒定出大量的protein Z。這與Li 等[37]研究啤酒釀造過程后混濁物的主要成分是protein Z 的結(jié)論是一致的。

2.4 氨基酸分析結(jié)果

由表2 可知，上清液蛋白質(zhì)和后混濁蛋白質(zhì)的氨基酸含量分別占樣品干重的19.82%和11.82%，這與凱氏定氮法測(cè)定的相應(yīng)蛋白質(zhì)含量為29.49%和18.43%有一定的差距，說明其中存在一定量的無機(jī)氮。

表2 上清液蛋白質(zhì)和混濁物蛋白質(zhì)的氨基酸組成Table 2 Amino acid composition of supernatant protein and haze protein

按照氨基酸比例計(jì)算，上清液蛋白質(zhì)和后混濁蛋白質(zhì)的氨基酸組成結(jié)果顯示，無論上清液蛋白質(zhì)還是后混濁蛋白質(zhì)，谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸和異亮氨酸含量均較高，說明它們是甘蔗原汁蛋白質(zhì)的主要氨基酸。不同飲料體系中，后混濁蛋白質(zhì)的氨基酸組成各有不同，谷氨酸是蘋果汁后混濁蛋白質(zhì)中的第一或第二組成氨基酸[9]，而在啤酒混濁物中則發(fā)現(xiàn)了高含量的脯氨酸[36]。在蛋白質(zhì)水解過程中，谷氨酰胺和天冬酰胺分別轉(zhuǎn)化為谷氨酸和天冬氨酸，因此他們的含量往往被高估[9]。脯氨酸和半胱氨酸均是疏水性較強(qiáng)的氨基酸，其在后混濁蛋白質(zhì)中的含量分別為上清液蛋白1.44 和1.95 倍。研究表明肽鍵與脯氨酸具有空間位阻，這些蛋白質(zhì)不能自由旋轉(zhuǎn)形成有序螺旋，從而使蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)變得松散無序，疏水位點(diǎn)暴露，易與多酚相互作用形成沉淀[38]。而半胱氨酸含有二硫鍵，貯藏會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)去折疊，使隱藏于分子內(nèi)部的巰基、二硫鍵和疏水基團(tuán)暴露，蛋白質(zhì)間的相互作用增強(qiáng)[39]。上清液蛋白質(zhì)和后混濁蛋白質(zhì)中疏水性氨基酸的比例分別為55.46%和57.13%。根據(jù)Lozano 等[28]經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算后混濁蛋白質(zhì)的平均疏水值分別為0.87，比上清液蛋白質(zhì)的平均疏水值高3%。這與黃酒后混濁蛋白質(zhì)的疏水值比上清液蛋白質(zhì)高16.46%有所不同[40]，可能是由于原料不同，后混濁蛋白質(zhì)的性質(zhì)有所不同。上述結(jié)果表明甘蔗原汁后混濁蛋白質(zhì)和上清液蛋白質(zhì)氨基酸的種類和含量差異不明顯，蛋白質(zhì)的低疏水值不是導(dǎo)致甘蔗原汁后混濁的主要因素。

2.5 甘蔗原汁后混濁蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

FT-IR 能夠有效分析食品成分的化學(xué)組成和構(gòu)象結(jié)構(gòu)，是監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)變化的有效工具。常見的二級(jí)結(jié)構(gòu)有α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲等。

由圖3 可以看出，在波段500～1000 cm-1，上清液蛋白質(zhì)的吸光度明顯大于后混濁蛋白質(zhì)，而在酰胺I帶（1600～1700 cm-1）處，卻表現(xiàn)出相反的結(jié)果，相對(duì)于上清液蛋白質(zhì)，后混濁蛋白質(zhì)的吸光度偏向于高波段，說明后混濁蛋白質(zhì)和上清液蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)存在差異。

圖3b 為上清液蛋白質(zhì)和后混濁蛋白質(zhì)在酰胺I帶的二階導(dǎo)數(shù)圖譜，二階導(dǎo)數(shù)圖譜顯示上清液蛋白質(zhì)具有5 個(gè)明顯的峰，而后混濁蛋白質(zhì)則具有7 個(gè)峰。對(duì)酰胺I 帶原始譜圖（圖3a）分峰擬合，各峰所對(duì)應(yīng)的結(jié)構(gòu)如表3 所示。

表3 傅立葉紅外光譜擬合圖譜分析Table 3 Fitting analysis of FT-IR spectra

由表4 可知，后混濁蛋白質(zhì)和上清液蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成存在顯著的差異，其中后混濁蛋白質(zhì)中無規(guī)卷曲的含量為21.66%，而上清液蛋白質(zhì)則不含無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)，后混濁蛋白質(zhì)的α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角含量分別比上清液蛋白質(zhì)低33.43%和22.42%，β-折疊含量差異不大。研究表明蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)和疏水性存在相關(guān)性，其疏水性與α-螺旋的含量成負(fù)相關(guān)，與β-折疊和無規(guī)卷曲含量呈正相關(guān)[41]。甘蔗汁后混濁蛋白質(zhì)具有高含量的無規(guī)卷曲和低含量的α-螺旋結(jié)構(gòu)，其疏水性更強(qiáng)，蛋白質(zhì)之間以及蛋白質(zhì)與酚類等其他組分相互作用，溶解度降低，從而促進(jìn)甘蔗汁后混濁。此外，陶瓷膜過濾甘蔗汁時(shí)，為了加快過濾速度，往往加熱至90 ℃以增加通量，高溫條件可能破壞了甘蔗汁蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，疏水性殘基暴露，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)疏水性增強(qiáng)，加速混濁和沉淀形成。

表4 甘蔗原汁后混濁蛋白質(zhì)和上清液蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)含量Table 4 Secondary structure of protein composition in the haze protein and the supernatant protein

3 結(jié)論

以甘蔗原汁上清液蛋白質(zhì)為對(duì)照，對(duì)比分析甘蔗原汁后混濁物及其后混濁蛋白質(zhì)的特性，結(jié)果表明：

（1）甘蔗原汁形成沉淀的過程是復(fù)雜的，其后混濁物中主要由蛋白質(zhì)、總糖、總酚和灰分組成。

（2）甘蔗原汁后混濁蛋白質(zhì)分子量主要分布在42 ku 左右和20 ku 以下，分別鑒定出12 種和44 種蛋白質(zhì)，其中豐度較高的幾種蛋白質(zhì)為protein Z，PREDICTED：calmodulin-7 isoform X1，PREDICTED：calcium-dependent protein kinase 34 isoformX1 和hypothetical protein SORBIDRAFT_01g014740。

（3）后混濁蛋白質(zhì)氨基酸的平均疏水值略高于上清液蛋白質(zhì)，表明氨基酸組成的差異不是導(dǎo)致甘蔗汁后混濁的主要原因。兩者的二級(jí)結(jié)構(gòu)差異明顯，后混濁蛋白質(zhì)中具有高含量的無規(guī)卷曲和低含量的α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)。

綜上，分子質(zhì)量大小低于42 ku、疏水值高、α-螺旋含量低和無規(guī)卷曲含量高的蛋白質(zhì)更容易參與甘蔗原汁后混濁。