李雪雯，鄭穗平

（華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510006）

酪氨酸酚裂解酶在高溫下保持良好活性對L-酪氨酸的生產(chǎn)有著重要意義。L-酪氨酸是人和動物生長發(fā)育及新陳代謝中起著重要作用的芳香族氨基酸，在食品、化工和醫(yī)藥行業(yè)中有著重要的應(yīng)用[1]，可以作為食品添加劑、人工飼料使用，L-酪氨酸是L-多巴、黑色素和沙弗拉霉素A 的前體物質(zhì)，其中L-多巴用于治療帕金森病，黑色素有著抗氧化的作用，可以用于化妝和醫(yī)藥領(lǐng)域，而沙弗拉霉素A 具有抗腫瘤和抗菌活性的天然產(chǎn)物[2]。在生產(chǎn)上可以用丙酮酸作為原料，通過酪氨酸酚裂解酶催化生產(chǎn)L-酪氨酸。酪氨酸酚裂解酶（TPL，EC4.1.99.2）也稱為β-酪氨酸酶，是依賴于磷酸吡哆醛（PLP）的多功能酶，可以將苯酚、丙酮酸和氨轉(zhuǎn)化成L-酪氨酸[3]。TPL 是一個由兩個大小相同的催化二聚體構(gòu)成的四聚體，每個二聚體由兩個相同的小亞基組成，小亞基中包括了磷酸吡哆醛結(jié)合域（PLP）、N 末端臂和小結(jié)構(gòu)域[2]。TPL 來源廣泛，其中微生物來源的有嗜熱共生菌（Symbiobacterium toebii）[4]、嗜熱共生桿菌（Symbibacterium thermophilum）、弗氏檸檬梭菌（Citrobacter freundii）、具核酸桿菌（Fusobacterium nucleatum）、破傷風(fēng)梭菌（Clostridium tetani）、草生歐文氏菌（Erwinia Herbicola）[5]等。

TPL 的最適反應(yīng)pH 在7～9 之間，屬于中性酶，其反應(yīng)pH 范圍在6～11 之間，反應(yīng)pH 寬度較大；最適反應(yīng)溫度在60～80 ℃之間，屬于耐高溫的酶，反應(yīng)溫度區(qū)間大，在20～90 ℃內(nèi)均能反應(yīng)[6-10]。在非細胞合成體系生產(chǎn)上，可以利用葡萄糖四步合成丙酮酸[11]，再由丙酮酸通過TPL 催化生成L-酪氨酸。由于合成丙酮酸的酶均在高溫下反應(yīng)，能在高溫條件下保持良好穩(wěn)定性的TPL，對高效合成L-酪氨酸有重要意義。選取來源于Symbiobacterium toebii的耐熱酪氨酸酚裂解酶StTPL、來源于Fusobacterium nucleatum的耐熱酪氨酸酚裂解酶FnTPL 和來源于Citrobacter freundii的中溫酪氨酸酚裂解酶CfTPL 開展相關(guān)生物信息學(xué)分析工作，對TPL 熱穩(wěn)定性和序列之間的關(guān)系進行初步探究，為通過蛋白質(zhì)工程提高酪氨酸酚裂解酶熱穩(wěn)定性提供關(guān)鍵位點的參考。

1 實驗方法

1.1 建立進化樹分析

從Brenda 下載已有記錄的酶的數(shù)據(jù)，使用ClustalW 進行多序列比對，再使用Mega 軟件對比對結(jié)果建立進化樹分析。

1.2 一級結(jié)構(gòu)分析

利用 Ex PASy 蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)分析工具ProtParam，分析TPL 的氨基酸組成、分子量、等電點等信息[12]，并用BlastP 把需要比對的序列進行多序列比對。

1.3 疏水性、極性分析和跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測

利用ExPASy 疏水性和極性分析工具Protscale，計算分析蛋白質(zhì)的疏水性和極性。采用了Protacale 網(wǎng)站中的Hphob./Kyte &Doolittle 工具計算TPL 的疏水性分布。通過Protacale 網(wǎng)站中的Polarity/Grantham 計算TPL 的極性分布。采用TMHMM 網(wǎng)站分析TPL 的跨膜結(jié)構(gòu)域。

1.4 二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

二級結(jié)構(gòu)預(yù)測采用蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測網(wǎng)站prabi 來預(yù)測。

1.5 同源建模預(yù)測三級結(jié)構(gòu)

同源模建是常用的預(yù)測蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)方法。根據(jù)序列同源性可以分成不同的蛋白質(zhì)家族。如果一個蛋白質(zhì)序列和另一個蛋白質(zhì)序列具有大于30%的同源性，那么這兩個蛋白質(zhì)可能由同一祖先進化而來，稱為同源蛋白質(zhì)。同源蛋白質(zhì)具有相似的結(jié)構(gòu)和功能。利用結(jié)構(gòu)已知的同源蛋白質(zhì)作為模板，建立目標蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)模型，然后用理論計算方法進行優(yōu)化，達到預(yù)測目標蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的目的。首先在SWISS-MODEL上搜索結(jié)構(gòu)已知的與TPL 的相似的序列，接著通過SWISS-MODEL 的自動蛋白質(zhì)同源建模服務(wù)器構(gòu)建TPL 的模型，再使用拉氏圖進行模型評估。

1.6 模型比對

使用MUSCLE 工具對StTPL、FnTPL 和CfTPL進行多序列比對、使用PDBeFold 對建立好的三個模型進行結(jié)構(gòu)比對。使用Pymol 標記StTPL、FnTPL 和CfTPL 三個模型中的脯氨酸在二級結(jié)構(gòu)的位置。

2 結(jié)果與討論

2.1 TPL 多序列比較的進化樹結(jié)果

StTPL 最適反應(yīng)溫度為80 ℃[4]，F(xiàn)nTPL 最適反應(yīng)溫度為60 ℃[13]，CfTPL 最適反應(yīng)溫度為45 ℃[14]。從圖1 中看出StTPL（Q0889）和另一株耐熱菌的酶（O0850）親緣關(guān)系最近，而CfTPL 則和StTPL 親緣關(guān)系較遠，與FnTPL 親緣關(guān)系較近。

表1 StTPL、FnTPL 和CfTPL 氨基酸組成Table 1 Amino acid composition of StTPL,FnTPL and CfTPL

2.2 StTPL、FnTPL 和CfTPL 生物信息學(xué)分析結(jié)果

利用ExPASy 數(shù)據(jù)庫的蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)分析工具ProtParam 分析得到StTPL 的分子量為52198.83 u、由458 個氨基酸組成、等電點（pI）為6.26，其中帶負電荷的氨基酸（Asp+Glu）數(shù)量為61 個，帶正電荷的氨基酸（Arg+Lys）為54 個；FnTPL 的分子量為52156.02 u、由460 個氨基酸組成、等電點（pI）為6.53，其中帶負電荷的氨基酸（Asp+Glu）數(shù)量為65 個，帶正電荷的氨基酸（Arg+Lys）為52 個；CfTPL 的分子量為51441.83 u、由456 個氨基酸組成、等電點（pI）為6.00，其中帶負電荷的氨基酸（Asp+Glu）數(shù)量為61 個，帶正電荷的氨基酸（Arg+Lys）為53 個。StTPL、FnTPL和CfTPL 氨基酸組成成分如表格1 所示。

StTPL、FnTPL 和CfTPL 的疏水性和極性分布結(jié)果如圖2 所示，結(jié)果顯示StTPL、FnTPL 和CfTPL 中并沒有顯著的疏水性或極性區(qū)域。TMHMM 預(yù)測的StTPL、FnTPL 和CfTPL 跨膜區(qū)域如圖3 所示，結(jié)果顯示StTPL、FnTPL 和CfTPL 沒有跨膜區(qū)域。

StTPL、FnTPL 和CfTPL 的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果如圖4。StTPL 的各種二級結(jié)構(gòu)Helix（H）、β-Sheet（E）、Turn（T）和Coil（C）的比例為：40.39%、16.81%、8.30%和34.50%；FnTPL 的各種二級結(jié)構(gòu)Helix（H）、β-Sheet（E）、Turn（T）和Coil（C）的比例為：41.30%、16.74%、8.26%和33.70%；CfTPL 的各種二級結(jié)構(gòu)Helix（H）、β-Sheet（E）、Turn（T）和Coil（C）的比例為：42.98%、16.23%，7.68%和33.11%。與CfTPL相比，StTPL 和FnTPL 的螺旋百分比減少，β-折疊和轉(zhuǎn)角的百分比增加，增加的β-折疊和轉(zhuǎn)角二級結(jié)構(gòu)在蛋白質(zhì)的構(gòu)象穩(wěn)定性中起重要作用[15]。

使用SWISS-MODE 搜索模板對StTPL、FnTPL和CfTPL 同源建模，結(jié)果顯示PDB ID 為6mls 的蛋白適合作為模板，6mls 與StTPL 的相似性為62.94%，與FnTPL 相似性為81.84%，與CfTPL 的相似性為62.72%，均大于30%，適合用當(dāng)模板進行同源建模。圖5 為StTPL、FnTPL 和CfTPL 建模后的結(jié)構(gòu)和模型的拉氏圖評價。

GMQE 接近1，QMEAN 接近0，說明模型質(zhì)量較好。理想情況下拉氏圖評估中 Ramachandran Facoured 區(qū)域＞98%，Ramachandran Qutliers 區(qū)域＜0.20%，Rotamer Outliers 區(qū)域＜1.00%。由此看出兩個模型效果良好，若要進行突變或結(jié)構(gòu)分析，需進行進一步的優(yōu)化。

表2 StTPL、FnTPL 和CfTPL 模型評估Table 2 Model evaluation of StTPL,FnTPL and CfTPL

2.3 StTPL、FnTPL 與CfTPL 的生物信息學(xué)比較

把中溫酶CfTPL 和耐熱酶FnTPL、StTPL 進行多序列比對，結(jié)果如圖6 所示；序列比對結(jié)果和結(jié)構(gòu)比對RMSD 結(jié)果如圖7 所示。

根據(jù)Vieillec 等[16]的研究，嗜熱酶和嗜溫酶具有許多共同點：(1)序列有40%～85%相似性；(2)立體結(jié)構(gòu)的可迭合性（superposable）；(3)相同的催化機制,并且嗜熱酶都能在嗜溫菌中表達而性質(zhì)不變，說明熱穩(wěn)定性是其內(nèi)在本質(zhì)。三個來源不同的TPL 序列相似度在60%～85%，符合序列相似度的共同點；RMSD 是測量某部分特定原子相對于一參考結(jié)構(gòu)的坐標偏差,最完美的重合時則RMSD 為0.0，結(jié)果顯示兩兩比對的結(jié)果接近0，模型大部分能重合。

同源性較高的蛋白質(zhì)卻有著天壤之別的性質(zhì)，是由于某些關(guān)鍵氨基酸殘基的差異造成的。脯氨酸殘基在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)以及熱穩(wěn)定性中具有特殊作用，它十分偏愛β轉(zhuǎn)折或無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)，而很少出現(xiàn)在α螺旋和β折疊中，脯氨酸比其它氨基酸更適合位于β轉(zhuǎn)折的第二位點或無規(guī)卷曲的拐角處，它能使肽鏈顧家更容易與其他專輯氨基酸的極性側(cè)鏈形成氫鍵，降低肽鏈骨架的柔性從而使結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，且脯氨酸疏水側(cè)鏈與鄰近洞穴相互作用，使得疏水基團包裹的β轉(zhuǎn)折和無規(guī)卷曲各種鍵合更牢固，增強穩(wěn)定性，因此在β轉(zhuǎn)折中的脯氨酸能改善熱穩(wěn)定性[17]。使用Pymol 繪制蛋白結(jié)構(gòu)并標記CtTPL、FnTPL 和StTPL 中所有脯氨酸的位置發(fā)現(xiàn)，大部分的脯氨酸位于無規(guī)卷曲的拐角處，而CtTPL 有一個脯氨酸Pro95 位于β轉(zhuǎn)折中，F(xiàn)nTPL中有兩個脯氨酸位于β轉(zhuǎn)折中，分別是Ppro96 和Pro121，在StTPL 中位于β轉(zhuǎn)折中的脯氨酸多達4 個，分別是Pro16、Pro96、Pro119 和Pro456。通過Suzuki等比較了5 種1.6-寡葡糖苷酶的序列發(fā)現(xiàn)當(dāng)酶的熱穩(wěn)定性呈線性升高時，它們序列中脯氨酸含量呈線性增長，結(jié)果結(jié)構(gòu)中的α-螺旋含量下降，β-折疊和回折結(jié)構(gòu)的含量幾乎不變，但參與疏水作用的氨基酸數(shù)量增加，加強了酶的疏水核心作用。從一級結(jié)構(gòu)比對看出，CfTPL 的脯氨酸摩爾百分比為2.85%，F(xiàn)nTPL 的脯氨酸摩爾百分比為3.70%，StTPL 的脯氨酸摩爾百分比5.02%，隨著最適反應(yīng)的升高，脯氨酸含量升高，StTPL的脯氨酸摩爾百分比較高，與已報道的文獻符合。從二級結(jié)構(gòu)比對看，與CfTPL 相比，F(xiàn)nTPL 和StTPL的螺旋百分比減少，β-折疊和轉(zhuǎn)角的百分比增多，而增加的β-折疊和轉(zhuǎn)角二級結(jié)構(gòu)在蛋白質(zhì)的構(gòu)象穩(wěn)定性中起重要作用。以上數(shù)據(jù)能印證耐熱酶StTPL、FnTPL和中溫酶CfTPL 在序列中的差異導(dǎo)致熱穩(wěn)定性有所不同。

把StTPL、FnTPL、CfTPL 的模型疊加比對，根據(jù)Han 等[11]的研究，對CfTPL 的Glu313 位點進行突變，把Glu313 突變成Trp313 和Met313 后熱穩(wěn)定性提高，CfTPL，E313W 和E313M 的熔融溫度分別為59.2、63.0、65.9 ℃。如圖8 所示，紅色區(qū)域表示殘基相同且匹配，綠色區(qū)域表示殘基不相同但匹配，灰色區(qū)域表示不匹配，三個TPL 中的309-313 殘基區(qū)域并不能很好重疊，而在309-313 前后的區(qū)域，兩者均能很好重疊，這個現(xiàn)象可能也進一步說明310-313 區(qū)域和TPL 的熱穩(wěn)定性有關(guān)系，也與已報道的文獻結(jié)果相符。

根據(jù)Rha 等[18]的研究，StTPL 中Ala13、Glu83和Thr407 突變?yōu)閂al13、Lys83、Ala407 后熱穩(wěn)定性提高。如圖9 所示比對該殘基附近的區(qū)域發(fā)現(xiàn)，與StTPL 的Ala13 相對應(yīng)的殘基是CfTPL 中的Ser12 和FnTPL 中的Ser15，在結(jié)構(gòu)上并不能很好重合；而StTPL 中的Glu83 附近的區(qū)域殘基83～89，與CfTPL的殘基82～88、FnTPL 的殘基85～91 相對應(yīng)，而這部分區(qū)域差異較大。如圖10 所示，與StTPL 的殘基407對應(yīng)的CfTPL 殘基406 和FnTPL 殘基409 能很好重合，且附近區(qū)域能重合的殘基較多，StTPL 的Thr407突變?yōu)锳la407 后熱穩(wěn)定性提高，如果對CfTPL 和FnTPL 做定點突變提高熱穩(wěn)定性，可以選擇這個區(qū)域的位點進行突變嘗試。

3 結(jié)論

酪氨酸酚裂解酶選取了耐溫酶StTPL、FnTPL 和中溫酶CfTPL 進行比對，結(jié)果顯示CfTPL 則和StTPL親緣關(guān)系較遠，與FnTPL 親緣關(guān)系較近，三者均無明顯極性區(qū)、疏水區(qū)和跨膜區(qū)。從一級結(jié)構(gòu)比對看出，隨著最適反應(yīng)的升高，脯氨酸含量升高，最適反應(yīng)溫度為45 ℃的CfTPL 脯氨酸含量為2.85%，最適反應(yīng)溫度為60 ℃的FnTPL 脯氨酸含量為3.70%，最適反應(yīng)溫度為80 ℃的StTPL 脯氨酸含量為5.02%，而脯氨酸在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)以及熱穩(wěn)定性中具有特殊作用，與已報道的文獻符合。從二級結(jié)構(gòu)比對看，與CfTPL 相比，F(xiàn)nTPL 和StTPL 的螺旋結(jié)構(gòu)百分比減少，β-折疊和轉(zhuǎn)角的百分比增多，分別為23.91%、25.00%和25.51%，而增加的β-折疊和轉(zhuǎn)角二級結(jié)構(gòu)在蛋白質(zhì)的構(gòu)象穩(wěn)定性中起重要作用。以上數(shù)據(jù)能印證耐熱酶StTPL、FnTPL 和中溫酶CfTPL 在序列中的差異導(dǎo)致熱穩(wěn)定性有所不同。三個TPL 的模型疊加比對結(jié)果顯示，310-313 殘基區(qū)域、殘基13、82-88 殘基區(qū)域疊加效果差，313 殘基突變有利于CfTPL 提高熱穩(wěn)定性，StTPL中的Ala13、Glu83 突變有利于StTPL 突變，推測以上殘基區(qū)域和熱穩(wěn)定性相關(guān)，也符合已有文獻報道的情況。此外StTPL 中的Thr407 對熱穩(wěn)定性也有貢獻，若突變CfTPL 或FnTPL 以提升熱穩(wěn)定性，可以考慮選擇407 殘基或附近區(qū)域進行突變嘗試。