陳家明，焦春偉,2，梁慧嘉，鐘靜，謝意珍,2,3*

（1.廣東粵微食用菌技術有限公司，廣東廣州 510663）

（2.廣東粵微生物科技有限公司，廣東肇慶 526000）

（3.廣東省科學院微生物研究所，廣東省菌種保藏與應用重點實驗室，省部共建華南應用微生物國家重點實驗室，廣東省微生物應用新技術公共實驗室，廣東廣州 510070）

中國酒文化歷史悠久，適量飲酒有通風、散寒、舒筋、活血等作用；長期過量飲酒易致骨骼、肌肉疾病及四肢萎縮等病變，更嚴重的會導致酒精性肝臟損害，其表現(xiàn)為漸進性的肝臟脂肪變性，進而引起肝臟炎癥、纖維化或硬化的發(fā)生，甚至惡化成癌癥，嚴重危害人體健康[1-3]。市面上的“解酒藥”主要為西藥和中藥，西藥多是改善乙醇代謝的藥物，不正確使用對身體存在毒副作用[4]；而解酒類中藥以葛根、枳椇子等藥材為主，大多局限于對單一原料的解酒功效研究[5]。目前市面上宣傳有解酒作用的產品，雖然種類繁多，但大多存在作用機制不清晰、解酒效果不明顯等問題。因此，開發(fā)成分安全、功效明確的天然解酒制品，并對其作用效果和作用機制進行探索，具有良好的社會效益和經濟效益。

姜黃植物飲料（以下簡稱“姜黃飲”）由姜黃素、葛根、枳椇子、玉米低聚肽粉等組成，通過小鼠醉酒實驗發(fā)現(xiàn)其具有解酒的功效。姜黃為姜科姜黃屬植物姜黃（Curcuma longaL.）的干燥根莖，主要化學成分為酚類和萜類，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、神經保護、胃腸道保護以及減輕酒精引起的肝損傷等作用[6,7]，其主要活性成分姜黃素通過改善線粒體功能和減輕內質網應激和炎癥來減輕酒精引起的肝損傷[8]。葛根（Puerariae Lobatae Radix）作為我國傳統(tǒng)醫(yī)學中具有代表性的解酒藥材之一，具有解表退熱，生津、透疹、解酒等多種功效，其解酒的主要成分包括葛根素、總黃酮、多糖、多肽、黃豆苷元及其衍生物，具有抑制機體乙醇吸收、加快體內乙醇代謝、抗氧化、保護肝臟、心肌細胞及神經等作用[9,10]。枳椇是鼠李科枳椇屬植物枳椇（Hovenia acerbaLindl）的成熟干燥種子，是傳統(tǒng)常用的解酒護肝中藥，主要包括黃酮、三萜皂苷、苯丙素類以及多糖等成分，具有保肝、解酒、抗腫瘤、抗氧化、降血糖等藥理作用[11,12]，可提高酒后肝臟超氧化物歧化酶（SOD）、乙醇脫氫酶（ADH）、乙醛脫氫酶（ALDH）和微粒體乙醇氧化酶（EO）的活性，并可預防肝纖維化、酒精性和非酒精性脂肪肝[13]。玉米低聚肽是玉米蛋白經酶水解、化學水解或微生物發(fā)酵及特定小肽分離純化技術獲得的小分子多肽，具有抗氧化、抗高血壓、保護肝臟、加快乙醇代謝、抗炎等作用[14]，其解酒機理主要包括激活乙醇代謝途徑中相關的酶、抗氧化、增強肝臟代謝能力，調節(jié)脂質代謝及氧化應激反應，對酒精引起的肝損傷具有保護作用[15,16]。

本文對姜黃飲對KM 小鼠的解酒作用及可能的作用機制進行了研究，以期為新型解酒產品的研發(fā)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

4 周齡雄性 KM 小鼠 48 只（許可證號：SCXK(魯)2014-0007），體重25～28 g，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司。

1.1.2 樣品與試劑

56 °紅星二鍋頭酒，購自北京紅星股份有限公司；ADH 試劑盒、ALDH 試劑盒、輔酶Ⅰ（NAD+）試劑盒、還原性輔酶Ⅰ（NADH）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所；細胞色素P450（CYP2E1）的酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒，購自武漢華美生物工程有限公司；蘇木精-伊紅（HE），購自廣州永津生物科技有限公司；乙醇、甲醛，購自廣州化學試劑廠；磷酸緩沖液（PBS），購自康寧公司；純凈水，購自華潤怡寶飲料（中國）有限公司。

1.1.3 設備

M200 PRO NanoQuant 酶標儀，瑞士Tecan 公司；HM 340E 石蠟切片機、HistoStar 組織包埋機，美國Thermo Scientific 公司；5804R 離心機，德國Eppendorf公司；7890A 氣相色譜儀，美國Agilent Technologies公司；ML-1600 顯微鏡，武漢康濤科技有限公司；ALT 160-4NM 型天平，德國KERN 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 姜黃飲料的制備

將葛根、枳椇子，按料液比1:12，1:10，加水提取兩次，第一次1.5 h，第二次1 h，合并提取液，過濾，濾液經減壓濃縮、離心后加入配方量的姜黃素、玉米低聚肽粉等，攪拌至均勻，即得。分別配置姜黃飲低劑量組（JCL）（固含物0.2 g/mL；姜黃素含量0.92 mg/mL；總黃酮含量3.25 mg/mL），姜黃飲高劑量組（JCH）（固形物含量0.4 g/mL；姜黃素含量1.83 mg/mL；總黃酮含量7.39 mg/mL）。

1.2.2 小鼠防醉實驗

取KM 小鼠48 只，按體重隨機分為4 組，即空白組（C）、模型組（M）、姜黃飲低劑量組（JCL）和姜黃飲高劑量組（JCH），每組12 只。實驗前禁食48 h，自由飲水。實驗開始后，姜黃飲低劑量和高劑量組以0.2 mL/10 g 灌胃，空白組和模型組以同等量水灌胃。30 min 后，除空白組外，各組均以0.15 mL/10 g劑量灌胃紅星二鍋頭酒，分別計時，記錄醉酒潛伏時間（灌酒后到翻正反射消失）和醒酒時間（入睡開始直至翻正反射恢復）。

1.2.3 姜黃飲對醉酒小鼠血液中乙醇濃度的影響采用氣相色譜法[17]測定小鼠血液中乙醇含量色譜條件：安捷倫DB-1701 毛細管柱（(14%-氰丙基-苯基)-甲基聚硅氧烷為固定相，柱長為30 m，內徑0.32 mm，膜厚度為0.25 μm）；進樣口、柱溫箱、檢測器溫度分別為200、90、250 ℃；載氣N2、H2、空氣流速分別為20、30、400 mL/min；FID 檢測器；進樣量：1 μL；分流比為30:1。稱取乙醇（GC＞99.8%）1.0 g，精密稱定，置于50 mL 容量瓶中，加入水溶解并定容至刻度，搖勻，即得儲備液（20 mg/mL）。精密移取儲備液適量，用水分別稀釋成濃度1、2、4、8、10 mg/mL，搖勻，即得工作標準液。以乙醇的峰面積為縱坐標（y），以乙醇質量濃度（mg/mL）為橫坐標（x），繪制標準曲線，計算得回歸方程為y=253.41x+9.0524（R=0.9991）。

1.2.4 姜黃飲對醉酒小鼠肝組織 ADH、ALDH、NAD+、NADH、CYP2E1、GSH-PX的影響

取血后將脫臼處死小鼠，取小鼠肝臟，經冷PBS（4 ℃）洗凈、濾紙吸干水分后，稱取其中的0.1 g加入至預冷的1 mL PBS 中，使用組織搗碎勻漿機制成勻漿，10000 r/min 離心15 min，提取上清液。按各試劑盒說明書操作測定上清液中ADH、ALDH、NAD+、NADH、CYP2E1 和GSH-PX 含量。

1.2.5 胃和十二指腸病理切片的觀察

取小鼠胃和腸組織拍照后經4%甲醛固定，修塊水洗，梯度乙醇溶液脫水至透明，浸蠟包埋，經組織切片機處理后得到厚度約為4 μm 的切片，通過蘇木精-伊紅染色，置于光學顯微鏡下觀察。

1.2.6 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件，實驗數(shù)據(jù)用平均值x±SD 表示，多重組間比較采用One-way Anova。p＜0.05 為有統(tǒng)計學意義，p＜0.01 為有顯著統(tǒng)計學意義，p＜0.001 為有極顯著統(tǒng)計學意義。

2 結果與討論

2.1 小鼠防醉酒實驗結果

空白組小鼠未攝入酒精，行為與正常小鼠無異。由表1 可知，模型組小鼠死亡率和醉酒率分別為41.67%和91.67%，姜黃飲低劑量組小鼠死亡率和醉酒率分別為33.34%和83.34%，高劑量組小鼠死亡率和醉酒率分別為16.67%和66.67%，說明姜黃飲能降低小鼠的醉酒率及醉酒引起的死亡率。模型組小鼠醉酒潛伏期和醒酒時間分別為74.00 min 和420.83 min，姜黃飲低劑量組小鼠醉酒潛伏期和醒酒時間分別為98.25 min 和344.58 min，高劑量組小鼠醉酒潛伏期和醒酒時間分別為235.00 min 和232.00 min。與模型組相比，姜黃飲低、高劑量組均能延長醉酒潛伏期、縮短醒酒時間，其中高劑量組的醉酒潛伏期顯著延長，醒酒時間顯著縮短，具有統(tǒng)計學意義（p＜0.05）。羅安玲等[5]研究發(fā)現(xiàn)葛根、藤茶、玉米低聚肽復合組方能顯著延長小鼠的醉酒時間至55.14 min，縮短醒酒時間至75.88 min，明顯改善醉酒小鼠的行為學指標（p＜0.05）。該結果與本實驗的高劑量組類似，表明姜黃飲高劑量組有明顯的解酒功效。

表1 小鼠的防醉酒實驗結果Table 1 Results of anti-inebriation test in mice

2.2 小鼠血液中乙醇含量結果

各組小鼠經56 °紅星二鍋頭酒灌胃8 h 后，測定血液中乙醇的含量，結果見表2。姜黃飲低、高劑量組小鼠血液乙醇含量分別為6.78 mg/mL 和4.21 mg/mL，與模型組7.29 mg/mL 比較，姜黃飲低、高劑量組均能降低血清乙醇含量，其中高劑量組血清乙醇含量明顯下降，具有顯著統(tǒng)計學意義（p＜0.01）。表明姜黃飲可有效降低飲酒后血液中乙醇含量。何會等[18]研究表明，枳椇子葛根中劑量復方能降低醉酒小鼠血清中的乙醇、乙醛含量，降低醉酒率。姜黃飲解酒機制可能與此研究類似。

表2 小鼠血液中乙醇的含量Table 2 Results of concentration of ethanol in blood of mice

2.3 姜黃飲對小鼠肝組織ADH和ALDH的影響

乙醇通過肝臟的氧化途徑和肝外組織的非氧化途徑進行代謝，其中氧化途徑是最重要的乙醇代謝途徑，包括乙醇脫氫酶系統(tǒng)、肝微粒體乙醇氧化酶系統(tǒng)、過氧化物酶體系。乙醇在ADH、微粒體乙醇氧化系統(tǒng)和過氧化氫酶的作用下氧化為乙醛，乙醛進一步在ALDH 的作用下氧化為乙酸[19,20]。ADH 和ALDH 是酒精代謝過程中的關鍵酶[21]，其活力的變化是評估酒精代謝快慢的重要指標。

如圖1 所示，小鼠攝入乙醇后，會引起機體ADH、ALDH 活力的升高。姜黃飲低、高劑量組小鼠肝臟ADH 活力分別為2.76 U/mg prot 和3.74 U/mg prot。與模型組對比，姜黃飲低、高劑量組均可提高飲酒小鼠肝臟ADH 的活力（p＜0.05），表明姜黃飲各劑量組均能加快乙醇氧化為乙醛的速度，有利于乙醇的代謝。姜黃飲低、高劑量組小鼠肝臟ALDH 活力分別為6.63 U/mg prot 和8.36 U/mg prot。與模型組對比，姜黃飲高劑量組可以提高飲酒小鼠肝臟ALDH 的活力（p＜0.05），表明姜黃飲高劑量組能加快乙醛氧化為乙酸的速度，加速乙醇的代謝。該結果與陶施民等[22]研究結果相同，其研究發(fā)現(xiàn)葛根枳椇子梔子膠囊通過增強肝乙醇代謝關鍵酶ADH和ALDH及抗氧化酶活性，加快酒精在體內代謝的速度。

2.4 姜黃飲對小鼠肝組織NAD+和NADH 的影響

NADH 和NAD+參與許多重要的細胞反應，其在細胞中的水平及比例，決定了細胞反應進行的速度[20]。乙醇在肝臟中氧化代謝過程，ADH 將乙醇氧化成乙醛，同時伴隨著輔酶NAD+還原為NADH 的過程，乙醇氧化會導致細胞質和線粒體中肝臟NADH/NAD+比率顯著增加[23]。

如圖2 所示，模型組NAD+含量為0.12 nmol/mg prot，與空白組相比極顯著增加（p＜0.001），NADH/NAD+的比值顯著降低（p＜0.01）。姜黃飲低、高劑量組NAD+含量分別為0.07 nmol/mg prot 和0.08 nmol/mg prot，與模型組相比顯著降低（p＜0.01）；NADH 含量分別為0.34 nmol/mg prot 和0.39 nmol/mg prot，與模型組相比分別具有統(tǒng)計學意義和顯著提高（p＜0.05，p＜0.01），NADH/NAD+的比值顯著提高（p＜0.01），表明姜黃飲可加速NAD+向NADH 的轉化，加速乙醇的代謝。

2.5 姜黃飲對小鼠肝組織細胞色素P450（CYP2E1）和GSH-PX 的影響

當機體乙醇濃度超過10 mmol/L，乙醇氧化系統(tǒng)被激活成主要的酒精代謝途徑，細胞色素P450（CYP2E1）和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸參與反應，將乙醇轉化為乙醛[24,25]。如圖3 所示，模型組小鼠肝臟CYP2E1 含量為58.11 pg/mg，與空白組相比極顯著降低（p＜0.001），表明乙醇會降低小鼠肝臟CYP2E1的含量。姜黃飲低、高劑量組小鼠肝臟CYP2E1 含量分別為58.89 pg/mg 和78.51 pg/mg，姜黃飲高劑量組與模型組相比小鼠肝臟CYP2E1 含量極顯著提高（p＜0.001）；低劑量組含量雖然沒有顯著升高，但也呈現(xiàn)升高的趨勢，表明姜黃飲可提高肝臟中CYP2E1的含量，加速乙醇代謝，發(fā)揮解酒作用。該結果與鄭連姬等[25]研究結果作用一致，其研究表明魔芋葡甘露聚糖通過提高肝臟中ADH、ALDH、P450 含量，加速乙醇代謝，發(fā)揮其防醉解酒作用。

GSH-PX 是肝臟細胞內主要的水溶性抗脂質過氧化的物質，其含量的高低決定著抗氧化能力的強弱[26]。酒精長期使用者，其肝細胞內GSH-Px 含量會明顯降低甚至耗竭，其中肝臟中GSH-Px 減少在線粒體中最為明顯，從而加劇對線粒體結構和功能的損害[27]。如圖3所示，模型組小鼠肝臟GSH-Px活力為914.5 pg/mg，與空白組相比極顯著降低（p＜0.001），表明乙醇會降低GSH-Px 的活力，機體抗氧化功能減弱。姜黃飲低、高劑量組小鼠肝臟GSH-Px 活力分別為1285.00 pg/mg 和1341.00 pg/mg，與模型組相比極顯著提高（p＜0.001），表明姜黃飲可以增強小鼠肝臟中GSH-PX 的活力，提高其抗氧化能力，減輕乙醇代謝產物對機體的損害。該結果與范土貴等[28]研究結果類似，表明姜黃素超分子包合物通過提高細胞內SOD、GSH-Px 的活力以及降低丙二醛（MDA）和活性氧（ROS）含量來改善乙醇誘導LO2 細胞的損傷。

2.6 姜黃飲對小鼠胃部和小腸的影響

如圖4 所示，與空白組對比，模型組小腸可見明顯的水腫和出血點，十二指腸損傷嚴重。與模型組相比，姜黃飲低、高劑量組小鼠小腸水腫和出血點明顯減少，表明姜黃飲可減輕乙醇對小鼠腸道引起的損傷，減少小鼠腸道出血和水腫。

與空白組對比，模型組小鼠胃部可見明顯的水腫。與模型組相比，姜黃飲低、高劑量組小鼠胃部均未出現(xiàn)水腫。表明姜黃飲對小鼠胃部和腸道有保護作用。

2.7 姜黃飲對小鼠胃部和十二指腸組織結構的影響

如圖5 所示，模型組小鼠的胃粘膜可見明顯的出血、粘膜下水腫，上皮細胞分離、脫落，腺體排列不規(guī)則等現(xiàn)象，而姜黃飲各劑量組均有不同程度的改善，其中姜黃飲高劑量組改善最為明顯。這可能與姜黃飲中的姜黃素的含量有關。該實驗結果與龐曉軍等[29]研究解酒飲對急性胃黏膜損傷小鼠的保護作用相同，表明姜黃飲可以改善乙醇對胃黏膜損傷，具有護胃作用。Alejandra 等[30]發(fā)現(xiàn)姜黃提取物有較強的胃保護作用，提取物中姜黃素含量的變化會影響其在乙醇誘導的損傷大鼠模型中胃潰瘍的預防作用，姜黃素的含量對于增強姜黃提取物的胃保護作用至關重要。

由圖5 可見，模型組小鼠的十二指腸腸絨毛嚴重脫落，腸道機械屏障損傷明顯。姜黃飲各劑量組均有不同程度的改善，其中姜黃飲高劑量組改善最為明顯。表明姜黃飲可保護十二指腸，減輕乙醇對十二指腸的損傷。

3 結論

本研究以自制的姜黃植物飲料，通過構建高濃度酒精致小鼠醉酒模型，以小鼠防醉試驗行為學變化、醉酒小鼠血液乙醇濃度、體內乙醇代謝關鍵酶的含量或活性及胃腸組織變化為指標，評價姜黃飲對小鼠的解酒作用。在姜黃解酒飲的干預下，小鼠醉酒率和醉酒引起的死亡率下降。與模型組相比，姜黃飲高劑量組醉酒潛伏期、縮短醒酒時間顯著延長（p＜0.05），血液乙醇含量極顯著降低（p＜0.01），乙醇脫氫酶、乙醛脫氫酶活力顯著提高（p＜0.05），NADH/NAD+比值極顯著提高（p＜0.01），細胞色素P450、谷胱甘肽過氧化物酶含量極顯著提高（p＜0.01），表明姜黃飲能通過增強ADH、ALDH 活力，提高NADH/NAD+比值，增加CYP2E1 含量從而加快乙醇的代謝，有明顯的解酒作用。通過增強小鼠肝臟中GSH-Px 的活力，提高其的抗氧化能力，減輕乙醇代謝產物對機體的損害。姜黃飲還能明顯減輕乙醇對小鼠腸道引起的損傷，減少小鼠腸道出血和水腫。以上結果表明，姜黃飲具有解酒功效，對肝臟、胃部及十二指腸有保護作用，其作用機制可能與其增強機體乙醇代謝路徑關鍵酶及抗氧化酶的活性，加快體內乙醇代謝速度，保護肝臟及胃腸道有關。