姬妍茹，張正海，楊慶麗，董艷*，滕春波，李國巍，石杰，魏連會，潘靜，高媛

（1.黑龍江省科學(xué)院大慶分院，黑龍江大慶 163319）

（2.東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040）

便秘是一種與腸道菌群密切相關(guān)的胃腸道疾病，臨床表現(xiàn)主要包括排便困難、排便時間長、頻率低，排便時伴有腹脹和腹痛等癥狀[1]。長期便秘會導(dǎo)致患者口干口苦、食欲不振、腹部脹滿、精神狀態(tài)不佳[2]，還會增加過敏性鼻炎、慢性腎臟疾病、靜脈血栓栓塞、胃腸道癌等疾病風(fēng)險[3,4]。在日常生活中，藥物和飲食是緩解便秘的兩種主要方式。由于藥物的副作用，開發(fā)改善便秘的飲食已成為主流趨勢[5,6]。

菊芋（Helianthus tuberosusL.）又名鬼子姜、洋姜，為菊科向日葵屬多年生草本植物，在我國東北大部分地區(qū)、西北和江蘇等沿海省份均有廣泛種植[7]。菊芋塊莖富含多糖，以果聚糖為主，具有調(diào)節(jié)腸道菌群，改善腸道微生態(tài)環(huán)境的功能[8,9]。鮮菊芋不耐貯存，口感較差，通過熱加工可變成略帶甜味的黑菊芋，其多糖組成發(fā)生改變[10]，抗氧化活性顯著增強[11]。前期研究發(fā)現(xiàn)，黑菊芋水提液可以有效促進(jìn)便秘小鼠的腸道蠕動、緩解便秘[12]，但關(guān)于黑菊芋多糖對便秘的影響和調(diào)控機制尚未得到廣泛研究?；诖?，本研究通過復(fù)方地芬諾酯建立便秘小鼠模型，以黑菊芋多糖對便秘小鼠進(jìn)行干預(yù)，利用高通量測序探索其對小鼠便秘癥狀與腸道微生物組成之間的聯(lián)系，以期為黑菊芋的保健功能揭示和加工工藝優(yōu)化提供必要信息。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑菊芋，以“慶芋2 號”菊芋品種為原料，采用變溫發(fā)酵工藝制備，具體方法參考文獻(xiàn)[13]；復(fù)方地芬諾酯（國藥準(zhǔn)字H22022037），長春長紅制藥有限公司；小鼠糞便腸道微生物DNA提取試劑盒，德國QIAGEN公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DS-SONIC-D400 型超聲波清洗機，無錫市鼎實電子科技有限公司；TGL-20M 型臺式高速冷凍離心機，金壇市國旺實驗儀器廠；VFD-4500 型冷凍干燥機，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；Mi Seq 高通量測序系統(tǒng)，美國Illumina 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 黑菊芋多糖的制備

參照文獻(xiàn)[14]方法并優(yōu)化，稱取300 g 黑菊芋，加入1.5 L 蒸餾水浸泡12 h，勻漿后以40 kHz 的頻率超聲30 min，8000 r/min 離心10 min，上清液凍干后用1 L 95%乙醇沉淀多糖，蒸餾水復(fù)溶后依次采用氯仿-正丁醇體積比為5:1 的Sevage 試劑除蛋白，2%的活性炭脫色30 min，離心并凍干，采用苯酚-硫酸法以果糖含量為橫坐標(biāo)，540 nm 下吸光度為縱坐標(biāo)，繪制總糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)線性回歸方程測定多糖含量并計算多糖提取率和純度，計算方法如下：多糖提取率=凍干樣品中多糖質(zhì)量/黑菊芋中多糖質(zhì)量×100%；多糖純度=凍干樣品中多糖質(zhì)量/凍干樣品質(zhì)量×100%。

1.3.2 實驗動物分組及處理

實驗選用雌性SPF 級KM 小鼠，體重20±2 g，購自長春億斯實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（吉）-2018-0007。飼養(yǎng)期間自由獲取食物及飲水。將75 只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d 后，隨機分為5 組，即空白組（CK）、模型組（MC）和2.5、5.0、10.0 g/(kg·bw)的黑菊芋多糖低（BL）、中（BM）、高（BH）劑量組。

MC 組和BL、BM、BH 組采用0.2 mL 復(fù)方地芬諾酯（10 mg/(kg·bw)）誘導(dǎo)小鼠便秘，CK 組給予等量的生理鹽水，1 次/d，持續(xù)14 d。從第8 d 起，給造模藥1 h 后，采用0.2 mL 不同劑量的黑菊芋多糖治療，CK 組和MC 組用等量的生理鹽水代替黑菊芋多糖。

1.3.3 排便實驗

14 d 后，各組小鼠隨機取5 只，禁食16 h 后，除CK 組外其余各組灌胃10 mg/(kg·bw)復(fù)方地芬諾酯。30 min 后，黑菊芋多糖各劑量組分別灌胃0.2 mL 含相應(yīng)受試物的墨汁，CK 組和MC 組給予等量的普通墨汁，記錄小鼠6 h 內(nèi)排出的黑便粒數(shù)。

1.3.4 小腸推進(jìn)實驗

14 d 后，各組小鼠隨機取5 只，前期處理同排便實驗，灌胃含相應(yīng)受試物的墨汁30 min 后脫頸椎處死小鼠，測量小腸全長和小腸自幽門處至墨汁運動前沿的距離，計算墨汁推進(jìn)率。

1.3.5 盲腸內(nèi)容物收集

14 d 后，另取5 只各組剩余小鼠，禁食16 h 后，無菌解剖小鼠，收集盲腸內(nèi)容物于離心管中，液氮迅速冷凍后-80 ℃冰箱保存，用于腸道菌群分析。

1.3.6 16S rDNA 文庫構(gòu)建與高通量測序數(shù)據(jù)分析

利用QIAamp DNA Stool Mini Kit 提取小鼠盲腸微生物總DNA，提取后檢測基因組DNA 的濃度和純度。根據(jù)通用引物擴增細(xì)菌16S rDNA，用于Illumina MiSeq平臺高通量測序。測序送至北京百邁客生物科技有限公司完成，測序區(qū)域為V3～V4 區(qū)，測序引物為338F（5'-ACTCCTACGGGAG-GCAGCAG-3'），806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTA-AT-3'）。采用QIIME軟件中的UCLUST對Tags在97%相似度水平下進(jìn)行操作分類單元（Operational Taxonomic Units，OTU）聚類分析，Greengene 數(shù)據(jù)庫對各OTU 進(jìn)行物種信息注釋。

1.4 統(tǒng)計分析

每組實驗3 次平行，采用SPSS 17.0 軟件單因素方差分析（one-way variance analysis，ANOVA）進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。字母不同代表差異顯著（p＜0.05），字母相同代表差異不顯著（p＞0.05）并利用GraphPad Prism 7繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑菊芋多糖的提取率和純度

采用苯酚-硫酸法測定并繪制果糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。果糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=0.379x+0.093，R2=0.999，方程擬合度較好。

如圖1 所示，每100 g 黑菊芋中多糖含量為26.52 g，制備后的凍干樣品質(zhì)量為20.52 g，凍干樣品中的多糖質(zhì)量為16.96 g。黑菊芋多糖的提取率為63.95%，純度為82.73%。

2.2 黑菊芋多糖對小鼠排便粒數(shù)和腸墨汁推進(jìn)率的影響

圖2 為不同劑量的黑菊芋多糖干預(yù)后，各組小鼠的6 h 內(nèi)黑便粒數(shù)情況。據(jù)報道，復(fù)方地芬諾酯可以減少腸蠕動，延長食物在小腸的停留時間，降低排便次數(shù)[15]。因此，本研究使用復(fù)方地芬諾酯建立便秘小鼠模型。MC 組小鼠排便粒數(shù)明顯低于CK 組（p＜0.05），說明模型建立成功。此外，與MC 組相比，3 組黑菊芋多糖治療組均增加了小鼠6 h 內(nèi)排便頻率，BL、BM、BH 組分別增加48.21%、98.21%、78.57%，其中BM 組與CK 組相比無顯著性差異（p＞0.05）。與黑菊芋多糖類似，在前期相同劑量的黑菊芋水提液對小鼠便秘影響的研究中，與MC 組相比，BL 組小鼠排便粒數(shù)無顯著性差異（p＞0.05），BM、BH 組小鼠黑便粒數(shù)分別增加67.64%和85.29%[12]，提示黑菊芋多糖的通便功效優(yōu)于黑菊芋水提液。

圖3 為不同劑量的黑菊芋多糖干預(yù)后各組小鼠小腸墨汁推進(jìn)率的分析結(jié)果。與CK 組相比，便秘建模顯著降低了小鼠墨汁推進(jìn)率（p＜0.05）。與MC 組相比，所有黑菊芋多糖治療組均增加了小腸墨汁推進(jìn)率（p＜0.05），較MC 組分別提高67.34%%、107.05%、87.08%，而且BM 組和CK 組差異不顯著（p＞0.05），說明中劑量的黑菊芋多糖通便效果最佳。Shan 等[15]同樣以復(fù)方地芬諾酯建立小鼠便秘模型，發(fā)現(xiàn)同屬菊科植物的旋覆花多糖在100 和400 mg/kg 的劑量時能促進(jìn)小鼠腸道蠕動，Jiang 等[16]則證明200 mg/kg 的榴蓮果皮多糖可提高大鼠小腸推進(jìn)率。

2.3 黑菊芋多糖對小鼠腸道細(xì)菌OTU 數(shù)量的影響

如圖4 所示，從OTU 總數(shù)來看，MC 組OTU 數(shù)量為370 個，少于CK 組的376 個，BL、BM、BH 組OTU 數(shù)量分別為378、377 和374 個。5 組共有的OTU數(shù)為308 個，CK 組有而MC 組沒有的OTU 數(shù)為23個，CK 組與BL、BM、BH 組共有但MC 組沒有的OTU 數(shù)量是13 個。提示便秘小鼠的菌群多樣性降低，給予黑菊芋多糖干預(yù)后，小鼠的菌群多樣性得到改善。

2.4 黑菊芋多糖對小鼠腸道菌群Alpha多樣性的影響

由圖5 所示，對小鼠腸道微生物進(jìn)行Alpha 多樣性分析發(fā)現(xiàn)，各樣品曲線趨于平緩，由此可見當(dāng)前測序深度及覆蓋度足夠大。不同劑量黑菊芋多糖干預(yù)14天后，相對豐度曲線在X 軸上的跨度不同，體現(xiàn)出各組間腸道菌群組成可能有較大差異，各組中相對豐度高于10-2的微生物都較少。另一方面，在測序深度相同的情況下，MC 組豐度明顯低于CK 組和BL、BM組樣品，但高于BH 組，表明添加中、低劑量的黑菊芋多糖改善了便秘小鼠菌群的豐富度，而BH 組腸道微生物相對匱乏。

2.5 黑菊芋多糖對小鼠腸道菌群Beta 多樣性的影響

如圖6 所示，Beta 多樣性分析發(fā)現(xiàn)，MC 組與CK組樣本相距較遠(yuǎn)，說明復(fù)方地芬諾酯對小鼠腸道菌群組成影響較為明顯。BH 組小鼠腸道細(xì)菌的均勻程度較低，彼此離散，且與CK 組距離較大。BL 和BM 組，特別是BM 組與CK 組相距較近，證明中劑量黑菊芋多糖干預(yù)治療可一定程度恢復(fù)菌群平衡和結(jié)構(gòu)多樣性。

2.6 黑菊芋多糖對小鼠腸道菌群組成的影響

為探索黑菊芋多糖干預(yù)對小鼠腸道功能調(diào)控機制，通過16S rDNA 基因測序分析各組小鼠腸道菌群特征。如圖7 所示，經(jīng)OTU 聚類分析發(fā)現(xiàn)：在門水平上各組小鼠腸道菌群以擬桿菌門和厚壁菌門為主，其次為變形菌門（Proteobacteria）。與只能降解少部分特異性多糖厚壁菌門相比，具有廣泛的多糖降解酶和碳水化合物代謝途徑的擬桿菌門，更利于人體對多糖的消化吸收[17]。灌胃黑菊芋低、中劑量多糖后，厚壁菌門/擬桿菌門比值較MC 組分別降低了0.46%和8.68%，這與菊粉多糖[18]、黑木耳多糖[19]和杏鮑菇多糖[20]可以降低厚壁菌門/擬桿菌門比值的研究結(jié)果一致。此外，復(fù)方地芬諾酯干預(yù)后，在便秘發(fā)生機制中發(fā)揮著重要作用的變形菌門豐度由3.06%降低至2.00%，但經(jīng)不同劑量的黑菊芋多糖干預(yù)后變形菌門豐度提高至2.94%～16.00%。變形菌門包含了大量致病菌，是腸道菌群失調(diào)的標(biāo)志之一，然而有研究認(rèn)為變形菌門是魔芋葡甘露聚糖緩解便秘的優(yōu)勢菌門[21]。黑菊芋多糖干預(yù)后，變形菌門豐度的提高對便秘的具體影響有待進(jìn)一步研究。李丹丹等[22]對便秘小鼠模型進(jìn)行了16S rDNA 基因測序，與健康小鼠相比變形菌門的占比顯著降低。而在另一項研究中，由洛哌酰胺誘導(dǎo)便秘的小鼠腸道菌群中，變形菌門豐度增加[23]。推測可能與小鼠品種、喂養(yǎng)時間和環(huán)境等因素有關(guān)，說明腸道菌群紊亂雖然與功能性便秘存在相關(guān)性，但膳食干預(yù)誘導(dǎo)的便秘模型對引起的腸道菌群改變表現(xiàn)出個體差異性。

在屬水平上，各組中擬桿菌科的Uncultured Bacterium FMuribaculaceae屬、擬桿菌屬（Bacteroides）、乳酸菌屬（Lactobacillus）均為優(yōu)勢菌群。Muribaculaceae與腸道粘膜免疫系統(tǒng)相關(guān)，具有促進(jìn)腸道代謝的功能[24]。在本研究中，便秘小鼠體內(nèi)Muribaculaceae豐度由37.40%降低至27.08%，推測其可能是便秘的誘因之一。低、中劑量黑菊芋多糖干預(yù)后Muribaculaceae豐度分別提高至39.57%和38.03%，這與黑菊芋對正常小鼠腸道菌群的調(diào)節(jié)作用結(jié)果一致[25]。乳酸菌具有改善腸道環(huán)境、緩解便秘的作用，黑菊芋多糖呈劑量依賴性提高小鼠腸道中乳酸菌的豐度，BH 組豐度為MC 組的2.47 倍，說明黑菊芋多糖可以促進(jìn)乳酸菌的增殖。此外，不同結(jié)構(gòu)的多糖在腸道內(nèi)以多種水解機制被發(fā)酵成短鏈脂肪酸，從而緩解腸道菌群紊亂引起的疾病。CK 組中產(chǎn)短鏈脂肪酸菌棲糞桿菌屬（Faecalibaculum）豐度為0.62%，MC 組下降至 0.28%，黑菊芋多糖各組提高至1.99%～8.86%。既往的報道中，菊芋多糖也可以增加棲糞桿菌屬豐度[8]。毛螺菌科中的Lachnospiraceae_NK4A136_group 被認(rèn)為是一種益生菌，在增殖過程中可產(chǎn)生丁酸，其豐度水平與腸道炎癥呈負(fù)相關(guān)[19]。但另有研究認(rèn)為Lachnospiraceae_NK4A136_group 是與腸道菌群失調(diào)高度相關(guān)的條件致病菌[26,27]。與CK 組相比，MC 組的Lachnospiraceae_NK4A136_group 豐度顯著降低（p＜0.05），為1.75%。BL 組恢復(fù)至3.44%，而BM、BH 組又降低至1.4%和1.2%。據(jù)報道，擬普雷沃菌是參與改善腸道粘膜屏障功能及炎癥反應(yīng)的重要細(xì)菌，其豐度被認(rèn)為與脂代謝水平負(fù)相關(guān)[28]。值得注意的是，本研究中擬普雷沃菌屬在正常組小鼠中占比為1.91%，而在便秘組中高達(dá)16.5%。低、中、高劑量黑菊芋干預(yù)后，擬普雷沃菌屬分別降低至6.52%、4.31%和2.07%。

2.7 LEfSe 分析

如圖8 中LEfSe 進(jìn)化分支圖分析顯示，從門到屬共有27 種物種有明顯差異。中、高劑量黑菊芋多糖分別促進(jìn)了Actinobacteria（放線菌綱）、Coriobacteriales（紅蝽菌目）和Defluviitaleaceae 科的富集。在屬水平上 CK 組 LEFSE 分析的優(yōu)勢菌屬為Ruminiclostridium-9（瘤胃梭菌屬）、Intestinimonas、Tyzzerella（泰澤雷拉菌屬）、毛螺菌屬_UGG_008 和Acetatifactor，MC 組的優(yōu)勢菌屬為GCA_900066575和Akkermansia（阿克曼菌屬），BL 和BM 組的優(yōu)勢菌屬分別為Oscillibacter（顫螺旋菌屬）和Defluviitaleaceae UCG-011。其中顫螺旋菌屬被列為下一代益生菌的候選者，而Defluviitaleaceae_UCG-011與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的風(fēng)險負(fù)相關(guān)[29,30]。

3 結(jié)論

本研究所采用的黑菊芋多糖純度為82.73%，以復(fù)方地芬諾酯建立小鼠便秘模型，用不同劑量的黑菊芋多糖進(jìn)行干預(yù)，觀察6 h 內(nèi)排便粒數(shù)和墨汁推進(jìn)率，評價黑菊芋多糖的通便效果。發(fā)現(xiàn)不同劑量的黑菊芋多糖均有通便作用，與MC 組相比，2.5、5.0 和10.0 g/(kg·bw)黑菊芋多糖分別增加48.21%、98.21%、78.57%的小鼠黑便粒數(shù)和67.34%、107.05%、87.08%的小腸墨汁推進(jìn)率，其中以5.0 g/(kg·bw)效果最佳。此外，對16S rDNA 測序觀察腸道菌群豐度，發(fā)現(xiàn)與MC 組相比，5.0 g/(kg·bw)黑菊芋多糖干預(yù)可有效改善小鼠腸道微生物多樣性及豐富度，顯著增加厚壁菌門/擬桿菌比例和變形菌門豐度（p＜0.05），促進(jìn)腸道有益菌乳酸菌屬和棲糞桿菌屬增殖（p＜0.05），一定程度逆轉(zhuǎn)便秘造成的腸道菌群紊亂。綜上所述，黑菊芋多糖對小鼠功能性便秘和腸道菌群具有調(diào)節(jié)作用，未來有望作為功能性食品用于緩解便秘。