王浩，沈進娟，彭麗莎，管中榮，張召榮，王彬，范永紅

（重慶市渝東南農(nóng)業(yè)科學院，川渝共建中國醬腌菜科技創(chuàng)新重慶市重點實驗室，408000）

莖瘤芥（Brassica junceavar.tumida）是我國獨有的特色蔬菜之一，其特點是莖部膨大并形成瘤狀肉質(zhì)莖（又名青菜頭），是制作榨菜的原料，具有很高的經(jīng)濟價值[1]。目前，全國莖瘤芥種植面積20萬hm2左右，主要分布在重慶、浙江、四川、湖南、湖北等14個省市區(qū)，其中，以重慶種植和加工規(guī)模最大，產(chǎn)品也最為集中[2]。重慶涪陵是“中國榨菜之鄉(xiāng)”，也是全國最大的榨菜生產(chǎn)和加工基地，具有完整的榨菜產(chǎn)業(yè)鏈和產(chǎn)業(yè)化經(jīng)營格局。無論是青菜頭種植面積和產(chǎn)量，還是成品榨菜產(chǎn)銷量，均位居全國第一[3]。

但是，莖瘤芥遺傳基礎(chǔ)較狹窄、育種種質(zhì)貧乏，部分材料存在優(yōu)異性狀不顯著和現(xiàn)有品種難以滿足多元化市場以及規(guī)模化、自動化、智能化產(chǎn)業(yè)發(fā)展需求。鑒定研究育種材料遺傳背景，可根據(jù)親本間遺傳距離有效利用雜種優(yōu)勢，輔助新品種培育及種質(zhì)創(chuàng)新，提升品種綜合性狀表現(xiàn)，滿足生產(chǎn)及產(chǎn)業(yè)發(fā)展的需要，是一種切實有效的途徑。莖瘤芥種質(zhì)資源的鑒定、評價、分類和遺傳研究，是合理利用種質(zhì)資源、選配親本、創(chuàng)新材料、提高育種效率的重要基礎(chǔ)[4]。SSR分子標記是近年來發(fā)展迅速的一種分子標記技術(shù)，具有成熟穩(wěn)定、快速簡便、可靠性強、重復性高且品種間多態(tài)性豐富的特點，被廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性分析[5]。

因此，為進一步鑒定研究莖瘤芥主要品種的差異性，本研究利用9對SSR標記對莖瘤芥品種進行熒光標記檢測，通過構(gòu)建品種分子身份證和分析品種的遺傳多樣性，為莖瘤芥品種資源的鑒定、親緣關(guān)系分析、遺傳基礎(chǔ)研究等工作提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

從莖瘤芥國家登記品種中隨機選取在重慶與浙江兩地大面積推廣應(yīng)用的6個品種作為試驗材料。其中重慶品種有涪雜2號、涪雜5號、永安小葉；浙江品種有甬榨1號、甬榨4號、甬榨5號。2021年9月1日播種，采用穴盤育苗的形式，置于重慶市渝東南農(nóng)業(yè)科學院溫室大棚內(nèi)進行常規(guī)肥水管理。

項目組在前期在SSR標記相關(guān)研究工作中，獲得了一批多態(tài)性引物（表1），2022年1月選擇其中9對條帶清晰、表現(xiàn)穩(wěn)定的多態(tài)性引物用于樣品擴增，正向引物5'端添加熒光標記，所用引物均由上海思興生物科技有限公司合成。

表1 引物信息

1.2 DNA提取與PCR擴增

植株生長到第6片真葉時，取第5片真葉，采用改良CTAB法或使用植物專用DNA提取試劑盒，將每個參試品種的50片第5片真葉混合提取DNA。使用紫外分光光度計檢測樣品DNA質(zhì)量和濃度，并稀釋至50 ng/μL，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR擴增采用2×PCR Mix體系擴增，按照表2進行配制（反應(yīng)體積20μL）。

PCR反應(yīng)程序為：95℃變性5 min，1個循環(huán)；95℃變性30 s，50℃退 火1 min，72℃延伸2 min，35個循環(huán)；60℃退火1 min，72℃延 伸2 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min，16℃保存。

表2 PCR擴增反應(yīng)體系

表3 9對SSR引物標記的擴增結(jié)果

1.3 SSR熒光標記毛細管電泳檢測

配制HiDi＋Liz混液（1板量）：HiDi 900μL＋Liz 15μL混勻；按分好的引物組合混panel，每個孔吸取3μL擴增好的樣品，然后加2倍水稀釋；吸取2μL混液到上樣板中，每個孔加9μL HiDi＋Liz混液，95℃解鏈5 min；冷凍10 min，離心1 min。連接毛細管電泳儀ABI3730XL進行電泳分析，待毛細管電泳檢測完畢，利用SSR指紋分析器處理后獲得原始數(shù)據(jù)。

1.4 分子身份證構(gòu)建

利用9對條帶清晰、表現(xiàn)穩(wěn)定的SSR多態(tài)性引物對6個莖瘤芥品種樣品進行擴增，獲得參試樣品的指紋數(shù)據(jù)，再將其轉(zhuǎn)換為數(shù)字代碼，即分子身份證。

轉(zhuǎn)換方法如下：將每對引物在某一樣品上擴增出的每1種帶型用阿拉伯數(shù)字1～9編碼（為保證每1種帶型只占一位數(shù)字，當帶型數(shù)大于9時，分別用a、b、c代表第10、11、12種帶型，依此類推，無帶用0表示）。按照引物帶型種類由少到多的順序，將每個樣品在9對引物上的擴增帶型編碼串聯(lián)起來，即得到每個樣品以9位數(shù)字（或字母）表示的分子身份證[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR標記毛細管電泳結(jié)果

如表3、4所示，6個莖瘤芥品種樣品共篩選到7對SSR多態(tài)性引物，檢測到20個等位位點，平均每對引物2.2個等位位點；共擴增得到20個帶型，平均每對引物2.2個，擴增片段長度在126～397 bp（其中S5、S7在6個樣本中的帶型表現(xiàn)一致，無多態(tài)性）。

表4 9對SSR引物的擴增帶型

表5 供試品種的分子身份證編碼

莖瘤芥為異源四倍體植物（AABB），共36條染色體（2n=36）。測序結(jié)果顯示7對SSR引物標記分別位于莖瘤芥6條不同染色體上，且A、B染色體分布相當（表3）。

綜上所述，SSR引物多態(tài)性良好，在莖瘤芥染色體中分布較均勻。

2.2 供試品種的分子身份證構(gòu)建

按照表4所示的引物順序，將每對引物在不同樣品上擴增得到的帶型排列并將其編碼進行串聯(lián)，即得到6個莖瘤芥主要品種的分子身份證（表5）。對應(yīng)位置編碼相同則表明該引物在不同樣品上獲得了相同的擴增條帶。結(jié)果表明，6個參試的莖瘤芥主要品種的分子身份證代碼各有差異。通過構(gòu)建分子身份證代碼，將供試的6個莖瘤芥主要品種進行了合理區(qū)分。

對構(gòu)建好的莖瘤芥品種的身份代碼比對分析發(fā)現(xiàn)，6個莖瘤芥品種間平均差異位點3.7個，其中浙江本地品種間平均差異位點5.3個，浙渝兩地品種間平均差異位點4.0個，重慶本地品種間平均差異位點1.3個。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

①通過對樣本擴增條帶分析，從9對SSR蕓薹作物公共引物中篩選到7對多態(tài)性引物，并且在莖瘤芥染色體中分布較均勻。6個莖瘤芥品種中共檢測到20個等位位點，平均每對引物2.2個；共擴增得到20個帶型，平均每對引物2.2個，擴增片段長度在126～397 bp。引物S5、S7、S12、S16、S39、S20均表現(xiàn)為純合位點；引物S50、S15既有純合位點，又有雜合位點；引物S49均表現(xiàn)為雜合位點。其中引物S5、S7無多態(tài)性，后期仍需增加更多品種或榨菜種質(zhì)資源進一步驗證分析。

②本研究利用SSR熒光標記毛細管電泳檢測技術(shù)構(gòu)建了6個莖瘤芥主要品種的分子身份證，各品種均擁有獨立代碼，能夠?qū)⒃嚻贩N進行合理區(qū)分。

③對6個莖瘤芥品種的SSR標記差異分析結(jié)果表明，在分子水平上浙江本地品種間差異最大，平均差異位點5.3個；浙渝兩地品種差異次之，平均差異位點4.0個；重慶本地品種間差異最小，平均差異位點1.3個；6個莖瘤芥品種間平均差異位點3.7個。研究結(jié)果為莖瘤芥品種資源的鑒定、親緣關(guān)系分析、遺傳基礎(chǔ)研究等工作提供了依據(jù)。

3.2 討論

①SSR引物在不同作物、不同種屬間有一定的通用性[7，8]，并且隨著不同作物全基因組測序工作的廣泛開展，各大主要及非主要農(nóng)作物SSR引物信息的公共數(shù)據(jù)庫相繼建成和不斷更新，在很大程度上克服了SSR引物開發(fā)困難、成本高的限制。但是SSR分子標記應(yīng)用于種質(zhì)鑒定過程中，多方面配套技術(shù)仍需進一步改進，以提高種質(zhì)鑒定效率及可靠度[9]。

②本研究使用的引物根據(jù)蕓薹作物（http://www.brassica.info）公布的十字花科共同引物中篩選獲得，在后面的研究中應(yīng)充分利用基因組學和生物信息學篩選或設(shè)計新的特異性SSR引物，克服莖瘤芥特異性的引物缺乏難題，加快探明莖瘤芥的遺傳進化背景，挖掘與定位莖瘤芥膨大、抽薹、抗病等重要功能基因，建立及完善莖瘤芥分子輔助育種技術(shù)等研究工作進程。

③通過SSR分子標記輔助育種，可以鑒定與了解莖瘤芥種質(zhì)資源的遺傳基礎(chǔ)及親緣關(guān)系，能夠為莖瘤芥雜交組合配制的優(yōu)化提供科學可靠的理論支撐。通過構(gòu)建6個莖瘤芥主要品種的分子身份證，一定程度上顯示出莖瘤芥品種豐富的遺傳多樣性。同時本研究結(jié)果能夠為莖瘤芥登記品種分子數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建、莖瘤芥品種真實性與純度的鑒定提供科學依據(jù)，保證莖瘤芥種子生產(chǎn)、經(jīng)營的有序健康發(fā)展。

④本研究篩選的引物與樣品量較少，試驗結(jié)果局限于7對SSR引物對6個莖瘤芥主要品種的差異性研究，今后應(yīng)繼續(xù)深入研究更多莖瘤芥品種及種質(zhì)資源的遺傳多樣性，以期為整個榨菜產(chǎn)業(yè)體系的持續(xù)健康發(fā)展提供強有力的科學理論支撐。

4 致謝

特此感謝重慶市渝東南農(nóng)業(yè)科學院冷容、楊仕偉、李娟、冉廣葵、曾勝、張星星等科技人員在項目實施前期參與了SSR引物標記的篩選工作，為本試驗的開展提供了研究基礎(chǔ)。