杜晶輝， 黃自坤， 劉 旻， 龔菁菁， 王 丹， 劉基波， 劉 旭

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 國(guó)家中醫(yī)針灸臨床醫(yī)學(xué)研究中心檢驗(yàn)科，天津 300193；2.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 南昌 330006；3.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 國(guó)家中醫(yī)針灸臨床醫(yī)學(xué)研究中心感染疾病科，天津 300193）

結(jié)核病是嚴(yán)重危害人類健康的感染性疾病。對(duì)利福平和異煙肼耐藥的多重耐藥結(jié)核分枝桿菌（multidrug resistant-Mycobacterium tuberculosis，MDR-MTB）引起的耐藥問(wèn)題日益嚴(yán)重，隨著廣泛耐藥結(jié)核分枝桿菌（extensively drug-resistantMycobacterium tuberculosis，XDRMTB）的出現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）耐藥問(wèn)題已經(jīng)成為全球性的健康問(wèn)題，并使世界衛(wèi)生組織結(jié)核病控制計(jì)劃的實(shí)施受到限制[1]。XDR-MTB是指除MDR-MTB外對(duì)任何氟喹諾酮類藥物和3種二線注射藥物（卷曲霉素、卡那霉素和阿米卡星）中至少1種耐藥的MTB。全國(guó)結(jié)核病耐藥性基線調(diào)查報(bào)告最新數(shù)據(jù)表明，中國(guó)肺結(jié)核患者中，耐藥結(jié)核病、多重耐藥結(jié)核病和廣泛耐藥結(jié)核病的發(fā)生率分別為38.25%、8.32%和0.68%[2]。因此，快速、準(zhǔn)確的藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果對(duì)及時(shí)調(diào)整治療策略，最大程度地減少耐藥菌株的出現(xiàn)非常關(guān)鍵。

目前，廣泛使用的MTB體外藥物敏感性試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)方法是瓊脂比例法（agar proportion method，APM）和絕對(duì)濃度法。這2種方法需要在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)病原，較費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不能滿足臨床的需求。雖然分子線性探針技術(shù)和MGIT 960法可快速檢測(cè)MTB的耐藥性[3-4]，但由于成本高，且需要復(fù)雜的基礎(chǔ)設(shè)施，在大多數(shù)發(fā)展中國(guó)家無(wú)法普及。資源有限的醫(yī)療機(jī)構(gòu)迫切需要準(zhǔn)確、快速、低成本的MTB體外藥物敏感性試驗(yàn)方法。

2011年，世界衛(wèi)生組織推薦采用硝酸還原酶試驗(yàn)（nitrate reductase assay，NRA）篩查疑似MDR-MTB感染患者，NRA比常規(guī)APM更快捷，較MGIT 960法和分子線性探針技術(shù)成本低[5]。NRA通常是在傳統(tǒng)的羅氏培養(yǎng)基進(jìn)行[6-7]，也可在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行[8]。有研究發(fā)現(xiàn)，采用液體培養(yǎng)基的NRA可快速檢測(cè)MTB對(duì)利福平和異煙肼等一線抗結(jié)核藥物的耐藥性，結(jié)果可靠且成本低[9]。目前，采用液體培養(yǎng)基NRA檢測(cè)MTB對(duì)二線抗結(jié)核藥物耐藥性的研究較少。本研究通過(guò)多中心數(shù)據(jù)，分析液體培養(yǎng)基NRA快速檢測(cè)臨床分離MDR-MTB和XDRMTB菌株對(duì)利福平、異煙肼、氧氟沙星、阿米卡星、卡那霉素和卷曲霉素的耐藥性的性能。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

參與研究的實(shí)驗(yàn)室包括天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科、江西省胸科醫(yī)院結(jié)核病參考實(shí)驗(yàn)室、昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科和上海市第一人民醫(yī)院寶山分院臨床微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室。收集4個(gè)實(shí)驗(yàn)室2009年1月—2011年12月臨床分離MTB菌株，從中隨機(jī)選取730株（4個(gè)實(shí)驗(yàn)室分別為158、119、253、200株）進(jìn)行檢測(cè)。

本研究分為3個(gè)階段進(jìn)行。第1階段確定每種藥物的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）范圍，共對(duì)206株臨床分離MTB[108株MDR-MTB（4個(gè)實(shí)驗(yàn)室分別為23、18、37、30株）、20株完全敏感菌株（4個(gè)實(shí)驗(yàn)室各5株）、78株對(duì)至少1種受試藥物耐藥的非MDR-MTB菌株（4個(gè)實(shí)驗(yàn)室分別為16、12、27、23株）]進(jìn)行檢測(cè)，質(zhì)控菌株MTB H37Rv菌株（ATCC 27294）購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心。第2階段根據(jù)第1階段確定的MIC，每種藥物選取3個(gè)測(cè)試濃度（MIC和MIC上下各1個(gè)濃度梯度），在4個(gè)實(shí)驗(yàn)室對(duì)50株MTB菌株[26株MDR-MTB（包括8株XDR-MTB），6株完全敏感菌株，18株對(duì)至少1種受試藥物耐藥的非MDR-MTB]進(jìn)行盲測(cè)，將檢測(cè)結(jié)果與APM或MGIT 960法結(jié)果進(jìn)行比較。第3階段，采用第2階段確定的臨界濃度檢測(cè)730株MTB，比較3種方法藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果。所有臨床分離菌株均在羅氏培養(yǎng)基上進(jìn)行新鮮傳代培養(yǎng)，所有實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)人員均具有NRA的操作經(jīng)驗(yàn)，或曾接受過(guò)相關(guān)培訓(xùn)。

1.2 方法

1.2.1 液體培養(yǎng)基NRA法 液體培養(yǎng)基NRA法按照ADIKARAM等[8]的描述進(jìn)行。使用Middlebrook 7H9肉湯基質(zhì)和0.31%甘油、10%油性白蛋白-葡萄糖-過(guò)氧化氫酶（美國(guó)BD公司），以及0.1%硝酸鹽（美國(guó)Sigma公司）制備NRA液體培養(yǎng)基。第1階段使用的藥物濃度為：利福平4～0.125 mg/L、異煙肼0.8～0.025 mg/L、氧氟沙星8～0.25 mg/L、阿米卡星8～0.25 mg/L、卡那霉素20～0.62 mg/L、卷曲霉素20～0.62 mg/L。第2階段使用的藥物濃度為：利福平0.5、1和2 mg/L，異煙肼0.1、0.2和0.4 mg/L，氧氟沙星1、2和4 mg/L，阿米卡星2、4和8 mg/L，卡那霉素2.5、5和10 mg/L，卷曲霉素2.5、5和10 mg/L。第3階段使用的藥物濃度為：利福平1 mg/L、異煙肼0.2 mg/L、氧氟沙星2 mg/L、阿米卡星2 mg/L、卡那霉素5 mg /L、卷曲霉素2.5 mg/L。每種含藥物的培養(yǎng)管均接種100 μL 1.0麥?zhǔn)蠞岫染鷳乙?，?duì)照培養(yǎng)管中接種100 μL 1∶10稀釋的相同的菌懸液，將培養(yǎng)管置于37 ℃培養(yǎng)箱孵育。7 d后，向其中1支對(duì)照培養(yǎng)管中加入0.5 mL新鮮配制的Griess顯色試劑（將50%鹽酸、0.2%磺胺、0.1%N-1-萘基乙二胺鹽酸鹽按照1∶2∶2的比例混勻）。如果在對(duì)照培養(yǎng)管中觀察到顏色變化，則將Griess顯色試劑添加到所有含藥物的培養(yǎng)管中；如果沒(méi)有顏色變化，則將培養(yǎng)管重新放入培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育，在第14天重復(fù)該過(guò)程，如果需要，在第21天重復(fù)該過(guò)程。如果含藥培養(yǎng)管中所顯示的粉紅色與1∶10稀釋對(duì)照培養(yǎng)管中的粉紅色相同或顏色更深，則認(rèn)為該菌株具有抗性；如果1∶10稀釋對(duì)照培養(yǎng)管顏色發(fā)生變化，而含藥培養(yǎng)管在孵育21 d后顏色仍未發(fā)生變化，則認(rèn)為該菌株對(duì)抗菌藥物敏感。以從高濃度至低濃度6個(gè)藥物濃度含藥培養(yǎng)管中無(wú)顏色變化的培養(yǎng)管的藥物濃度為MIC。在4個(gè)實(shí)驗(yàn)室中確定每種藥物的臨界濃度與參考方法進(jìn)行比較的結(jié)果，將確定的臨界濃度作為每種藥物判斷敏感或耐藥的折點(diǎn)。在更換藥物和試劑批號(hào)時(shí)，應(yīng)使用1株完全敏感菌株和1株MDR-MTB菌株進(jìn)行質(zhì)控試驗(yàn)，以驗(yàn)證培養(yǎng)基是否正確，配置試驗(yàn)操作是否正確。細(xì)菌污染可能會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果，為確保培養(yǎng)基中沒(méi)有污染，使用液體培養(yǎng)基前，在綿羊血瓊脂平板上劃線培養(yǎng)，以排除其他細(xì)菌生長(zhǎng)。NRA的結(jié)果解讀應(yīng)是在未知參考方法藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果的情況下進(jìn)行，避免干擾對(duì)顏色的主觀判讀。

1.2.2 APM體外藥物敏感性試驗(yàn) 用羅氏培養(yǎng)斜面上的MTB菌落制備菌懸液，通過(guò)APM進(jìn)行間接藥物敏感性試驗(yàn)。根據(jù)世界衛(wèi)生組織指南推薦的標(biāo)準(zhǔn)比例法，在7H10瓊脂上進(jìn)行APM檢測(cè)，臨界濃度為：利福平1 mg/L、異煙肼0.2 mg/L、氧氟沙星2 mg/L、卡那霉素5 mg/L、卷曲霉素10 mg/L[10]。

1.2.3 MGIT 960法藥物敏感性試驗(yàn) 世界衛(wèi)生組織建議MGIT 960法僅適用于阿米卡星藥物敏感性試驗(yàn)，本研究根據(jù)說(shuō)明書要求進(jìn)行檢測(cè)，阿米卡星的MGIT 960法臨界濃度為1 μg/mL。

1.2.4 差異的解決 如果NRA與APM或MGIT 960法結(jié)果不一致，則進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)。如重復(fù)檢測(cè)后結(jié)果仍不一致，則對(duì)每種特定藥物的耐藥基因進(jìn)行測(cè)序，重新計(jì)算NRA對(duì)每種藥物的靈敏度和特異性，并定義為“修正后”。

1.2.5 聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）和測(cè)序 對(duì)于NRA與APM或MGIT 960法不一致的結(jié)果，參考文獻(xiàn)[11-12]對(duì)已知的耐藥基因rpoB（利福平）；inhA、katG、ahpC（異煙肼）；gyrA、gyrB（氧氟沙星）；rrs（阿米卡星、卡那霉素、卷曲霉素）；eis（卡那霉素）和tlyA（卷曲霉素）進(jìn)行測(cè)序。使用十六烷基三甲基溴化銨氯化鈉溶液進(jìn)行核酸提取[13]?；驕y(cè)序由北京基因組研究所完成，使用Clonemanager軟件進(jìn)行測(cè)序結(jié)果分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。以APM或MGIT 960法為參考方法評(píng)估NRA法的敏感性、特異性和準(zhǔn)確性，計(jì)算菌株NRA檢測(cè)陽(yáng)性所需的時(shí)間。

2 結(jié)果

2.1 第1階段結(jié)果

用液體培養(yǎng)基NRA檢測(cè)了206株臨床分離的MTB，結(jié)果顯示NRA法與APM或MGIT 960法MIC具有很高的一致性。NRA檢測(cè)6種藥物的MIC分別為：利福平1 mg/L、異煙肼0.2 mg/L、氧氟沙星2 mg/L、阿米卡星4 mg/L、卷曲霉素5 mg/L、卡那霉素5 mg/L。

（1）利福平耐藥性檢測(cè)有3個(gè)不一致的結(jié)果。NRA得到的MIC值為0.5 mg/L，判定為敏感；而APM法判定為耐藥。rpoB基因測(cè)序結(jié)果表明，有2株分離株存在與利福平耐藥性相關(guān)的突變位點(diǎn)（S531L、D516Y）。因此，這2株菌株被判定為耐藥。本研究根據(jù)測(cè)序結(jié)果重新計(jì)算了修正后NRA的敏感性、特異性和準(zhǔn)確性，得到NRA檢測(cè)利福平耐藥性的敏感性和特異性分別為98.7%和100.0%。見(jiàn)表1。

表1 第1階段藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

（2）異煙肼耐藥性檢測(cè)有4個(gè)不一致的結(jié)果。NRA得到的MIC值為0.1 mg/L，判定為敏感；而APM法判定為耐藥，katG、inhA和ahpC測(cè)序結(jié)果顯示，有2株分離株基因組中僅含有katG突變，其相應(yīng)的氨基酸突變?yōu)镾315T。因此，修正后的NRA檢測(cè)異煙肼耐藥性的敏感性和特異性分別為98.8%和100.0%。見(jiàn)表1。

（3）氧氟沙星耐藥性檢測(cè)結(jié)果顯示，NRA與APM法的一致性為100%。

（4）阿米卡星耐藥性檢測(cè)有2個(gè)不一致的結(jié)果。NRA得到的MIC值為2 mg/L，判定為敏感；而MGIT 960法判定為耐藥。rrs基因測(cè)序結(jié)果顯示，有2株分離株基因組中含有與阿米卡星耐藥相關(guān)的突變（A1401G）。因此，修正后的NRA檢測(cè)阿米卡星耐藥性的敏感性和特異性分別為95.2%和100.0%。見(jiàn)表1。

（5）卡那霉素耐藥性檢測(cè)有1個(gè)不一致結(jié)果。NRA得到的MIC值為2.5 mg/L，判定為敏感；而APM判定為耐藥；rrs或eis測(cè)序結(jié)果顯示，rrs和eis基因組中沒(méi)有任何突變。

（6）卷曲霉素耐藥性檢測(cè)有2個(gè)不一致的結(jié)果。NRA得到的MIC值為2.5 mg/L，判定為敏感；而APM判定為耐藥，rrs基因測(cè)序結(jié)果表明，其中1株菌株的基因組中含有A1401G突變。因此，修正后的NRA檢測(cè)卷曲霉素耐藥性的敏感性和特異性分別為96.4%和100.0%。見(jiàn)表1。

2.2 第2階段結(jié)果

利福平臨界濃度為1 mg/L時(shí)結(jié)果最一致，總準(zhǔn)確性為98.0%；異煙肼臨界濃度為0.2 mg/L時(shí)結(jié)果最一致，總準(zhǔn)確度為98.5%；氧氟沙星臨界濃度為2 mg/L時(shí)結(jié)果最一致，總準(zhǔn)確性為98.5%；阿米卡星臨界濃度為2 mg/L時(shí)結(jié)果最一致，總準(zhǔn)確性為97.5%；卡那霉素臨界濃度為5 mg/L時(shí)結(jié)果最一致，總準(zhǔn)確性為97.5%；卷曲霉素臨界濃度為2.5 mg/L時(shí)結(jié)果最一致，總準(zhǔn)確性為97.0%；見(jiàn)表2。4個(gè)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)6種藥物的敏感性、特異性、準(zhǔn)確性見(jiàn)表3。

表2 確定6種藥物臨界濃度

表3 4個(gè)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)6種藥物的敏感性、特異性和準(zhǔn)確性

2.3 第3階段結(jié)果

采用第2階段確定的臨界濃度檢測(cè)730株MTB臨床分離株。4個(gè)實(shí)驗(yàn)室采用液體培養(yǎng)基NRA法與參考方法進(jìn)行體外藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果顯示，利福平耐藥性檢測(cè)準(zhǔn)確性為97.0%～100.0%，總準(zhǔn)確性為98.4%；異煙肼準(zhǔn)確性為96.8%～99.2%，總準(zhǔn)確性為98.1%；氧氟沙星準(zhǔn)確性為98%～100%，總準(zhǔn)確性為98.8%；阿米卡星準(zhǔn)確性為96.8%～98.5%，總準(zhǔn)確性為97.9%；卡那霉素準(zhǔn)確性為96.4%～99.5%，總準(zhǔn)確性為97.9%；卷曲霉素準(zhǔn)確性為96.8%～100.0%，總準(zhǔn)確性為98.2%；見(jiàn)表5。NRA、APM和MGIT 960法結(jié)果不一致的菌株的測(cè)序結(jié)果見(jiàn)表6。

表4 4個(gè)實(shí)驗(yàn)室液體培養(yǎng)基NRA與參考方法藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果 株

2.4 樣本周轉(zhuǎn)時(shí)間（turn-around time，TAT）及污染率

NRA檢測(cè)的中位時(shí)間為7 d，APM為21 d（P<0.001）。在第3階段，采用NRA，76.2%（556/730）的MTB 7 d便可得到結(jié)果；采用APM，5.2%（38/730）的MTB 21 d才能得到結(jié)果。液體培養(yǎng)基沒(méi)有細(xì)菌或真菌的污染，7H10瓊脂中有5個(gè)樣品污染，MGIT 960法培養(yǎng)基有8個(gè)樣品污染。

表5 4個(gè)實(shí)驗(yàn)室液體培養(yǎng)基NRA檢測(cè)6種藥物的敏感性、特異性及準(zhǔn)確性 %

表6 第3階段藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果不一致菌株基因測(cè)序結(jié)果

3 討論

本研究的目的是確定液體培養(yǎng)基NRA檢測(cè)一線和二線抗結(jié)核藥物的臨界濃度，并通過(guò)多中心數(shù)據(jù)評(píng)估液體培養(yǎng)基NRA的檢測(cè)性能。

首先，本研究確定了液體培養(yǎng)基NRA檢測(cè)6種臨床常用的抗結(jié)核藥物的MIC值，根據(jù)MIC值確定NRA檢測(cè)每種藥物的臨界濃度。本研究結(jié)果顯示，NRA得到的6種藥物的臨界濃度與MGIT 960法得到的結(jié)果[10]相似（表7）。本研究結(jié)果顯示，采用液體培養(yǎng)基NRA時(shí)，利福平的臨界濃度為1 mg/L、氧氟沙星和阿米卡星的臨界濃度為2 mg/L、卡那霉素的臨界濃度為5 mg/L、卷曲霉素的臨界濃度為2.5 mg/L。為驗(yàn)證本研究確定的臨界濃度，4個(gè)實(shí)驗(yàn)室共進(jìn)行了1 200次檢測(cè)，只有13個(gè)（1.1%）假敏感結(jié)果和13個(gè)（1.1%）假耐藥結(jié)果，證實(shí)了相關(guān)研究[8-14]確定的利福平臨界濃度為1 mg/L，氧氟沙星臨界濃度為2 mg/L的適用性。

表7 液體培養(yǎng)基NRA法確定的MIC和最終臨界濃度與MGIT 960法比較 mg/L

在第3階段，本研究進(jìn)行了多中心前瞻性評(píng)估，采用第2階段確定的臨界濃度，通過(guò)對(duì)6種藥物的耐藥性結(jié)果檢測(cè)評(píng)估液體培養(yǎng)基NRA同時(shí)檢測(cè)MDR-MTB和XDR-MTB的性能，結(jié)果顯示，NRA與參考方法（APM或MGIT 960法）結(jié)果一致性較高。對(duì)于不一致的結(jié)果，通過(guò)NRA、APM或MGIT 960法進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)來(lái)確認(rèn)；對(duì)于重復(fù)檢測(cè)后仍然不一致的結(jié)果，對(duì)基因組中已知耐藥相關(guān)基因進(jìn)行測(cè)序，為表型檢測(cè)的正確性或可靠性判斷提供了間接證據(jù)，結(jié)果顯示，在45個(gè)不一致的結(jié)果中，有11個(gè)檢測(cè)到阿米卡星、卡那霉素和卷曲霉素耐藥最常見(jiàn)的突變r(jià)rsA1401G；而對(duì)于氧氟沙星的耐藥性，本研究發(fā)現(xiàn)的最常見(jiàn)的gyrA突變位點(diǎn)是D94G，與相關(guān)報(bào)道一致[15]。

近年來(lái)，許多研究采用固體培養(yǎng)基NRA對(duì)二線抗結(jié)核藥物進(jìn)行體外藥物敏感性試驗(yàn)，結(jié)果顯示其具有很高的敏感性和特異性[7，15-17]。有研究發(fā)現(xiàn)，液體培養(yǎng)基NRA檢測(cè)氧氟沙星的耐藥性性能優(yōu)異[14]。本研究中，液體培養(yǎng)基NRA檢測(cè)利福平、異煙肼和二線抗結(jié)核藥物耐藥性的敏感性和特異性都非常好，其中檢測(cè)利福平、異煙肼和氧氟沙星耐藥性的敏感性與相關(guān)研究結(jié)果[9，14]一致。本研究通過(guò)多中心數(shù)據(jù)證實(shí)了液體培養(yǎng)基NRA可以篩查XDR-MTB感染。

體外藥物敏感性試驗(yàn)的TAT對(duì)于制定合適的治療方案非常重要。本研究結(jié)果顯示，采用液體培養(yǎng)基NRA檢測(cè)，有76%的樣本在接種第7天即可獲得結(jié)果，與傳統(tǒng)的APM相比[18]，時(shí)間顯著縮短。NRA的TAT與MGIT 960法相似，但不需要昂貴的設(shè)備，成本較低。此外，液體培養(yǎng)基NRA檢測(cè)較相關(guān)研究報(bào)道的LJ培養(yǎng)基也更快[19]。NRA需要反復(fù)打開(kāi)培養(yǎng)管，易產(chǎn)生污染，但本研究中污染率為0，可能的原因?yàn)椋海?）嚴(yán)格的人員培訓(xùn)，人員培訓(xùn)中除了操作技術(shù)部分，更注重生物安全及防止污染，為了保證操作一致，并防止污染，每次的操作人員均固定；（2）每次試驗(yàn)均在專用的生物安全柜（條件允許時(shí)采用BⅡ全排型生物安全柜）中進(jìn)行，并在試驗(yàn)前采用75%乙醇擦拭1次，隨后把所有試驗(yàn)所需的材料按清潔區(qū)和污染區(qū)分類放置于安全柜中的不同區(qū)域，試驗(yàn)過(guò)程中操作人員雙手不再離開(kāi)安全柜；（3）試驗(yàn)過(guò)程中使用滅菌耗材進(jìn)行操作，可在紅外線消毒器附近進(jìn)行操作，如有污染發(fā)生，及時(shí)消毒并更換手套；（4）試驗(yàn)完成后再次用75%乙醇擦拭，并用紫外線照射30 min。目前，針對(duì)病原對(duì)某些藥物（如利福平）的耐藥性檢測(cè)，有更快速的分子檢測(cè)方法，但這些檢測(cè)方法不能檢測(cè)所有藥物的耐藥情況[20]。因此，NRA等表型檢測(cè)方法為醫(yī)療資源有限的實(shí)驗(yàn)室（尤其是發(fā)展中國(guó)家的實(shí)驗(yàn)室）快速、準(zhǔn)確、低成本地檢測(cè)MDRMTB或XDR-MTB提供了一個(gè)非?？煽康倪x擇。本研究尚存在一些不足，NRA需要多次加入顯色劑才能最終判讀結(jié)果；相對(duì)于APM和絕對(duì)濃度法，試驗(yàn)過(guò)程中需反復(fù)打開(kāi)培養(yǎng)管，人工操作次數(shù)更多，根據(jù)國(guó)際生物安全準(zhǔn)則，MTB的體外藥物敏感性試驗(yàn)需要BSL-3設(shè)施，因此所有操作均應(yīng)在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行[18，21]；NRA是通過(guò)目測(cè)判定顏色，存在一定的主觀誤差。

綜上所述，液體培養(yǎng)基NRA具有檢測(cè)速度更快、成本低（不需要特殊的設(shè)備或試劑）、易于操作等優(yōu)點(diǎn)，在保證生物安全要求的條件下，可在醫(yī)療資源有限的實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展MTB一線和二線抗結(jié)核藥物的體外藥物敏感性試驗(yàn)。