孫 雷， 龍 駒， 樊祖茜， 吳素萍， 林桂先， 凌秀明

（1.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部，陜西 西安 710061；2.欽州市婦幼保健院基因與遺傳實(shí)驗(yàn)室，廣西 欽州 535099；3.欽州市婦幼保健院檢驗(yàn)科，廣西 欽州 535099）

性染色體病又稱性染色體異常綜合征，是指由性染色體（X或Y）的數(shù)目異常或結(jié)構(gòu)畸變引起的疾病。性染色體病有多種類型，但都有共同的臨床特征，即性腺發(fā)育不全或兩性畸形。性染色體非整倍性是目前新生兒中最常見(jiàn)的染色體變異，總發(fā)病率為1/400，大約是唐氏綜合征發(fā)病率的2倍[1]。男性性染色體異常主要表現(xiàn)為47，XXY和47，XYY等異常，也可表現(xiàn)為48，XYYY、48，XXYY、48，XXXY或49，XXXXY等性染色體四體或五體異常，女性主要表現(xiàn)為性染色體單體45，X和性染色體三體47，XXX，也可表現(xiàn)為48，XXXX和49，XXXXX等X染色體四體或五體異常[2]。另外，還易出現(xiàn)1個(gè)或多個(gè)克隆的細(xì)胞失去或獲得性染色體，即發(fā)生性染色體嵌合體。最常見(jiàn)的性染色體嵌合體包括45，X/46，XX、46，XX/47，XXX、46，XY/47，XXY[3]。性染色體的異常率和異常種類非常多，因此對(duì)性染色體的產(chǎn)前診斷具有非常重要的臨床意義。

基于短串聯(lián)重復(fù)序列的熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（short tandem repeat-quantitative fluorescent polymerase chain reaction，STR-QFPCR），多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)和熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）等技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)非整倍體的檢測(cè)[4-8]，但是由于需要特殊檢測(cè)儀器或操作相對(duì)繁瑣，不利于批量檢測(cè)。傳統(tǒng)的實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）由于不需要擴(kuò)增后的產(chǎn)物再處理步驟，在擴(kuò)增的同時(shí)即可得到檢測(cè)結(jié)果，因此具有快速、簡(jiǎn)便的特點(diǎn)。然而，由于傳統(tǒng)的熒光定量PCR采用的是不同的引物擴(kuò)增不同的序列來(lái)進(jìn)行相對(duì)定量，不同引物的擴(kuò)增效率存在差異，從而導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性不足[9]。本課題組前期建立了基于重復(fù)序列的熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（segmental duplication-quantitative polymerase chain reaction，SD-qPCR）方法，提高了對(duì)21號(hào)染色體診斷的穩(wěn)定性和可靠性[10]。據(jù)此，本課題組又開(kāi)發(fā)出一種可進(jìn)行雙重相對(duì)定量的SD-qPCR方法，以期能實(shí)現(xiàn)對(duì)其他染色體的快速檢測(cè)及單管多位點(diǎn)的檢測(cè)。

1 材料和方法

1.1 臨床樣本

收集197例羊水樣本，所有樣本經(jīng)染色體G顯帶核型分析，其中性染色體數(shù)目正常樣本185例、45，X樣本5例、47，XXX樣本3例、47，XXY樣本2例、47，XYY樣本2例。

1.2 重復(fù)序列的篩選

從美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（the National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.ncbi.org）中篩選出染色體間的重復(fù)序列分子標(biāo)記，重復(fù)序列分子標(biāo)記的一個(gè)位點(diǎn)必須位于性染色體（X或Y染色體），另一個(gè)位點(diǎn)位于性染色體以外的其他染色體。

1.3 引物和探針的設(shè)計(jì)

以篩選出的重復(fù)序列為目的序列，設(shè)計(jì)引物和探針。在重復(fù)序列堿基完全相同的部位設(shè)計(jì)公共擴(kuò)增引物，使其能同時(shí)等效擴(kuò)增重復(fù)序列的2個(gè)片段；在有堿基差異的部位設(shè)計(jì)各自的特異性檢測(cè)探針，使其能分別檢測(cè)出目的序列和參考序列的擴(kuò)增量。

1.4 雙重相對(duì)定量SD-qPCR反應(yīng)體系與參數(shù)

檢測(cè)儀器為CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)伯樂(lè)公司）。反應(yīng)體系：總體積25 μL，模板DNA 2 μL、2對(duì)引物（5 μmol/L各0.5 μL）、引物對(duì)應(yīng)的TaqMan探針（5 μmol/L各0.5 μL）、2×TaqMan Universal PCRMaster Mix[天根生化科技（北京）有限公司]12.5 μL、ddH2O 5.5 μL。熱循環(huán)條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，68 ℃1 min，循環(huán)5次，不收集熒光；然后95 ℃ 15 s，68 ℃ 1 min，于68 ℃時(shí)收集熒光，循環(huán)36次。

1.5 臨床樣本的檢測(cè)

采用建立的雙重相對(duì)定量SD-qPCR方法檢測(cè)197例羊水樣本，并根據(jù)16號(hào)染色體與X染色體間的重復(fù)序列2-ΔΔCt值來(lái)判斷X染色體的數(shù)目，1號(hào)染色體與Y染色體間的重復(fù)序列相對(duì)定量2-ΔΔCt值來(lái)判斷Y染色體的數(shù)目。將所有檢測(cè)結(jié)果與染色體核型分析結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，以判斷所建方法的準(zhǔn)確性和可靠性。

2 結(jié)果

2.1 SD-qPCR引物和探針設(shè)計(jì)

經(jīng)N C B I數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出了2對(duì)重復(fù)序列分子標(biāo)記，定位于1 6號(hào)染色體（NC_000016.10）、X染色體（NC_000023.11）和1號(hào)染色體（NC_000001.11）、Y染色體（NC_000024.10），可分別用于檢測(cè)X和Y染色體的數(shù)目。SD-qPCR的引物設(shè)計(jì)原理及方法見(jiàn)圖1。

圖1 SD-qPCR引物設(shè)計(jì)原理及方法

2.2 SD-qPCR的濃度梯度檢測(cè)

采用SD-qPCR檢測(cè)不同濃度（160、32、6.4、1.28、0.256和0.128 ng/μL）的DNA，結(jié)果顯示，除DNA濃度為0.128 ng/μL時(shí)無(wú)擴(kuò)增外，其他DNA濃度均能有效擴(kuò)增，SD-qPCR的擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 SD-qPCR的濃度梯度擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線

計(jì)算不同DNA濃度的變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）。對(duì)于16號(hào)染色體與X染色體間的重復(fù)序列，不同DNA模板濃度下ΔCt值的CV分別為6.37%、2.38%、5.65%、5.57%和8.82%。對(duì)于1號(hào)染色體與Y染色體間的重復(fù)序列，不同DNA模板濃度ΔCt值的CV分別為6.51%、3.47%、3.94%、6.73%和8.23%。

2.3 SD-qPCR檢測(cè)樣本的2-ΔΔCt值

性染色體拷貝數(shù)可根據(jù)16號(hào)染色體和X染色體、1號(hào)染色體和Y染色體的2-ΔΔCt值來(lái)判斷。樣本不同X和Y染色體數(shù)目的2-ΔΔCt值為：胎兒為女性或無(wú)Y染色體的樣本2-ΔΔCt（1-Y）值為0，有1條Y染色體的樣本2-ΔΔCt（1-Y）值為0.84～1.30，有2條Y染色體的樣本2-ΔΔCt（1-Y）值為1.90～2.01；胎兒為男性或僅1條X染色體的樣本2-ΔΔCt（16-X）值為0.37～0.65，有2條X染色體的樣本2-ΔΔCt（16-X）值為0.87～1.13，有3條X染色體的樣本2-ΔΔCt（16-X）值為1.34～1.45。各2-ΔΔCt值之間無(wú)相互重疊的情況，因此根據(jù)2-ΔΔCt值即可有效判斷X和Y染色體的數(shù)目。

2.4 臨床樣本的檢測(cè)結(jié)果

采用雙重相對(duì)定量SD-qPCR檢測(cè)197例羊水樣本，其中性染色體數(shù)目正常的樣本185例、45，X樣本5例、47，XXX樣本3例、47，XXY樣本2例、47，XYY樣本2例，檢測(cè)結(jié)果與染色體核型分析結(jié)果一致。不同染色體核型的雙重相對(duì)定量SD-qPCR檢測(cè)結(jié)果分布見(jiàn)圖3。

圖3 不同染色體核型的雙重相對(duì)定量SD-qPCR結(jié)果分布

3 討論

在人類基因組DNA中，不僅包含單一拷貝的DNA序列，還有大量的串聯(lián)重復(fù)序列（衛(wèi)星DNA、小衛(wèi)星DNA和微衛(wèi)星DNA）和分散重復(fù)序列。串聯(lián)重復(fù)序列中的衛(wèi)星和小衛(wèi)星DNA主要分布于著絲?；蚨肆?，常作為FISH技術(shù)的分子標(biāo)記應(yīng)用于遺傳疾病的診斷[5]。微衛(wèi)星DNA也被稱為短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeat，STR），可與定量PCR結(jié)合構(gòu)成STR-QF-PCR技術(shù)，用于常見(jiàn)染色體非整倍體的快速診斷[4]。分散重復(fù)序列是指重復(fù)單位并不相連，散布在整個(gè)基因組染色體各位點(diǎn)的序列，對(duì)其臨床應(yīng)用方面的研究目前還較少。本研究采用的重復(fù)序列相當(dāng)于只有2個(gè)拷貝的分散重復(fù)序列，是位于不同染色體上的2段具有堿基高度相似，但又有部分堿基數(shù)目或結(jié)構(gòu)差異的序列。

理想的重復(fù)序列分子標(biāo)記應(yīng)該是重復(fù)序列的兩端引物設(shè)計(jì)處堿基完全相同，而中間用于定量檢測(cè)的探針部分又有2個(gè)以上的堿基差異。這樣才能保證2個(gè)序列擴(kuò)增效率的一致性，以及定量結(jié)果的特異性和準(zhǔn)確性。通過(guò)多次的篩選和驗(yàn)證，本研究成功篩選出2對(duì)重復(fù)序列分子標(biāo)記，分別位于16號(hào)染色體、X染色體和1號(hào)染色體、Y染色體上。本研究采用2對(duì)引物和4條熒光探針同時(shí)擴(kuò)增并檢測(cè)相應(yīng)的染色體，從而開(kāi)發(fā)了一種新的雙重相對(duì)定量SD-qPCR方法，雙重相對(duì)定量SD-qPCR的檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)的染色體核型分析結(jié)果一致，具有良好的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。

本研究采用雙重相對(duì)定量SD-qPCR對(duì)不同濃度梯度的DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增，除在0.128 ng/μL濃度條件下無(wú)擴(kuò)增外，DNA濃度為0.256～160 ng/μL時(shí)，所有的位點(diǎn)均能有效擴(kuò)增，表明該技術(shù)的檢出限可達(dá)0.256 ng/μL。另外，本研究對(duì)各個(gè)濃度梯度的ΔCt值進(jìn)行了CV分析，發(fā)現(xiàn)當(dāng)DNA濃度為32 ng/μL時(shí)，16號(hào)染色體與X染色體間相對(duì)定量ΔCt值的CV為2.38%，1號(hào)染色體與Y染色體間的相對(duì)定量ΔCt值的CV為3.47%，該濃度的CV最小，表明該檢測(cè)體系的最佳模板濃度為32 ng/μL。

在前期研究中，我們主要通過(guò)比較待測(cè)樣本與正常樣本的ΔCt值差異來(lái)判斷待測(cè)樣本的基因或染色體的拷貝數(shù)[10]。通過(guò)ΔCt值區(qū)間的統(tǒng)計(jì)分析，可以有效檢出同一個(gè)批次待測(cè)樣本的染色體拷貝數(shù)，具有簡(jiǎn)便和直觀的特點(diǎn)。但當(dāng)PCR儀器、試劑或DNA質(zhì)量有變化時(shí)，ΔCt值的波動(dòng)會(huì)相對(duì)較大。因此，ΔCt值分析不適用于不同批次間的分析比較。鑒于此，本研究統(tǒng)一采用2-ΔΔCt值對(duì)樣本進(jìn)行分析[11]，Y染色體拷貝數(shù)可通過(guò)1號(hào)染色體和Y染色體重復(fù)序列的2-ΔΔCt（1-Y）值來(lái)判斷，X染色體拷貝數(shù)可通過(guò)16號(hào)染色體與X染色體重復(fù)序列的2-ΔΔCt（16-X）值來(lái)判斷，有效避免了采用ΔCt值分析的不足。

傳統(tǒng)的相對(duì)定量PCR雖然具有快速和簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，但存在穩(wěn)定性差和檢測(cè)位點(diǎn)少等缺點(diǎn)。（1）檢測(cè)的穩(wěn)定性：傳統(tǒng)的熒光定量PCR在基因表達(dá)量檢測(cè)方面應(yīng)用較多[12-13]，具有較好的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，原因主要是在科研實(shí)驗(yàn)全過(guò)程中，人員、試劑和儀器等條件基本沒(méi)有變化，但當(dāng)涉及不同的實(shí)驗(yàn)室或人員、儀器等出現(xiàn)變動(dòng)時(shí)，極其微小的差異就會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增效率的改變，從而導(dǎo)致假陰性或假陽(yáng)性結(jié)果[14]。（2）多位點(diǎn)的檢測(cè)能力：傳統(tǒng)的PCR檢測(cè)由于穩(wěn)定性不足，不同探針或引物間的干擾較大，一般只能進(jìn)行單重相對(duì)定量PCR檢測(cè)[15]，即單管只能檢測(cè)1條序列或染色體。本研究建立的雙重相對(duì)定量SD-qPCR方法使用的2對(duì)重復(fù)序列的擴(kuò)增引物完全相同，從根本上解決了傳統(tǒng)PCR技術(shù)穩(wěn)定性不足的問(wèn)題，并可以實(shí)現(xiàn)單管四色熒光雙重相對(duì)定量PCR檢測(cè)，單管即可同時(shí)檢測(cè)4條染色體。

綜上所述，建立的雙重相對(duì)定量SD-qPCR方法與傳統(tǒng)的PCR相比，具有檢測(cè)位點(diǎn)更多、檢測(cè)結(jié)果更穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)。本方法不僅具有重要的臨床推廣和應(yīng)用價(jià)值，同時(shí)也可為其他染色體數(shù)目異常的分子診斷方法的建立提供參考。