喻大鵬，程 俊，夏洪麗，夏立群，蔡 佳，魯義善

(1 廣東海洋大學(xué)深圳研究院,深圳,518108;2 廣東海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院,廣東湛江,524088;3 廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東湛江,524088;4 廣東省水生動物健康評估工程技術(shù)研究中心,深圳,518018;5 武漢臨空港經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)農(nóng)業(yè)發(fā)展投資集團(tuán)有限公司,武漢,430040;6 武漢晟豐農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司,武漢,430040)

大鯢()，又名娃娃魚，肉食性，常棲息于巖洞，灘口洞穴內(nèi)，廣泛分布于我國河北、河南、安徽、江蘇、浙江、廣東等地。由于其具有極高的藥用、食用和營養(yǎng)價值，1980年前后在我國廣東及東南亞地區(qū)興起大鯢食用之風(fēng)，在巨大利益驅(qū)使之下，出現(xiàn)大量盜捕和非法販賣大鯢行為，導(dǎo)致野生大鯢數(shù)量急劇下降。為保護(hù)野生大鯢種群數(shù)量，在 21世紀(jì)初期，國家大力發(fā)展大鯢人工繁殖馴化。而隨著人工養(yǎng)殖大鯢產(chǎn)業(yè)規(guī)模不斷擴(kuò)大及水環(huán)境惡化等問題突顯，導(dǎo)致病原傳播加劇，給大鯢人工養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失。目前研究表明，引起大鯢病害的病原主要包括細(xì)菌[腐敗希瓦氏菌()和嗜水氣單胞菌()]、真菌[絲囊霉屬()]、病毒[大鯢虹彩病毒(iridovirus)]和寄生蟲[大鯢卷尾線蟲新種(sp.nov)]。

大鯢虹彩病毒(Chinese giant salamander iridovirus,CGSIV)，又稱大鯢蛙病毒(Chinese giant salamander ranavirus,CGSRV),屬于虹彩病毒科(Iridoviridae)蛙病毒屬()，大鯢虹彩病毒病是一種傳播速度快，不易控制，死亡率高且難以防范的病毒病，對全世界大鯢養(yǎng)殖業(yè)均造成非常嚴(yán)重的影響。蛙病毒首次由GRANOFF等于 1966 年分離鑒定，其感染范圍非常廣泛，現(xiàn)今已有五十多個變溫脊椎動物家族的上百種動物被蛙病毒感染致死的相關(guān)報道。而我國最早發(fā)現(xiàn)CGSIV是在2009 年的甘肅隴南與陜西漢中，患病大鯢死亡率高達(dá)90%以上。虹彩病毒感染大鯢初期，行動緩慢，無食欲，體表出現(xiàn)大量黏液；后期下頜出血，身體四肢皮膚潰爛發(fā)炎，肌肉壞死，嚴(yán)重者肢體斷裂；解剖可見其體內(nèi)肝臟、脾臟及頭腎等免疫器官腫脹，肺部充血并存在大量出血點(diǎn)，腹腔及腸道內(nèi)充滿黃色液體。

本研究從廣州某野生動物保護(hù)基地采集了患病死亡的大鯢樣本，通過體表病患特征及內(nèi)臟剖檢結(jié)果，推測可能是由病毒引起突發(fā)性死亡。隨后使用細(xì)胞系培養(yǎng)、透射電鏡切片及分子生物學(xué)分析等方法，分離得到病毒株，確定是由CGSIV引發(fā)的死亡。本研究報道的結(jié)果為后續(xù)針對該病毒防控及免疫相關(guān)研究工作提供了參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2020年5月從廣東廣州某野生動物保護(hù)基地采集三尾患病死亡大鯢體表潰瘍處肌肉、脾臟和頭腎等免疫組織，患病大鯢體長約2 m。發(fā)病時，大鯢長期蟄伏于水下，反應(yīng)遲鈍，食欲廢絕，經(jīng)檢測水體溫度和水質(zhì)無異常。

1.2 細(xì)胞系、試劑與主要儀器

FHM細(xì)胞均由本實(shí)驗(yàn)室保存，M199(Hyclone)培養(yǎng)基，胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS， Gibico)，ExDNA 聚合酶，DL 2000 DNA Marker 均購自TaKaRa 公司，DNA 提取試劑盒購自美國Omega公司；CO細(xì)胞培養(yǎng)箱購自Thermo Fisher公司;普通光學(xué)顯微鏡購自美國Leica公司；PCR儀購自德國耶那公司;引物合成及序列測定均由華大基因(廣州)股份有限公司完成。

1.3 病原分離

將患病死亡大鯢在無菌條件下進(jìn)行解剖，取其肌肉、脾臟、頭腎及肝臟等組織樣品，首先進(jìn)行鏡檢；隨后將解剖取出的各組織在LB固體平板和BHI固體平板上進(jìn)行劃線，28 ℃條件下過夜培養(yǎng)；剩余樣品使用已滅菌剪刀剪碎置于研缽中，加入適量無菌PBS，反復(fù)加入液氮研磨，研磨破碎數(shù)次后，將該勻漿液轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，然后在3000，4 ℃低溫離心30 min，隨后使用10 mL無菌注射器取上清液，經(jīng)0.22 μm一次性無菌濾器過濾至無菌15 mL離心管中，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

FHM細(xì)胞用參考文獻(xiàn)[10]方法對細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇并傳代培養(yǎng)，隨后將狀態(tài)好的細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，分為三組，一組正常培養(yǎng)作為空白對照，一組添加50 μL無菌PBS作為陰性對照，一組添加等量過濾上清液為實(shí)驗(yàn)組，每組三個平行，每日置于顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，待實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞出現(xiàn)80%以上CPE病變時，繼續(xù)按照以上方法盲傳三代，穩(wěn)定能看到細(xì)胞CPE病變，隨后將收獲的病毒液于-80 ℃保存。

1.4 病毒滴度測定及細(xì)胞敏感性比較

將以上CGSIV病毒懸液按照10倍倍比稀釋，稀釋12個梯度備用；參考江育林等的方法進(jìn)行病毒滴度(TCID)測定，計(jì)算CGSIV在細(xì)胞系中感染的滴度。

1.5 電鏡樣品制備

將1.3中盲傳兩代的病毒懸液接種于鋪滿FHM細(xì)胞的 T25 細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞出現(xiàn)明顯CPE后，收集細(xì)胞培養(yǎng)物，室溫下1 000離心30 min，去除細(xì)胞培養(yǎng)液，收集細(xì)胞沉淀，并將其轉(zhuǎn)移至細(xì)胞固定液中，4 ℃避光保存24 h，樣品送由賽維爾公司進(jìn)行切片處理，置于透射電子顯微鏡下觀察、拍照。

1.6 分子克隆鑒定

將患病死亡大鯢的肝臟、脾臟、頭腎及肌肉組織的總DNA使用 Omega DNA 提取試劑盒進(jìn)行提取。參考文獻(xiàn)[11]中GSIV病毒主要衣殼蛋白(MCP)基因高度保守序列設(shè)計(jì)引物，引物如下：GSIV-F:5′-GACTTGGCCACTTATGAC-3′；GSIV-R：5′-GTCTCTGGAGAAGAAGAA-3′。參考江育林等PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件，以上述提取的總DNA為模板，擴(kuò)增MCP保守序列，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，隨后送由華大基因(廣州)股份有限公司進(jìn)行測序。

1.7 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列分析

將測序得到的序列在BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.g2ov/Blast.cgi)上進(jìn)行比對分析,然后選取 GenBank 中與測得序列相似的參考毒株MCP序列，采用分子生物學(xué)分析軟件clustl X,和Mega 6.07構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 患病大鯢主要癥狀

患病大鯢初期出現(xiàn)食欲廢絕，行動緩慢，長時間伏于水底，皮膚大量分泌粘液；感染后期，患病大鯢出現(xiàn)腹部腫脹(圖1)，下頜和四肢充血(圖1 A)，背部出現(xiàn)大量出血點(diǎn)(圖1 B)，口腔潰瘍。隨著感染加劇，體表及四肢出血點(diǎn)增多擴(kuò)大，開始潰爛，出現(xiàn)潰瘍；解刨可見其體內(nèi)肝臟、脾臟、腎等免疫器官腫脹(圖1 C)，肺部充血并存在大量出血點(diǎn)，腹腔及腸道內(nèi)充滿黃色液體。發(fā)病一周內(nèi)，患病大鯢相繼死亡。

圖1 CGSIV 感染大鯢的臨床表現(xiàn)與剖解變化Fig.1 Clinical signs and anatomy changes of Chinese giant salamanders infected with CGSIVA；患病大鯢；B患病大鯢體表；C患病大鯢腹腔

2.2 分離病毒引起細(xì)胞病變

患病大鯢肌肉、脾臟、頭腎及肝臟鏡檢無異常。從患典型癥狀的患病大鯢病灶組織取樣,于LB固體平板和BHI固體平板上分別過夜培養(yǎng)后,均未分離到細(xì)菌，本次患病死亡大鯢癥狀與虹彩病毒感染引發(fā)的癥狀相同，而該病毒又能引起FHM細(xì)胞出現(xiàn)典型CPE病變(圖2I)，故采用該細(xì)胞系進(jìn)行回復(fù)感染實(shí)驗(yàn)，同時分離該病毒。病鯢組織經(jīng)液氮研磨過濾除菌后，感染本實(shí)驗(yàn)室保存的細(xì)胞系FHM。盲傳第一代時，F(xiàn)HM細(xì)胞經(jīng)感染后，出現(xiàn)腫脹和破裂，仍有大量細(xì)胞貼壁；但盲傳幾代后，F(xiàn)HM細(xì)胞出現(xiàn)腫脹和破裂時間變短，大量細(xì)胞脫落。結(jié)果表明，F(xiàn)HM是CGSIV的敏感細(xì)胞系，多次感染使得CGSIV的毒性加強(qiáng)，感染FHM時間加快。

圖2 CGSIV 感染FHM細(xì)胞后的細(xì)胞病變效應(yīng)Fig.2 Cytopathic effect in FHM cells infected with CGSIV

2.3 大鯢虹彩病毒在FHM細(xì)胞中的滴度及病毒粒子形態(tài)

根據(jù)TCID計(jì)算CGSIV在FHM細(xì)胞中的滴度，結(jié)果表明CGSIV在FHM細(xì)胞中的滴度為10TCID/mL 。經(jīng)透射電鏡觀察被感染細(xì)胞，可見細(xì)胞內(nèi)存在大量直徑約100～120 nm、具有囊膜的正六邊形病毒顆粒(圖 3)。

圖3 GSIV 感染 FHM 細(xì)胞的超薄切片電鏡觀察Fig.3 Electron microscopy observation of CGSIV in infected FHM cellsA,B,C：透射電鏡下同一視野下不同放大倍數(shù)病毒顆粒

2.4 MCP基因鑒定與序列分析

從患病死亡大鯢肌肉、脾臟、頭腎及肝臟等組織樣品基因組DNA中均擴(kuò)增到預(yù)期大小431 bp的DNA片段(圖4)；測序后進(jìn)行多序列比對分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該DNA序列和NCBI上蛙病毒屬病毒大鯢虹彩病毒(基因登錄號：ALL53143)的MCP蛋白編碼基因高度同源，高達(dá)99%(圖5)；結(jié)合病毒形態(tài)特征與PCR鑒定結(jié)果，確定引起本次大鯢突發(fā)性死亡的病毒為大鯢虹彩病毒。

圖4 CGSIV MCP 基因的 PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 PCR amplified products of the CGSIV MCP geneM：Marker；1：陰性對照；2：肌肉；3：脾臟；4：腎臟；5：肝臟

圖5 根據(jù)CGSIV MCP基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree based on CGSIV MCP gene sequence of isolated virus.“▲”：分離病毒CGSIV-GZ

3 討論

虹彩病毒是一類具有廣譜感染性的DNA病毒，既能感染脊椎動物，又能感染無脊椎動物，可感染宿主高達(dá)上百種。虹彩病毒病流行范圍廣泛，是水產(chǎn)養(yǎng)殖中常見的病毒性疾病。近些年來，我國已有虹彩病毒感染牛蛙()、鱉()、大鯢()、大菱鲆()、鱖()、牙鲆()、石首魚()和大口黑鱸()等引發(fā)死亡的報道。根據(jù)第十次國際病毒分類委員(International Committee on Taxonomy of Viruses， ICTV)會決定，將虹彩病毒科分為：腫大細(xì)胞病毒屬()、綠虹彩病毒屬()、虹彩病毒屬()、淋巴囊腫病毒屬()和蛙病毒屬()五個病毒屬。虹彩病毒科的病毒結(jié)構(gòu)相似，在透射電鏡下觀察呈六角形，二十面體對稱結(jié)構(gòu)，病毒粒子通常為120～200 nm，最大直徑可達(dá)350 nm。該科病毒不耐高溫，不耐強(qiáng)酸強(qiáng)堿；同時其囊膜極易被有機(jī)溶劑和胰蛋白酶破壞，感染能力大大降低。本研究從患病大鯢病灶處取樣，經(jīng)液氮反復(fù)充分研磨，可使病毒從細(xì)胞中釋放，且低溫不會使病毒失活，可以繼續(xù)感染細(xì)胞，隨后將被感染細(xì)胞由透射電鏡拍照，發(fā)現(xiàn)其非常符合虹彩病毒科形態(tài)特征結(jié)構(gòu)，初步判斷引起本次大鯢死亡的病因可能是被虹彩病毒科病毒感染。

由于不動桿菌屬()和氣單胞菌屬()等菌屬感染大鯢引起的病變與CGSIV感染的表型特征相似，同時有可能出現(xiàn)細(xì)菌與病毒混合感染的情況，因此患病大鯢臨床解剖結(jié)果只可作為初步判斷依據(jù)，尚需進(jìn)一步鑒定。本研究根據(jù)CGSIV的MCP蛋白序列高度保守區(qū)一對引物，從病鯢病灶脾臟和腎臟組織中擴(kuò)增出大約431 bp片段，經(jīng)公司測序及序列比對，發(fā)現(xiàn)該病毒屬于虹彩病毒科蛙病毒屬病毒。由此可見，引發(fā)本次野生大鯢突發(fā)性死亡的病因是虹彩病毒科蛙病毒感染所致。本研究所用檢測方法為常規(guī)PCR檢測，用時較長，同時需要專業(yè)人員在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行操作?，F(xiàn)如今隨著分子生物學(xué)技術(shù)和病毒分子生物學(xué)鑒定技術(shù)的發(fā)展，越來越多的新技術(shù)應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖病害檢測中。實(shí)時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)技術(shù)和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術(shù)已經(jīng)用于檢測CGSIV，相比于普通PCR檢測耗時短，操作簡單，更適合早期診斷。

本研究報道的患病大鯢初期出現(xiàn)的癥狀和后期病變均與國內(nèi)外報道的CGSIV感染癥狀相似。以往報道對大鯢以上病變，歸類與是細(xì)菌感染引發(fā)，通常都是以細(xì)菌做為主要病因來分析，并未進(jìn)行病毒分離檢測，因此出現(xiàn)此類癥狀，均被認(rèn)為是條件致病菌感染所致。在本次病發(fā)過程中，基層工作人員在此前從(未死亡)病鯢病灶部位分離到條件致病菌，做完藥敏試驗(yàn)后，根據(jù)藥敏結(jié)果給病鯢體表涂抹或口服抗菌藥物均無任何效果。外國學(xué)者DEBRA等在牛蛙()與林蛙()的研究中，同樣出現(xiàn)此種情況，他們認(rèn)為是由于CGSIV感染宿主，其免疫器官是病毒感染主要部位，導(dǎo)致宿主免疫力下降，使得宿主菌更易被致病菌感染，當(dāng)作為細(xì)菌病去治療時，并不能達(dá)到預(yù)期效果。綜合以上結(jié)果，發(fā)現(xiàn)并非本次感染主要病因，引發(fā)本次大鯢突發(fā)性死亡的病因是CGSIV。

研究表明，CGSIV感染發(fā)病速度快，極易擴(kuò)散，容易發(fā)生繼發(fā)性感染，死亡率高，市面上尚沒有CGSIV治療特效藥。CGSIV結(jié)構(gòu)復(fù)雜，病毒來源和感染宿主廣泛，在養(yǎng)殖過程中需要保證養(yǎng)殖池潔凈、餌料來源安全及按期消毒設(shè)施設(shè)備，以免病毒擴(kuò)散。王芳等和余波等發(fā)現(xiàn)患大鯢虹彩病毒病大鯢腹腔注射頭孢拉定和漁用氟苯尼考后，配合Vitamine C+E浸泡具有一定效果。將未患病大鯢連續(xù)一周浸泡黃芪多糖、電解多維和葡萄糖，提高大鯢免疫力，大大降低被感染的概率。同時國外研究學(xué)者COUPAR等發(fā)現(xiàn)阿昔洛韋(ACYCLOVIR)對CGSIV感染也具有一定抑制作用。此外，蜂膠、黃芪、菊花、人參、金銀花、芍藥等具有廣譜抗病毒作用的中草藥可以添加到日常餌料中，按時投喂，達(dá)到預(yù)防作用，但中草藥成分復(fù)雜、特異性差、作用機(jī)理、劑量、價格和效果不穩(wěn)定，且缺乏數(shù)據(jù)支撐，有待進(jìn)一步研究。而疫苗具有持續(xù)時間長、針對性強(qiáng)、安全系數(shù)高等優(yōu)點(diǎn)，是目前治療CGSIV感染最佳選擇之一。早在2013年，孫建濱等制備的兩種滅活疫苗對CGSIV感染具有非常好的療效。賈秋紅等通過對病鯢注射自制CGSIV滅活疫苗，治療期間同時注射自制的中西藥結(jié)合的抗病毒藥物，迅速遏制了CGSIV的傳播，使得該養(yǎng)殖場無持續(xù)死亡病例。而曾憲輝等以CGSIV的MCP基因構(gòu)建核酸疫苗，接種疫苗后的獲得高達(dá)73.3%的免疫保護(hù)率，表明該疫苗在CGSIV的預(yù)防過程中具有潛在的應(yīng)用價值。