劉 超，何 平，羅明有，王 松，周瑞平，劉 江，付雨晴，胡 斌，張 玉，唐代云

（1.四川省宜賓市敘府酒業(yè)股份有限公司，四川宜賓 644600；2.宜賓學(xué)院固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點實驗室，四川宜賓 644600；3.四川輕化工大學(xué)，四川宜賓 644600）

大曲是賦予白酒風(fēng)味的糖化劑和發(fā)酵劑，根據(jù)大曲不同的制曲頂溫可將其分為三類，分別是高溫大曲、中溫大曲、低溫大曲，其中高溫大曲主要運用于醬香酒生產(chǎn)，中溫大曲用于濃香酒的生產(chǎn)，低溫大曲用于清香型白酒生產(chǎn)。中溫大曲發(fā)酵頂溫一般在50～60 ℃，不同大曲原料和工藝參數(shù)略有不同，但步驟基本相同，中溫曲的制作主要分為原料的粉碎、成型、培菌、入庫儲存、使用等幾個階段。

在對中溫曲的研究中，胡曉龍等基于高通量測序?qū)χ袦卮笄ず颓奈⑸锶郝浣Y(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，表明曲皮中真菌群落多樣性和豐度均高于曲心樣品，曲心中細(xì)菌群落多樣性高于曲皮，豐度低于曲皮；唐賢華運用PCR-DGGE 技術(shù)探究不同發(fā)酵期與貯存期的中溫大曲微生物群落結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，發(fā)酵4～8 d 微生物數(shù)量達(dá)到頂峰，儲存期微生物種類基本穩(wěn)定，數(shù)量變化較大。

伴隨著白酒產(chǎn)量的不斷提升，對大曲的需求量也越來越大，傳統(tǒng)人工踩制已無法滿足需求。20世紀(jì)70 年代我國各大中型酒廠開始逐步試驗使用大曲壓塊機(jī)，機(jī)制曲在行業(yè)的使用比例日漸提高，但質(zhì)量與傳統(tǒng)人工曲相比還存在一定差異。林培等研究人工踩制和機(jī)械壓制對大曲的影響，人工曲在香氣程度、斷面整齊度、皮張厚度等方面均優(yōu)于機(jī)械曲；人工大曲的水分、酸度、糖化力、液化力略高于機(jī)制大曲，機(jī)制曲高級醇、醛類物質(zhì)遠(yuǎn)低于人工曲；傳統(tǒng)曲的細(xì)菌種類較機(jī)械曲少，真菌種類則比機(jī)械曲更為豐富。Wang 等基于高通量測序也研究了傳統(tǒng)和機(jī)械大曲的微生物群落結(jié)構(gòu)。本研究利用高通量測序技術(shù)結(jié)合理化檢測對人工與機(jī)制中溫大曲的微生物群落結(jié)構(gòu)和理化差異進(jìn)行分析比較，意在找出二者理化與微生物差異的原因，為改善大曲的品質(zhì)提供參考意見。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

曲樣：取夏季生產(chǎn)儲存6 個月達(dá)到使用條件的機(jī)制曲和人工曲各20 塊，粉碎后混合均勻再各取200 g 裝進(jìn)無菌密封袋，人工曲標(biāo)記為DQ01，機(jī)制曲標(biāo)記為DQ02，每個樣品取3 個平行樣，高通量試樣保存于-20 ℃冰箱等待DNA提取。

試劑及耗材：酚酞指示劑、95 %乙醇、氫氧化鈉、鄰苯二甲酸氫鉀、冰醋酸、乙酸鈉、葡萄糖、硫酸銅、丙三醇、碘化鉀、可溶性淀粉、硫酸、鹽酸，成都市科龍化工試劑廠。

儀器設(shè)備：烘箱；電熱恒溫水浴鍋，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；Pico-21 臺式離心機(jī)，Thermo Fisher 公司；GL-88B 漩渦混合器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；TND03-H-H 混勻型干式恒溫器，深圳拓能達(dá)科技有限公司；DYY-6C 型電泳儀電源，北京市六一儀器廠；DYCZ-21 電泳槽，北京市六一儀器廠；Biodoc-IT凝膠成像系統(tǒng)，美國UVP公司；Qubit?3.0 熒光計，Invitrogen 公司；T100PCR儀，美國BIO-RAD公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取

具體提取步驟參照OMEGA 試劑盒E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit 的試劑盒使用說明書（網(wǎng)址鏈接：http://omegabiotek.com/store/product/soil-dna-kit/）。

1.2.2 PCR 擴(kuò)增

細(xì)菌基因PCR 擴(kuò)增所用引物采用Miseq 測序平臺的V3—V4通用引物。

338F 引 物：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′。

806R 引 物：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。

真菌基因PCR所用引物為ITS1-2通用引物。

ITS1F 引物：5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′。

ITS2R 引物：5′GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′。

真菌、細(xì)菌PCR 條件均為：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，25次循環(huán)后，72 ℃延伸5 min，10 ℃保持至停止。PCR 擴(kuò)增后，產(chǎn)物用2 %瓊脂糖進(jìn)行電泳檢測，回收產(chǎn)物再用Qubit3.0 試劑盒進(jìn)行精確定量，最后在Miseq平臺完成測序。

1.2.3 大曲理化指標(biāo)的測定方法

大曲理化指標(biāo)檢測參考Q/WLYJ07.05LHY。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

測序數(shù)據(jù)使用R 語言制作Venn 圖、稀釋曲線圖及優(yōu)勢門、屬的堆疊柱狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 理化指標(biāo)檢測（表1）

表1 大曲理化指標(biāo)

由表1 可知，機(jī)制曲酸度、發(fā)酵力較人工曲高，水分、糖化力、液化力比人工曲低，可能是制曲時機(jī)制曲的提漿效果不如人工曲，使得其發(fā)酵初期升溫快、濕度高，有利于細(xì)菌生長代謝，從而產(chǎn)生更多的酸類物質(zhì)，但后期儲存的過程中保水能力差，不利于微生物的生長，尤其是霉菌，霉菌是產(chǎn)糖化酶、液化酶的主要菌種，導(dǎo)致機(jī)制曲糖化力、液化力稍低于人工曲。機(jī)制曲酸度更大的環(huán)境適于酵母的生長，讓酵母成為了相對的優(yōu)勢菌種，體現(xiàn)在大曲指標(biāo)上就是機(jī)制曲擁有更高的發(fā)酵力。

2.2 Alpha多樣性分析（表2）

表2 為不同制曲方式大曲的真菌和細(xì)菌Alpha多樣性指數(shù)，在97 %一致性的水平上完成樣品的Alpha 多樣性指數(shù)分析。Coverage 值為樣本序列的覆蓋率，Coverage 值的大小和樣本中物種被檢測出來的幾率成正比，樣本檢測顯示Coverage 數(shù)值達(dá)到0.99，即認(rèn)為本次測序結(jié)果可以代表樣本的真實情況，達(dá)到準(zhǔn)確反映細(xì)菌、真菌群落的種類及結(jié)構(gòu)的要求。在不同制曲方式中溫大曲中，人工曲DQ01樣品真菌的Ace、Chao1、Shannon 指數(shù)均高于機(jī)械曲DQ02，而Simpson 指數(shù)低于DQ02，說明人工曲檢出真菌物種總數(shù)較多且分布均勻；DQ01 細(xì)菌的Ace、Chao1 指數(shù)均低于DQ02，說明DQ02 細(xì)菌群落較DQ01 更為豐富。結(jié)合理化初步分析造成機(jī)制曲與人工曲細(xì)菌和真菌豐富度和多樣性差異的原因為機(jī)制曲壓曲較為緊實，水分揮發(fā)較慢，發(fā)酵初期溫度高、濕度高、厭氧的環(huán)境給細(xì)菌生長繁殖創(chuàng)造了有利條件，人工曲更為疏松，水分及時揮發(fā)有利于真菌的生長。

表2 Alpha多樣性分布表

圖1（A）直觀反映了不同制曲方式大曲樣品中細(xì)菌共有的OTU 及特有的OTU，由圖1（A）可知，機(jī)械和人工曲樣品中細(xì)菌共同的OTU 有52 個，機(jī)械曲特有的OTU 為11 個，人工曲特有OTU 僅為2個；由圖1（B）可知，在真菌方面共有的OTU 有32個，機(jī)械曲特有OTU 為2 個，人工曲特有OTU 為6個。說明機(jī)制曲在細(xì)菌方面多樣性更好，人工曲的真菌多樣性更豐富，可以反映出兩者理化存在差異，機(jī)制曲更適合細(xì)菌生長。

圖1 細(xì)菌和真菌在屬水平韋恩圖

2.3 微生物群落結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)測序結(jié)果首先在門水平上對樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，由圖2（A）可知，DQ01 中細(xì)菌在門水平上檢出相對豐度前5的分別是變形菌門Proteobacteria(70.35 %)、厚壁菌門Firmicutes(12.01 %)、藍(lán)藻門Cyanobacteria_Chloroplast(8.82 %)、未分類的細(xì)菌門unclassified_Bacteria(7.85%)、其他Other(0.97%)，DQ02 在門水平上檢出的豐富度前4 依次是變形菌門Proteobacteria(87.38 %)、厚壁菌門Firmicutes(9.37 %)、藍(lán)藻菌門Cyanobacteria _ Chloroplast(1.51 %)、其他Other(1.74 %)。不管是機(jī)械還是人工曲變形菌門和厚壁菌門都是優(yōu)勢門，機(jī)械曲中兩者的相對豐度更是達(dá)到了96.75 %，兩者的優(yōu)勢地位與Zhang等對清香型大曲細(xì)菌組成及多樣性研究基本相似，制曲溫度不同兩者在豐富度上也各有差異，樊建輝研究陶香型大曲也證實厚壁菌門為優(yōu)勢菌門，其次為變形菌門，王曉丹用高通量測序?qū)︶u香大曲進(jìn)行研究，檢出的細(xì)菌門主要為厚壁菌門、變形菌門等，即在門水平上機(jī)械與人工曲細(xì)菌的多樣性較為相似，但藍(lán)藻菌門相對豐度僅為人工曲的1/8 左右，可能是機(jī)制曲水分含量低不適于藍(lán)藻菌門生長繁殖。真菌方面DQ01 門水平上豐富度前4 的依次為毛霉門Mucoromycota(52.53%)、子囊菌門Ascomycota(43.78 %)、未分類的unclassified(3.05%)、其他Other(0.64%)，DQ02 檢測出子囊菌門Ascomycota(91.65 %)、毛霉門Mucoromycota(6.71 %)、未分類的unclassified(1.54 %)、其他Other(0.1 %)?？梢园l(fā)現(xiàn)子囊菌門和毛霉門占據(jù)菌群的絕大部分相對豐度，郭敏對傳統(tǒng)與機(jī)械醬香大曲制曲過程中的微生物進(jìn)行研究，顯示子囊菌門在入房、一翻、二翻、出房中均為第一大優(yōu)勢門，前三階段相對豐度超99%，李申奧對兼香高溫大曲的研究及Hu對白云邊大曲的研究同樣得出子囊菌門為最優(yōu)勢菌門。DQ02 中子囊菌門與毛霉門相對豐度差值達(dá)84.94 %，造成二者差異的原因可能為機(jī)制曲緊實且翻曲次數(shù)少，發(fā)酵溫度高不利于毛霉門菌類的生長。

圖2 門水平的群落結(jié)構(gòu)分析圖

圖3 屬水平的群落結(jié)構(gòu)分析圖

屬水平結(jié)果顯示，人工曲細(xì)菌屬相對豐度情況為未分類腸桿菌屬unclassified_ Enterobacteriaceae(68.84%)、鏈球菌屬(8.82%)、未分類細(xì)菌屬unclassified_Bacteria(7.85 %)、Other(3.7 %)、葡萄球菌屬(3.5 %)、魏斯氏菌屬(2.48 %)、片球菌屬(2.24 %)、乳桿菌屬(1.56 %)、芽孢桿菌屬(1.02 %)，機(jī)械曲細(xì)菌屬相對豐度為不動桿菌屬(80.52 %)、其他Other(5.26 %)、未分類腸桿菌屬unclassified_Enterobacteriaceae(3.49 %)、乳桿菌屬(2.44 %)、假單胞菌屬(1.91%)、片球菌屬(1.87%)、魏斯氏菌屬(1.68 %)、(1.51 %)、高溫放線菌屬(1.33%)。

人工曲中腸桿菌屬和鏈球菌屬占據(jù)相對豐度優(yōu)勢，劉雄對中、高溫大曲固態(tài)發(fā)酵過程微生物菌群結(jié)構(gòu)變化的研究表明腸桿菌屬和鏈球菌屬在中、高溫曲中為優(yōu)勢菌種，發(fā)酵結(jié)束時腸桿菌屬在中、高溫曲中相對豐度分別為77 %、83 %，機(jī)制曲中不動桿菌屬為絕對優(yōu)勢菌種。資料顯示，腸桿菌屬一條代謝路徑的主要終產(chǎn)物為混合有機(jī)酸，包括琥珀酸、乳酸、乙酸和甲酸，另一代謝路徑的主要產(chǎn)物為中性溶劑，包括乙醇和丁二醇，腸桿菌屬在紅腐乳后酵期發(fā)酵過程中還與賴氨酸、苯丙氨酸等大部分氨基酸呈顯著正相關(guān)，促進(jìn)腐乳中氨基酸濃度的升高；不動桿菌屬因其含有豐富的酯水解酶，能促進(jìn)辛酸乙酯的合成，與以辛酸乙酯為主酯類的風(fēng)味化合物呈正相關(guān)，據(jù)報道不動桿菌屬還與制曲過程中吡嗪類物質(zhì)的合成有關(guān)；葡萄球菌屬可以產(chǎn)生3-甲基-1-丁醇和乙偶姻等風(fēng)味物質(zhì)，成為白酒風(fēng)味物質(zhì)的前體；乳桿菌屬與魏斯氏菌屬具備代謝產(chǎn)生乙酸、乳酸等有機(jī)酸的能力，這些酸是白酒中重要的風(fēng)味成分；魏斯氏菌屬還具有一定耐酸性，能分解葡萄糖產(chǎn)二氧化碳；高溫放線菌屬耐高溫、生長快、可產(chǎn)蛋白酶及纖維素酶，酶在較高溫度下仍能保持酶活及穩(wěn)定性，是白酒風(fēng)味物質(zhì)的重要來源；芽孢桿菌有較強(qiáng)的蛋白和淀粉分解能力，為美拉德反應(yīng)初期生成阿馬多利化合物提供充足的原料，為提升酒質(zhì)的重要菌種。

人工曲真菌屬相對豐度前9 為毛霉屬(36.05%)、伊薩酵母屬(18.41%)、根霉屬(15.77 %)、曲霉屬(7.81 %)、其他Other(6.87 %)、假絲酵母屬(5.4 %)、芽生葡萄孢酵母屬(3.4 %)、嗜熱真菌屬(3.26 %)、未分類真菌屬unclassified(3.05 %)，機(jī)械曲為伊薩酵母屬(71.36 %)、嗜熱真菌屬(11.02 %)、毛霉屬(6.37 %)、其他Other(4.63 %)、孢圓酵母屬(3.25%)、生絲畢赤酵母屬(1.81 %)、未分類真菌屬unclassified(1.54 %)，人工曲霉菌屬的相對豐度占總豐度約60%，酵母屬占總豐度約30%，機(jī)制曲酵母的相對豐度約80 %，其余僅剩少量的嗜熱真菌及霉菌。液化酶、糖化酶、酯化酶、纖維素酶、果膠酶等主要來源于霉菌，霉菌降解淀粉產(chǎn)生葡萄糖供其他微生物利用，是白酒釀造中的動力源泉。根霉在大曲發(fā)酵過程中菌絲體生長至曲醅內(nèi)部，分泌各種酶到曲醅環(huán)境中促進(jìn)曲的成熟，也具有產(chǎn)乙醇、甲基丁酮等風(fēng)味物質(zhì)的能力；毛霉屬作為大曲中極為重要的霉菌，主要富集于制曲的低溫培菌期，能分泌蛋白酶促進(jìn)曲的分解；曲霉主要分泌酸性水解酶，例如酸性淀粉酶、酸性蛋白酶等，這些酶具有耐乙醇、耐酸的特性，使其能夠在酸性發(fā)酵條件下酶解原料中的淀粉和蛋白質(zhì)，為發(fā)酵提供動力，牟穰等研究黃酒生產(chǎn)過程中微生物及風(fēng)味的關(guān)聯(lián)顯示，曲霉屬與異戊醇、異丁醇、乙酸乙酯、己酸乙酯等風(fēng)味物質(zhì)有關(guān)；伊薩酵母屬是一種廣泛存在于釀酒生產(chǎn)中、能夠產(chǎn)生乙醇的酵母屬，具有耐熱性好、耐酒精能力強(qiáng)和乙酸乙酯產(chǎn)生量高，產(chǎn)異戊醇和正丙醇能力比釀酒酵母低2～3倍的特點；假絲酵母屬在大曲發(fā)酵過程中是非常重要的真菌，產(chǎn)酒精以及酯類物質(zhì)，如異戊酸、苯乙醛、辛酸乙酯等，也可產(chǎn)生酚類、酮類和烯類等揮發(fā)性香味化合物，對大曲質(zhì)量起到積極的影響。譚崇堯研究不同地域濃香型大曲微生物結(jié)構(gòu)得出：不論是北方派、長江中游派、江淮派、川派，嗜熱真菌屬為共有的優(yōu)勢真菌；孫利林分析了不同廠醬香大曲的微生物菌群結(jié)構(gòu)以及楊少勇對襄陽地區(qū)高溫大曲和中高溫大曲真菌多樣性解析也都表明嗜熱真菌屬為優(yōu)勢真菌，說明嗜熱真菌屬基本沒有地域差異。機(jī)制與人工曲兩者真菌相對豐度不同主要由機(jī)制曲前期升溫較快較高，后期水分較少造成。

為探究機(jī)械和人工大曲樣品在類群上的相似性程度，從制曲方式物種兩個層面進(jìn)行了聚類分析，并繪制出相對豐度聚類熱圖，更加直觀的體現(xiàn)大曲樣品細(xì)菌及真菌屬在組間豐度和樣本間多樣性的異同，顏色深淺代表的是物種豐度。由圖4 可知，橫向聚類分析結(jié)果顯示DQ01 與DQ02 不管在細(xì)菌還是真菌屬上均可分為一類，縱向表示不同物種在制曲方式間豐度的相似性情況。細(xì)菌聚類熱圖分析結(jié)果顯示，和unclassified_Enterobacteriaceae豐度相似性較大，和物種豐度相似性較大，和豐度相似性好；真菌聚類熱圖結(jié)果顯示，和、和、與的豐度相似性好。

圖4 微生物群落聚類樹形圖

3 結(jié)論

本研究以存儲6 個月機(jī)制曲和人工曲為研究對象，采用高通量測序技術(shù)對兩者的微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性進(jìn)行分析，并輔以理化檢測，結(jié)果表明：在細(xì)菌屬中，人工曲以腸桿菌屬、鏈球菌屬、葡萄球菌屬、魏斯氏菌屬、片球菌屬、乳桿菌屬、芽孢桿菌屬為主；機(jī)制曲以不動桿菌屬、腸桿菌屬、乳桿菌屬、假單胞菌屬、片球菌屬、魏斯氏菌屬、鏈球菌屬、高溫放線菌屬為主；在真菌屬中，人工曲優(yōu)勢菌種為毛霉屬、伊薩酵母屬、根霉屬、曲霉屬、假絲酵母屬、芽生葡萄孢酵母屬、嗜熱真菌屬；機(jī)制曲則為伊薩酵母屬、嗜熱真菌屬、毛霉屬、孢圓酵母屬、生絲畢赤酵母屬。機(jī)制曲酸度、發(fā)酵力較人工曲高，糖化力、液化力較人工曲低，導(dǎo)致兩者微生物及理化差異的主要原因可能是機(jī)制曲緊實度與水分含量高、提漿效果較差，發(fā)酵初期高溫高濕厭氧的條件利于細(xì)菌生長，產(chǎn)酸類物質(zhì)多，且不利產(chǎn)糖化酶、液化酶的霉菌生長，這也與測序結(jié)果相印證，機(jī)制曲細(xì)菌多樣性較好，真菌多樣性差，豐富度集中在少數(shù)菌種上，而人工曲剛好相反，細(xì)菌多樣性較差，真菌多樣性較好，豐富度在每個菌種上分布均勻。對機(jī)制和人工曲微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性差異的后續(xù)研究還需在考慮生長環(huán)境的基礎(chǔ)上結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)以及蛋白質(zhì)組學(xué)開展。本研究為了解采用不同制曲方式的大曲微生物群落結(jié)構(gòu)的差異提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，同時對改進(jìn)制曲工藝，針對不同制曲方式“對癥下藥”有極大幫助。