霍鵬，曹俊娜，李曼，姚軍*，張順*

（1.桂林醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，廣西 桂林 541199；2.桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，廣西 桂林 541001）

0 引言

牡丹屬毛茛科芍藥屬多年生灌木植物，油用牡丹種類更是我國獨(dú)有的土生土長的木本油料作物，牡丹籽不但產(chǎn)油量高，而且不飽和脂肪酸含量非常豐富，尤其是n-3PUFAs的中的ALA，其含量高達(dá)42%。N-3PUFAs是一類人體必須的脂肪酸，主要包括α-亞麻酸（ALA）、二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DHA）等，不能由動(dòng)物自身合成，必須通過外源攝取。N-3PUFAs作用廣泛，可增強(qiáng)青少年視力、促進(jìn)大腦發(fā)育、抗癌、抗炎、減肥等作用[1]，近年來其在生殖健康領(lǐng)域的研究也方興未艾[2]。ALA作為n-3PUFAs家族的重要一種，在雄性的精液質(zhì)量方面的作用被相繼報(bào)道，研究顯示在家兔飼糧中添加富含ALA的日糧可通過改變精子脂質(zhì)組成改善精子質(zhì)量[3]；飼喂富含ALA的亞麻籽可以在體內(nèi)通過碳鏈的延長顯著增加公牛精子DHA 的含量，而且也可以改善精子冷凍和解凍后損傷和質(zhì)膜的組成成分，提高解凍后精液的質(zhì)量[4]。此外，飼糧中添加亞麻籽油可改善蛋雞的精液品質(zhì)、生殖激素及與睪酮合成相關(guān)的基因和蛋白表達(dá)[5]。但是牡丹籽油作為含ALA最為豐富的油脂資源之一，其在雄性生殖方面的研究尚未見報(bào)道，本研究擬通過構(gòu)建不育大鼠模型，探討牡丹籽油在改善大鼠模型精液質(zhì)量以及生育力方面的效用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

體重約250-280g的健康SD雄鼠290只（6周齡），SD雌鼠100只，置于溫度(24±1)℃、濕度(60±5)℃，12小時(shí)明暗交替環(huán)境適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。飼料為SPF級(jí)大鼠飼料，墊料為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物專用玉米芯墊料，使用前經(jīng)高壓蒸汽滅菌。

1.2 主要藥品試劑

白消安、二甲基亞砜（DMSO）等購自Sigma 公司；受精液等購自深圳妙泉儀器設(shè)備有限公司，牡丹籽油購自稱山西潞安石圪節(jié)智華生物科技有限公司。取200mg白消安粉末溶于20mLDMSO溶液中，完全溶解后，將濃度為10mg/mL的白消安分裝于1.5mL Eppendorf 離心管中，4℃避光保存?zhèn)溆?，注射前將該濃?chǔ)液用滅菌生理鹽水1：9稀釋（1mg/mL）用于注射。

1.3 方法

1.3.1 不育雄性大鼠模型構(gòu)建與鑒定

連續(xù)10天按4mg/kg的劑量白消安每日注射SD大鼠腹腔，累計(jì)注射劑量40 mg/kg，以SD大鼠連續(xù)注射第10天為模型第0 d（D0）。于注射后D30采集精液。陰性對照組腹腔注射等量DMSO+生理鹽水。注射結(jié)束后取30只大鼠脫臼處死檢查精液質(zhì)量，首先將睪丸擠入腹腔，腹部皮膚消毒，于腹中線開口，取出附睪，從附睪尾部擠出乳白色精子團(tuán)，將精子移入1 mL受精液中，二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5-10 min，吹打混勻，進(jìn)行精子計(jì)數(shù)。取10μL精液，置于精子計(jì)數(shù)板上，靜置1-2min鐘顯微鏡下觀察；精子畸形檢查參照蘇木精-伊紅染色法。

1.3.2 添加牡丹籽油飼料飼喂

將上述鑒定成功的雄性不育SD大鼠模型隨機(jī)分為兩組，對照組(常規(guī)日糧)、實(shí)驗(yàn)組(常規(guī)日糧+20%牡丹籽油)，喂養(yǎng)12周后進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 精液質(zhì)量檢測及生育力檢查

精液檢查同1.3.1；睪丸組織切片步驟為：脫頸椎處死后取睪丸組織，將模型組、牡丹籽油飼喂組以及陰性對照組睪丸取出后切開鞘膜，4%福爾馬林分裝固定。經(jīng)過脫水、包埋、切片，以蘇木精-伊紅染色制片，顯微鏡觀察各組睪丸組織并攝片。余SD不育大鼠模型及對照組與雌性SD大鼠1:1合籠，觀察雄鼠爬背情況，次日早檢查陰道栓，可見陰道栓者初步判為交配成功，統(tǒng)計(jì)產(chǎn)仔情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用(±s)表示，比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率(%)表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。。

2 結(jié)果

2.1 雄性不育SD大鼠模型的構(gòu)建與鑒定

白消安注射構(gòu)建模型D30進(jìn)行精液檢查，結(jié)果如表1所示，與對照組相比，模型組精液在精子密度、精子活力、前向運(yùn)動(dòng)精子比例以及精子畸形率上均顯著下降，鑒定結(jié)果顯示連續(xù)10次注射白消安大鼠腹腔，可成功構(gòu)建精液質(zhì)量明顯下降的雄性不育大鼠模型。

表1 白消安注射構(gòu)建模型D30大鼠的精液情況(±s)

表1 白消安注射構(gòu)建模型D30大鼠的精液情況(±s)

注：列內(nèi)具不同上標(biāo)的值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義a，b，P<0.05.

組別 鼠數(shù) 精子密度 精子活力 A+B級(jí)精子 精子畸形率模型組 10 7.14±1. 31a 31.45±4. 23a 7.22±1. 46a 97.24±2.56a對照組 10 51.11±2.25b 63.49±2.13 b 32.53±3.42b 85.78±3. 77b

2.2 飼喂牡丹籽油日糧對雄性不育大鼠模型精液質(zhì)量的影響

（1）不育大鼠模型分別經(jīng)常規(guī)日糧和添加20%比例牡丹籽油的日糧飼喂12周后，精液質(zhì)量如表2所示，精子密度、精子活力、前向運(yùn)動(dòng)精子比例以及正常精子比例，牡丹籽油組均顯著高于常規(guī)日糧組，精子形態(tài)學(xué)檢查如圖1。結(jié)果表明牡丹籽油能夠顯著改善不育大鼠模型的精子質(zhì)量。

圖1 精子形態(tài)學(xué)檢查

表2 常規(guī)日糧和添加牡丹籽油日糧飼喂后精子質(zhì)量情況(±s)

表2 常規(guī)日糧和添加牡丹籽油日糧飼喂后精子質(zhì)量情況(±s)

注：列內(nèi)具不同上標(biāo)的值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義a，b，P<0.05.

組別 鼠數(shù) 精子密度 精子活力 A+B級(jí)精子 精子畸形率模型組 25 13.16±2. 38a 36.21±2. 21a 11.28±1. 47a 94.24±2.56a牡丹籽油組 25 34.92±2.25b 51.42±3.43 b 27.51±3.65b 87.72±3. 43b

（2）飼喂牡丹籽油日糧對雄性不育大鼠模型睪丸組織形態(tài)的影響

不育模型組整個(gè)睪丸組織嚴(yán)重萎縮，極度退化變性，精曲小管萎縮變細(xì)疏松，管腔內(nèi)各級(jí)生精細(xì)胞呈明顯的空泡化，基底膜側(cè)精原細(xì)胞偶見，精曲小管內(nèi)未見精子；間質(zhì)組織發(fā)生退化，細(xì)胞形態(tài)不完整，排列紊亂，總體表現(xiàn)基本喪失生精能力（圖2）。飼喂含有牡丹籽油的日糧后，可見大部分的精曲小管恢復(fù)2-4層生精上皮細(xì)胞，基底膜側(cè)可見散在精原細(xì)胞，整體表現(xiàn)仍為精子生成能力低下（圖3），組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn)與附睪精子質(zhì)量檢測結(jié)果一致，但是與對照組相比，生精能力僅為部分恢復(fù)（圖4）。

圖2 模型組睪丸形態(tài)學(xué)

圖3 對照組睪丸形態(tài)學(xué)

（3）飼喂牡丹籽油日糧對雄性不育大鼠模型對生育力的影響

將每只不育模型SD雄鼠單獨(dú)飼養(yǎng)，按1：1的比例與雌鼠合籠，觀察雄鼠爬背情況，次日早檢查陰道栓，見陰道栓者初步判為交配成功；產(chǎn)仔時(shí)，統(tǒng)計(jì)產(chǎn)仔率。結(jié)果如表5所示，與常規(guī)日糧組相比，牡丹籽油組的雄鼠的爬背發(fā)生率、見栓率以及產(chǎn)仔率上均顯著升高，而與未做任何處理的陰性對照組相比，仍顯著低于陰性對照組，以上結(jié)果表明牡丹籽油能在一定程度上改善雄性不育大鼠的生育力。

3 討論

3.1 牡丹籽油對雄性不育大鼠精液質(zhì)量的改善

近年來，由于受生育年齡推遲、環(huán)境改變、壓力增大、生育意愿低等原因，人口出生比例嚴(yán)重下降已經(jīng)是一個(gè)不可回避的社會(huì)問題，統(tǒng)計(jì)顯示約有15%左右的育齡期夫婦存在著生育障礙，其中男性因素引起的比例占約40%，最新的男性精液質(zhì)量調(diào)查報(bào)告顯示，男性精子質(zhì)量仍然有下降的趨勢[6]，雖然男性精液質(zhì)量下降可以通過輔助生殖手段解決生育需求，但是科學(xué)技術(shù)總是存在兩面性，輔助生殖技術(shù)畢竟還是一個(gè)未經(jīng)過歷史長期檢驗(yàn)的技術(shù)，在子代的表觀遺傳、畸形率、并發(fā)癥的長期觀測上還缺乏足夠相應(yīng)的數(shù)據(jù)支持[7]，因此，自然生育仍然是獲得子代的首選方式。

許多研究都表明n-3多不飽和脂肪酸對雄性動(dòng)物的精液有著顯著的提高作用，主要聚焦在DHA和EPA等長鏈n-3PUFAs的探討上，因?yàn)樗麄儾粌H是影響精子活力的精子質(zhì)膜的重要組成部分，而且有較強(qiáng)的抗氧化能力，因此在日糧中添加富含長鏈n-3PUFAs日糧中，可顯著改善豬、牛等動(dòng)物的精子活力、頂體完整性、精液量；降低畸形精子率和頂體異常比例；提高解凍后精液品質(zhì)，甚至于調(diào)控相關(guān)基因誘導(dǎo)精子的發(fā)生[8,9]。但是短鏈n-3PUFAs對精液質(zhì)量的探討較少，目前主要聚焦在亞麻籽及亞麻籽油對雄性生育能力的影響，研究顯示富含ALA的亞麻籽及亞麻籽油也能能顯著改善家畜的繁殖性能。牡丹籽油同樣作為含有ALA最為豐富的植物油脂之一，進(jìn)行雄性生育力影響的實(shí)驗(yàn)研究亦有著獨(dú)特的優(yōu)勢，在本研究中結(jié)果顯示牡丹籽油確實(shí)提高了大鼠模型的精液質(zhì)量，包括提升了精液密度，增強(qiáng)了精子活力，降低了畸形率，以上結(jié)果表明牡丹籽油對精子的發(fā)生和成熟有明顯的促進(jìn)作用，這和同樣作為ALA主要來源的亞麻籽油在動(dòng)物上的研究結(jié)果相似。因此牡丹籽油作為雄性動(dòng)物的n-3PUFAs的補(bǔ)充劑對于提高生育力及繁殖性能也有著同等重要的應(yīng)用潛力。

3.2 牡丹籽油對雄性不育大鼠模型生育力的改善

日糧中添加n-3PUFA 可提高多種雄性動(dòng)物的繁殖力，但是上述研究主要采用以富含長鏈n-3多不飽和脂肪酸的魚油為主要載體，而對于短鏈n-3多不飽和脂肪酸與雄性生育力的相關(guān)性研究不多見。通過人體內(nèi)的同位素追蹤技術(shù)，發(fā)現(xiàn)攝入的ALA有高達(dá)21%的轉(zhuǎn)化成EPA，有9%轉(zhuǎn)化成了DHA，轉(zhuǎn)化效率較為可觀[10]，因此飼喂富含ALA的日糧對促進(jìn)雄性動(dòng)物的生育力改善也有著充分的理論依據(jù)。文獻(xiàn)報(bào)道，在日糧添加了亞麻籽油的雄性動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)，可以顯著提高大鼠的血清睪酮水平，睪酮對維持睪丸生精功能起著至關(guān)重要的作用[11]，這一點(diǎn)與本研究中牡丹籽油促進(jìn)生精小管的有著相同的結(jié)局，此外隨著日糧中亞麻籽油的比例增高，其體內(nèi)的前列腺素也在增加，有研究表明前列腺素可直接刺激睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌睪酮，進(jìn)一步增加睪丸體積、精子數(shù)量以及提高精子的活動(dòng)能力。

本研究結(jié)果不僅從精液層面驗(yàn)證了牡丹籽油對精液質(zhì)量的改善作用，而且在形態(tài)組織學(xué)上進(jìn)行了驗(yàn)證，通過睪丸組織的免疫組化結(jié)果表明，牡丹籽油顯著改善了不育大鼠的生精功能。但是，雖然在牡丹籽油的毒理學(xué)檢測中，結(jié)果顯示牡丹籽油對精子質(zhì)量沒有促進(jìn)作用[12]，但是我們認(rèn)為因其實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的劑量和飼喂時(shí)間的區(qū)別，從而導(dǎo)致與本研究結(jié)果存在一定的出入，但是不存在相駁的結(jié)論，在另一項(xiàng)牡丹籽油對環(huán)磷酰胺致小鼠遺傳毒性和肝損傷的保護(hù)作用研究中，結(jié)果顯示日糧添加牡丹籽油確實(shí)提高了精液的質(zhì)量[13]。通過生育力檢測發(fā)現(xiàn)，牡丹籽油飼喂的不育SD大鼠模型的生育力得到了顯著的恢復(fù)，結(jié)果同文獻(xiàn)報(bào)道的飼喂長鏈n-3PUFAs的研究結(jié)果相一致，而且與亞麻籽油的結(jié)果相一致。

綜上所述，通過成功構(gòu)建雄性不育大鼠模型，進(jìn)行添加牡丹籽油的日糧飼喂，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)牡丹籽油不但能提高雄性不育大鼠的精液質(zhì)量，而且能夠部分恢復(fù)其生育功能，結(jié)果表明牡丹籽油確能有改善雄性生育能力的作用。