廖中廷，樊成偉，張發(fā)蓉，魏 靜，殷世玉，胡瓊英

(1.四川省資陽市人民醫(yī)院血液內(nèi)科，四川 資陽 641300；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川 成都 610072)

急性髓細(xì)胞性白血病 (acute myelocytic leukemia, AML)是人骨髓髓系干細(xì)胞前體的惡性腫瘤，在成人急性白血病中最為常見[1]。隨著蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)和表觀遺傳學(xué)的發(fā)展，AML的靶向研究日益受到關(guān)注；最新證據(jù)表明，AML細(xì)胞對(duì)線粒體功能的依賴性是AML細(xì)胞異質(zhì)性的能量來源，這一發(fā)現(xiàn)為AML的研究提供了新視角[2,3]。原兒茶酸 (protocatechuic acid, PCA)是原花青素、花青素等復(fù)合多酚類化合物的主要代謝產(chǎn)物，具有抗炎、抗氧化、抗癌等藥理活性作用[4,5]。研究顯示PCA可通過降低線粒體膜電位的消散、激活caspase-9和caspase-3及降低磷脂酰絲氨酸暴露，抑制過氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的血小板凋亡[6]。隨著PCA抗腫瘤作用的研究進(jìn)展，其在血液系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用日益引起人們的重視，但相關(guān)研究仍較少。本實(shí)驗(yàn)旨在探明PCA對(duì)AML細(xì)胞系HL60和KG-1α的細(xì)胞活性及線粒體功能的影響，以期為AML的發(fā)生提供新的證據(jù)，為AML靶向線粒體治療提供新的候選藥物。

1 材料與方法

1.1 材料本研究于2020年6～12月在成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室完成，所需細(xì)胞和試劑分別為：人髓系白血病細(xì)胞系HL60和KG-1α(飛鷗爾生物，成都)，細(xì)胞培養(yǎng)基MEM(Life Technologies，美國)，澳洲胎牛血清(Gibco，美國)，原兒茶酸(Sigma公司，美國)。

1.2 方法①細(xì)胞培養(yǎng)及CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力。復(fù)蘇HL60和KG-1α細(xì)胞后先加入含10%的胎牛血清培養(yǎng)基RPMI 1640，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3天后換液。對(duì)細(xì)胞懸浮、沉淀并計(jì)數(shù)，之后于96孔板上接種2×104個(gè)細(xì)胞/孔，加入不同濃度的PCA分別處理24 h后分析。為了檢測(cè)細(xì)胞活性，96孔板上接種2×103個(gè)細(xì)胞/孔，與10 μmol/L PCA共同孵育，在1～5天內(nèi)每天加入10 μl CCK-8試劑，4 h后檢測(cè)OD450的吸光度并繪制生長(zhǎng)曲線。②流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期。不同濃度的PCA分別處理HL60和KG-1α細(xì)胞24 h后，用溴化乙錠(PI)染色并進(jìn)行流式細(xì)胞分析檢測(cè)HL60和KG-1α細(xì)胞周期。③免疫印跡(Western blot)法分析細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白。用10 μmol/L PCA分別處理HL60和KG-1α細(xì)胞24 h后收集蛋白，應(yīng)用10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠分離20 μg總蛋白(細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白C-PARP、 C-Caspase-3和Caspase-3)，先用PVDF膜轉(zhuǎn)移免疫印跡，再使用5%的牛血清白蛋白PBS封閉；將1∶1000稀釋后的抗體，加至PVDF膜，然后再室溫孵育1 h。將PVDF膜用預(yù)冷的T-PBS清洗，再將1∶5 000稀釋后的辣根過氧化物酶偶聯(lián)抗兔二抗與PVDF膜室溫孵育30 min，T-PBS清洗3次后，曝光。④細(xì)胞活性氧(Reactive oxygen species, ROS)檢測(cè)。10 μmol/L PCA分別處理HL60和KG-1α細(xì)胞24 h，加入10 μmol/L MitoSOX熒光染料，在室溫避光條件下孵育10 min，棄去上清液，再加入預(yù)冷的5 ml PBS清洗三次后用熒光顯微鏡觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異采用student-t檢驗(yàn)和單向方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCA對(duì)AML細(xì)胞增殖活性的抑制情況細(xì)胞活力結(jié)果顯示HL6和KG-1α細(xì)胞對(duì)PCA化療敏感，PCA對(duì)HL60和KG-1α細(xì)胞作用的IC50分別是(21.73±0.2) μmol/L和(16.93±0.7) μmol/L；10 μmol/L PCA同時(shí)處理HL60和KG-1α 5天后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PCA可顯著抑制細(xì)胞活力(P<0.05)，見表1。

表1 PCA處理HL60和KG-1α細(xì)胞1～5天抑制細(xì)胞活力比較

2.2 PCA對(duì)AML細(xì)胞凋亡的促進(jìn)情況流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況發(fā)現(xiàn)：與對(duì)照組相比，PCA處理組可顯著促進(jìn)AML細(xì)胞HL60和KG-1α凋亡，見圖1；與之相似，在圖2中，Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白剪切形式的caspase-3(C-caspase-3)和PARP(C-PARP)在PCA處理組中明顯增加。

圖1 PCA促進(jìn)HL60和KG-1α細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞圖 a:AML細(xì)胞系HL60對(duì)照組；b:20 μmol/L PCA處理AML細(xì)胞系HL60組；c:AML細(xì)胞系KG-1α對(duì)照組；d:15 μmol/L PCA處理AML細(xì)胞系KG-1α組

圖2 PCA對(duì)AML細(xì)胞HL60和KG-1α促凋亡作用的蛋白免疫印跡圖

2.3 PCA對(duì)AML細(xì)胞線粒體ROS堆積的促進(jìn)情況對(duì)HL60和KG-1α細(xì)胞質(zhì)ROS進(jìn)行MitoSOX染色，結(jié)果表明：與對(duì)照組相比，PCA處理組細(xì)胞內(nèi)的線粒體ROC堆積明顯增多，加入ROS清除劑N-半胱氨酸(NAC)后，該現(xiàn)象被逆轉(zhuǎn)，見圖3；同時(shí)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，發(fā)現(xiàn)NAC加入后，PCA引起的細(xì)胞凋亡下降。見圖4。

圖3 PCA促進(jìn)AML細(xì)胞HL6和KG-1a線粒體ROS堆積的熒光顯微圖 a:AML細(xì)胞系HL60對(duì)照組；b:20 μmol/L PCA處理AML細(xì)胞系HL60組；c:20 μmol/L PCA處理AML細(xì)胞系HL60后+10 μmol/L NAC組；d：AML細(xì)胞系KG-1α對(duì)照組；e：15 μmol/L PCA處理AML細(xì)胞系KG-1α組；f:15 μmol/L PCA處理AML細(xì)胞系KG-1α后+10 μmol/L NAC組

圖4 PCA促進(jìn)AML細(xì)胞HL6和KG-1a線粒體ROS堆積的流式細(xì)胞圖 a:AML細(xì)胞系HL60對(duì)照組；b:20 μmol/L PCA處理AML細(xì)胞系HL60組；c:20 μmol/L PCA處理AML細(xì)胞系HL60后+10 μmol/L NAC組；d：AML細(xì)胞系KG-1α對(duì)照組；e：15 μmol/LPCA處理AML細(xì)胞系KG-1α組；f:15 μmol/L PCA處理AML細(xì)胞系KG-1α后+10 μmol/L NAC組

3 討論

近年來AML的治療取得了長(zhǎng)足發(fā)展，但復(fù)發(fā)問題仍十分棘手。針對(duì)復(fù)發(fā)/難治性AML的治療目前尚無標(biāo)準(zhǔn)，化療是常見的治療方案；含阿糖胞苷等新化療方案雖可提高復(fù)發(fā)/難治性AML的緩解率，但OS獲益仍小于1年；以FLAG方案為代表的化療方案，治療毒性較強(qiáng)，常伴有嚴(yán)重的血液學(xué)事件和感染[7,8]。目前學(xué)術(shù)界普遍認(rèn)為HSCT是唯一具有治愈復(fù)發(fā)/難治性AML的潛在方法，但移植條件苛刻，移植后并發(fā)癥難以控制[9]。新型靶向藥物的出現(xiàn)為AML治療提供了更多、更高效的選擇，因此不斷探索新的靶位點(diǎn)，成為AML治療的研究熱點(diǎn)[10]。

PCA是花青素的主要代謝產(chǎn)物之一，有較強(qiáng)的抗氧化活性[11]。Han等將PCA處理的內(nèi)皮細(xì)胞與棕櫚酸處理的細(xì)胞相比，發(fā)現(xiàn)PCA顯著降低了內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷的兩個(gè)生物標(biāo)志物3-硝基酪氨酸和8-羥基脫氧鳥苷，同時(shí)明顯降低了細(xì)胞內(nèi)ROS水平[12]。PCA也具有顯著的腫瘤抑制作用，在一項(xiàng)結(jié)直腸癌的治療研究中，研究者發(fā)現(xiàn)PCA通過氧化/抗氧化失衡，呈劑量依賴型顯著降低結(jié)直腸癌的細(xì)胞活力；PCA在癌細(xì)胞中誘導(dǎo)了促氧化作用，通過調(diào)節(jié)氧化還原平衡和抑制HO-1系統(tǒng)導(dǎo)致p21激活介導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞的凋亡[13]。已明確PCA的抗氧化功能和抗癌作用，但PCA在血液惡性疾病的作用研究報(bào)道較少，尤其是對(duì)線粒體的功能探索尚不明確，而后者對(duì)腫瘤的生存至關(guān)重要；目前靶向線粒體的抗腫瘤藥物較多，但對(duì)于血液系統(tǒng)惡性疾病尤其是AML仍需探索篩選。

本研究通過探索PCA對(duì)AML細(xì)胞增殖、凋亡情況，揭示PCA對(duì)AML細(xì)胞活性的抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比PCA能顯著抑制AML細(xì)胞HL6和KG-1a的增殖活性，同時(shí)促進(jìn)HL6和KG-1a的凋亡，促進(jìn)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的剪切。為了進(jìn)一步闡釋PCA抗腫瘤的機(jī)制，我們又檢測(cè)了PCA作用AML細(xì)胞HL6和KG-1a后，細(xì)胞內(nèi)線粒體的ROS變化情況，發(fā)現(xiàn)PCA的處理能引起細(xì)胞內(nèi)ROS堆積，而這種現(xiàn)象可被ROS清除劑NAC逆轉(zhuǎn)，且NAC的加入還能抑制PCA引起的HL6和KG-1a細(xì)胞凋亡。以上結(jié)果說明PCA引起的HL6和KG-1a細(xì)胞凋亡是通過增加細(xì)胞內(nèi)線粒體ROS堆積造成。

綜上，PCA抑制AML細(xì)胞活性是通過促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)線粒體ROS生成所致，這與國內(nèi)外已有的研究一致。通過明確PCA的抗AML作用，探討其作用機(jī)制和靶點(diǎn)，可為AML的治療提供新的思路。