楊浩輝 劉斌 李炳翰 范少凱 張艷淑

PD是一種多發(fā)于中老年期的第二大神經(jīng)變性疾病，臨床以運動遲緩、肌僵直、震顫為主要表現(xiàn)。同時，PD病人也常會出現(xiàn)一些非運動癥狀，例如抑郁、認知障礙、睡眠障礙、胃腸道障礙等，并且可能發(fā)生在運動障礙之前，成為預(yù)警疾病。抑郁癥是PD病人中最常見且更容易被忽視的一種非運動癥狀。有研究提示，35%～42%的PD病人出現(xiàn)抑郁表現(xiàn)[1]，嚴重影響著病人的預(yù)后及生活質(zhì)量。研究發(fā)現(xiàn)PD病人腦組織中小膠質(zhì)細胞呈現(xiàn)出顯著的激活狀態(tài)，提示小膠質(zhì)細胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可能參與PD的發(fā)生發(fā)展[2]。并且有研究證明，小膠質(zhì)細胞的自噬可抑制炎癥小體核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3, NLRP3)的激活[3]。近年來，NLRP3介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥被認為對PD的發(fā)病機制有深遠影響。NLRP3激活的caspase-1和IL-1β/IL-18是宿主免疫反應(yīng)的重要介質(zhì)[4]。實驗證明，NLRP3是促進神經(jīng)毒素MPTP誘導(dǎo)PD發(fā)病的關(guān)鍵炎癥小體，選擇性抑制NLRP3可減輕PD模型小鼠的行為缺陷和神經(jīng)炎性[5]。美多芭是左旋多巴和芐絲肼組成的復(fù)方制劑，是目前治療PD的常用臨床藥物，可有效緩解PD癥狀，但長期治療會引起諸多不良反應(yīng)，如姿勢不穩(wěn)、自主神經(jīng)功能紊亂等，并且其在非運動癥狀，如抑郁、睡眠、覺醒障礙等方面收效甚微[6]。丁苯酞是一種從芹屬種子中提取分離的化合物，是我國自主研發(fā)的用于治療缺血性腦卒中的藥物，它可以通過抑制炎癥反應(yīng)、保護線粒體功能、抗氧化應(yīng)激及減少細胞凋亡等機制保護神經(jīng)細胞。丁苯酞也可能通過上述機制對PD合并抑郁起到治療作用[7-8]。有學(xué)者通過體內(nèi)、體外實驗證實，丁苯酞不僅能抑制小膠質(zhì)細胞的激活，還能減少促炎因子的表達，從而起到抑制炎癥、保護多巴胺能神經(jīng)元的作用[9]。本文通過觀察丁苯酞對PD合并抑郁小鼠的NLRP3及小膠質(zhì)細胞標志蛋白IBA-1表達的影響，探討丁苯酞治療PD伴抑郁的效果及作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 6周齡C57雄性小鼠40只(25～30 g)，購自北京華阜康生物科技股份有限公司[許可證號：SCXK(京)2020-0004]，常溫適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。本動物實驗經(jīng)華北理工大學(xué)動物實驗倫理委員會審批通過(審批號：LAEC-NCST-2020082)。

1.2 主要試劑 NLRP3、IBA-1一抗購自Affinity公司，二抗(羊抗兔)購自美國KPL公司，β-actin購自美國Proeintech公司，二喹啉甲酸(BCA)試劑盒購自Affinity公司。

1.3 模型制備及分組處理 隨機選取10只小鼠為正常對照組，其余30只小鼠通過腹腔注射MPTP[30 mg/(kg·d)]7 d制備PD小鼠模型(均已通過轉(zhuǎn)棒試驗、懸掛試驗、爬桿試驗確認)，并對其進行不可預(yù)知溫和應(yīng)激刺激構(gòu)建PD伴抑郁小鼠模型。刺激包括：禁食、禁水、冷水游泳、熱烘、潮籠、晝夜顛倒、夾尾、束縛等，其中各項刺激隨機安排，每種刺激重復(fù)2～3次，刺激周期為21 d[10]。然后將30只模型小鼠隨機分為PD伴抑郁組、美多芭治療組及美多芭聯(lián)合丁苯酞治療組，每組10只。PD伴抑郁組小鼠不再做處理；美多芭治療組小鼠給予美多芭(6.25 mg/kg)灌胃治療，1次/d，持續(xù)1周；美多芭聯(lián)合丁苯酞治療組小鼠給予美多芭(6.25 mg/kg)和丁苯酞(120 mg/kg)灌胃治療，1次/d，持續(xù)1周。

1.4 行為學(xué)測試 通過強迫游泳測試、懸尾測試和糖水偏好實驗對所有小鼠行為進行評價。

1.4.1 強迫游泳測試：使用一個水容器(20 cm×30 cm×20 cm)來測試游泳分數(shù)。水深10 cm，水溫22～25 ℃，強迫游泳1 min，觀察6 min，察看小鼠的不動時間并記錄。

1.4.2 懸尾測試：將小鼠尾部后1/3處用醫(yī)用膠帶掛在測試箱內(nèi)鉤上，持續(xù)懸掛6 min，分析后4 min中的小鼠不動時間并記錄。

1.4.3 糖水偏好實驗：將小鼠單籠飼養(yǎng)，給予2%糖水3 d，在進行實驗前禁水16～18 h，再同時給予小鼠2%糖水及純凈水，測試2 h，檢查糖水消耗量與純凈水消耗量，計算糖水偏好率=糖水消耗量/(糖水消耗量+純凈水消耗量)×100%。

1.5 NLRP3及IBA-1蛋白表達檢測 采用蛋白印跡法檢測各組小鼠黑質(zhì)紋狀體區(qū)NLRP3及IBA-1的蛋白表達情況。操作步驟如下：腹腔注射10%水合氯醛麻醉小鼠后，右心耳處注入0.9%氯化鈉溶液，排出血管內(nèi)存血，待小鼠眼球變白后，斷頭取腦，剝離黑質(zhì)紋狀體組織，將組織樣本破碎處理，然后在組織中加入裂解液，比例為每20 mg組織150～250μL裂解液，保證破碎處理后的樣本被充分裂解，離心取上清液置于EP管中-20 ℃保存?zhèn)溆茫徊捎肂CA法檢測目的蛋白濃度，操作步驟按照試劑盒說明書進行，繪制標準曲線，根據(jù)所測樣品的吸光度值計算樣品濃度；蛋白樣品在100 ℃條件下煮沸5 min變性、13 000 r/min離心15 min，-20 ℃保存?zhèn)溆?；制備SDS-聚丙烯酰胺凝膠，依次加入MARKER、檢測樣品并記錄順序，80 V電泳20 min，后改110 V繼續(xù)電泳分離膠，采用半干轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜后5%脫脂奶粉封閉，搖床搖勻后封閉保存60 min，PBST緩沖液反復(fù)洗膜后加入一抗，孵育后4 ℃冰箱過夜，次日收集一抗，洗膜后加入二抗，回收二抗并洗膜，PBST緩沖液清洗3次后放入顯影板上，加顯影液顯影，Image J軟件進行灰度值測定分析。

1.6 觀察小膠質(zhì)細胞激活情況及多巴胺神經(jīng)元損傷情況 采用石蠟切片免疫熒光技術(shù)觀察各組小鼠黑質(zhì)紋狀體區(qū)的小膠質(zhì)細胞激活情況及多巴胺神經(jīng)元損傷情況。操作步驟如下：新鮮腦組織加入固定液固定，定位目的部位組織，流水沖洗后置于梯度酒精脫水，行石蠟包埋，切片機切片(厚4μm)后置于60 ℃烘箱烤片；切片脫蠟至水后，將其置于盛滿檸檬酸抗原修復(fù)緩沖液(pH 6.0)的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)進行抗原修復(fù)，自然冷卻后PBS洗滌3次，每次5 min；畫圈血清封閉，加一抗，濕盒4 ℃孵育過夜；PBS洗滌3次，每次5 min，切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加二抗，避光孵育50 min；PBS洗滌3次，每次5 min，切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加DAPI染液，避光室溫孵育10 min；PBS洗滌3次，每次5 min，切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片，鏡檢拍照。石蠟切片免疫熒光結(jié)果判讀：DAPI染出來的細胞核在紫外光的激發(fā)下為藍色，陽性表達為相應(yīng)熒光素標記的紅光或者綠光。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠行為學(xué)比較 與正常對照組相比，PD伴抑郁組的強迫游泳靜止時間及懸尾靜止時間均顯著延長，糖水偏好率顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與PD伴抑郁組相比，美多芭治療組及美多芭聯(lián)合丁苯酞治療組的強迫游泳靜止時間及懸尾靜止時間均顯著縮短，糖水偏好率顯著增高，且以美多芭聯(lián)合丁苯酞治療組更為明顯，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠行為學(xué)比較

2.2 各組小鼠黑質(zhì)紋狀體區(qū)NLRP3、IBA-1蛋白表達量比較 與正常對照組相比，模型小鼠的NLRP3、IBA-1蛋白表達量均明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)；與PD伴抑郁組相比，美多芭治療組及美多芭聯(lián)合丁苯酞治療組的NLRP3、IBA-1蛋白表達量均有所下降，且以美多芭聯(lián)合丁苯酞治療組下降更為明顯，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

注：ZC：正常對照組；PDD：PD伴抑郁組；MD：美多芭治療組；M+D：美多芭聯(lián)合丁苯酞治療組

2.3 各組小鼠黑質(zhì)紋狀體區(qū)多巴胺神經(jīng)元損傷情況 400倍視野下觀察各組小鼠酪氨酸羥化酶(TH)熒光標記(綠色)多巴胺神經(jīng)元損傷情況。與正常對照組相比，模型小鼠的多巴胺神經(jīng)元細胞數(shù)量明顯減少，并且細胞體受到不同程度的破壞，形態(tài)縮??；與PD伴抑郁組相比，美多芭聯(lián)合丁苯酞治療組的多巴胺神經(jīng)元細胞數(shù)量明顯增多。見圖2。

注：A：正常對照組；B：PD伴抑郁組；C：美多芭治療組；D：美多芭聯(lián)合丁苯酞治療組

2.4 各組小鼠黑質(zhì)紋狀體區(qū)小膠質(zhì)細胞激活情況 400倍視野下觀察各組小鼠黑質(zhì)紋狀體區(qū)IBA-1熒光標記(紅色)小膠質(zhì)細胞表達情況。與正常對照組相比，模型小鼠異常激活的小膠質(zhì)細胞數(shù)量明顯增多，胞體變大，軸突減少；與PD伴抑郁組相比，美多芭聯(lián)合丁苯酞治療組過度活化小膠質(zhì)細胞數(shù)量明顯減少。見圖3。

注：A：正常對照組；B：PD伴抑郁組；C：美多芭治療組；D：美多芭聯(lián)合丁苯酞治療組

3 討論

PD的發(fā)病機制眾說紛紜，炎癥反應(yīng)是其中一個被廣為研究討論的話題。有研究證明膠質(zhì)細胞激活是α-突觸核蛋白包涵體形成之前的早期事件，這表明神經(jīng)炎癥可能在PD的發(fā)病早期發(fā)揮重要的作用[11]。本研究結(jié)果顯示，相較于正常小鼠，代表炎癥反應(yīng)的NLRP3以及代表小膠質(zhì)細胞的IBA-1在模型小鼠中的表達量明顯升高。

錯誤折疊的蛋白質(zhì)是神經(jīng)退行性疾病的共同特征，已有研究認為α-突觸核蛋白-NLRP3介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可能是PD的病理生理基礎(chǔ)[12]。本研究中模型小鼠的NLRP3蛋白表達水平較正常小鼠明顯升高，且隨著PD癥狀的減輕，NLRP3的蛋白表達水平也相應(yīng)地降低。那么根據(jù)這一結(jié)果，NLRP3炎癥信號標志物將有助于血源性α-突觸核蛋白在PD診斷中的應(yīng)用，并可能成為早期發(fā)現(xiàn)PD的新方法。而且活化的NLRP3導(dǎo)致半胱天冬酶-1蛋白水解活化，促進前IL-1β的裂解和IL-1β、IL-18促炎細胞因子的形成，進而加劇炎癥反應(yīng)[13]，提示NLRP3介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在PD發(fā)病機制中扮演著重要角色。

小膠質(zhì)細胞在NLRP3介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用，NLRP3炎癥小體的過度激活促進了小膠質(zhì)細胞的促炎狀態(tài)，而NLRP3炎癥小體的抑制劑或小膠質(zhì)細胞自噬誘導(dǎo)劑可以通過抑制促炎狀態(tài)或促進向抗炎狀態(tài)的轉(zhuǎn)變來保護小膠質(zhì)細胞的正常功能[14]。有學(xué)者通過體外和體內(nèi)實驗證實，小膠質(zhì)細胞自噬功能受損可導(dǎo)致NLRP3炎性小體激活增強[15]。丁苯酞的主要成分為人工合成消旋正丁基苯肽，臨床上常用于急性腦血管病，可明顯改善血清炎性因子水平，促進病人神經(jīng)功能和自理能力的恢復(fù)[16]。已有研究發(fā)現(xiàn)，在缺血性腦損傷模型中，丁苯酞可抑制星形膠質(zhì)細胞及小膠質(zhì)細胞活化，抑制NLRP3/ASC/Caspase-1通路的激活[17]。本研究也發(fā)現(xiàn)，美多芭聯(lián)合丁苯酞治療組小鼠的NLRP3及IBA-1蛋白表達量較PD伴抑郁組及美多芭治療組小鼠顯著減少，并且抑郁行為也有所改善。然而聯(lián)合使用小膠質(zhì)細胞自噬誘導(dǎo)劑和NLRP3炎癥小體的特異性抑制劑在抑制NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥中的優(yōu)越性，需要未來進一步的臨床研究驗證。

綜上分析，小膠質(zhì)細胞/炎癥小體介導(dǎo)的炎癥機制可能參與PD伴抑郁的發(fā)生；丁苯酞可能通過抑制小膠質(zhì)細胞及炎癥小體的激活、減輕炎癥反應(yīng)來改善PD伴抑郁小鼠的抑郁癥狀。