張炳山 郁潔 楊穎 王卓 陸守榮 陳蓉 陸文偉 郁志明 洪侃

隨著人口老齡化進程加快，與年齡有關(guān)的疾病給醫(yī)療保健造成巨大負擔。衰弱(frailty)是一種由多因素引起的老年綜合征，表現(xiàn)為生理儲備減少和功能損害增加，導致應激能力降低[1]，其對住院、失能和死亡等不良結(jié)局的預測價值優(yōu)于實際年齡[2]。衰弱在老年高血壓和T2DM病人中非常常見。中國老年高血壓及2型糖尿病管理指南均建議評估老年病人是否存在衰弱[3-4]。腸道微生物(intestinal microbiome)被稱為人類“第二基因組”，具有適應性和可塑性的特征，在維持宿主健康和與年齡相關(guān)的疾病中發(fā)揮重要作用[5]。腸道微生物受宿主和環(huán)境因素之間復雜的相互作用的調(diào)控，如年齡、飲食、藥物、遺傳學和生活方式等。腸道微生物的變化可以改變宿主的生理機能，增加許多疾病的發(fā)病率和(或)嚴重性[6]，如炎癥性腸病、T2DM、肥胖、心血管疾病和神經(jīng)退行性疾病。在宿主衰老的過程中，腸道微生物的組成和功能發(fā)生了巨大變化，老年人的腸道微生物組成與成年人不同[7]。腸道微生物失調(diào)可導致腸道屏障功能障礙、運動障礙以及腸道炎癥[8]，導致與衰弱有關(guān)的全身低度炎癥[9]。我們對社區(qū)高血壓合并T2DM的老年病人進行了一項橫斷面調(diào)查研究，探討老年高血壓合并T2DM病人的衰弱程度與腸道微生物變化的關(guān)系，以期為老年高血壓合并T2DM病人全面管理及干預提供理論依據(jù)。

1 研究方法

1.1 研究對象 2018年5～10月，對居住在無錫市新安社區(qū)的老年居民進行橫斷面調(diào)查。納入標準：在社區(qū)生活至少5年，年齡≥65歲；血壓≥140/90 mmHg或既往診斷為高血壓，目前服用降壓藥者；通過口服糖耐量試驗診斷為T2DM或既往診斷為T2DM目前用藥者。排除標準：各種器質(zhì)性疾病終末期；診斷明確的胃腸道疾病，如炎癥性腸病、腸梗阻、胃腸道腫瘤等疾病以及半年內(nèi)有腹部手術(shù)史；有嚴重的視力、聽力和語言障礙，不能完成老年綜合評估者；在過去30 d內(nèi)接受過影響腸道菌群的藥物治療，如抗生素或抗精神病藥物治療；過去3個月內(nèi)補充益生菌制劑。研究經(jīng)無錫市人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，參與者均簽署書面知情同意書。

1.2 人口學特征和臨床評價 通過面對面訪談收集病人信息資料，對合并癥及其用藥情況進行評估。

1.3 老年綜合評估 采用Fried衰弱表型[10]診斷衰弱，滿足5項標準中的1～2項被定義為衰弱前期，滿足3項標準即可診斷為衰弱。本研究根據(jù)Fried衰弱表型結(jié)果將病人分為對照組、衰弱前期組和衰弱組。所有病人均接受認知功能(MoCA量表)、日常行為能力[日常生活能力量表(ADL)]、精神狀態(tài)[老年抑郁癥量表(GDS-15)]、營養(yǎng)狀況[迷你營養(yǎng)評估簡表(MNA-SF)]、跌倒風險(Morse跌倒量表)、藥物依從性[Morisky用藥依從性問卷(MMAS-8)]、社會支持度[社會支持評定量表(SSRS)]及疼痛程度(VAS量表)評估。

1.4 生化指標檢測 所有參與者禁食8 h，于次日清晨采血。血樣室溫下凝固30 min，3000 r/min 4 ℃下離心15 min。使用自動生化分析儀檢測FPG、HbA1c、LDL-C等。

1.5 腸道微生物基因組檢測 參與者在研究者的指導下用專用干燥無菌糞便收集器收集新鮮糞便樣本(約10 g)，2 h內(nèi)送到實驗室，并保存在-80 ℃環(huán)境中。使用Fast DNA Spin試劑盒(MP Biomedicals，Santa Ana，CA，USA)從糞便樣本中提取微生物基因組DNA。使用通用引物(341F和805R)擴增16S rRNA基因V3～V4區(qū)域。PCR產(chǎn)物用GENECLEAN Turbo試劑盒(MP Biomedical，北京，中國)進行純化，用Quant-iT PicoGreen dsDNA檢測試劑盒(Life Technologies，加州)進行定量。文庫使用TruSeq DNA LT樣品制備試劑盒(Illumina, Santiago, CA，USA)制備，并在Illumina MiSeq PE300平臺上使用MiSeq試劑盒(Illumina, Santiago, CA， USA)進行測序。

2 結(jié)果

2.1 3組病人的臨床特征 共181例老年病人(年齡65～80歲，女性占60.2%)納入本研究，衰弱者23例(12.7%)，衰弱前期者46例(25.4%)。衰弱組與對照組年齡、糖尿病病程、合并疾病數(shù)量、用藥數(shù)量、ADL評分、MNA-SF評分、MoCA評分、SSRS評分、血清白蛋白(ALB)水平差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

2.2 3組病人腸道微生物多樣性變化 通過α和β多樣性檢測評估3組病人腸道微生物菌群的差異。利用Chao1和Shannon指數(shù)從2個維度對種群內(nèi)的細菌豐度和群落穩(wěn)定性進行評估，發(fā)現(xiàn)3組的Chao1和Shannon指數(shù)差異均有統(tǒng)計學意義(Chao1：F=7.941，P<0.001；Shannon指數(shù)：F=10.489，P<0.001)，但變化趨勢不一致，不能說明α多樣性存在明顯的差異，見圖1。主坐標分析(PCoA)顯示3組病人腸道菌群有差異，其中β多樣性的非加權(quán)和加權(quán)PCoA在衰弱組中的腸道微生物分類高于對照組及衰弱前期組(P<0.05)，見圖2。

注：與對照組比較，*P<0.05；與衰弱前期組比較，#P<0.05

2.3 不同健康狀態(tài)病人腸道菌群的組成 在門水平上，前5種細菌為Fimicute、Bacteroidetes、Proteobacteria、Actinobacteria、Fusobacteria。與對照組相比，衰弱組Actinobacteria相對豐度增加，F(xiàn)usobacteria相對豐度減少，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3。

注：與對照組比較，*P<0.05；與衰弱前期組比較，#P<0.05

在屬水平上，與對照組相比，衰弱組的Bifidobacterium和Lactobacillus豐度增加(P=0.043和P=0.015)，Adlercreutzia、Clostridium、Coprococcus、Faecalibacterium、Phascolarctobacterium、Roseburia、Turicibacter7個種屬細菌豐度減少(P<0.05)。衰弱前期組Eggerthella較對照組豐度增加(P=0.031)。與衰弱前期組相比，衰弱組Lactobacillus豐度增加(P=0.031)，Clostridium、Coprococcus和Eggerthella豐度減少(P=0.002、P=0.045和P=0.026)。衰弱組其他未歸類細菌較衰弱前期組和對照組明顯減少(P<0.05)，見圖4。

注：與對照組比較，*P<0.05；與衰弱前期組比較，#P<0.05

3 討論

本研究使用Fried衰弱表型對181例社區(qū)老年高血壓合并T2DM病人調(diào)查發(fā)現(xiàn)，衰弱和衰弱前期的患病率分別為12.7%和25.4%，提示衰弱在社區(qū)老年高血壓合并T2DM病人中發(fā)病率較高，且高齡、多病共存、多重用藥、糖尿病病程長、抑郁情緒、營養(yǎng)不良、認知功能下降、社會支持差、跌倒風險增加可能是衰弱的相關(guān)危險因素，與既往的研究結(jié)果相似[11]。

腸道微生物組成的變化與衰老過程及其相關(guān)疾病密切相關(guān)[12]。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，衰弱組腸道微生物α多樣性變化不明顯，但β多樣性增加。Zhang等[13]在老年住院病人中發(fā)現(xiàn)衰弱組腸道微生物α多樣性與對照組相似，而β多樣性大于對照組，與本研究結(jié)果一致。Margiotta等[14]在慢性腎功能不全的病人中也得出了相同的結(jié)論。但Jackson等[15]對728名女性雙胞胎的糞便樣本分析發(fā)現(xiàn)，衰弱與腸道微生物群α多樣性之間呈負相關(guān)。雖然目前無法確定衰弱是微生物群多樣性改變的原因還是結(jié)果，但是觀察到的微生物變化可能至少部分與健康損害相關(guān)。通過改變已知影響腸道微生物多樣性的生活方式如飲食來維持或改善腸道微生物多樣性，有可能是促進健康老齡化的有效措施。

在門水平上，本組病人排名前5位的腸道細菌依次為Fimicutes、Bacteroidetes、Proteobacteria、Actinobacteria、Fusobacteria；相比于對照組，衰弱組的Actinobacteria相對豐度增加，F(xiàn)usobacteria相對豐度減少。Actinobacteria和Fusobacteria是組成人類腸道微生物系統(tǒng)的兩個重要菌群，各自包含多種不同的種屬。Claesson等[16]將161名≥65歲老年人的糞便微生物與9名年輕者進行了對比，發(fā)現(xiàn)與疾病或健康狀態(tài)有關(guān)的Actinobacteria和Fusobacteria的比例在個體之間差異很大。另一研究顯示，衰弱老人糞便微生物中屬于Fusobacteria菌門的F.prausnitzii的豐度顯著降低[17]，該細菌是一種重要的產(chǎn)生具有抗炎特性的丁酸鹽的細菌。Jackson等[15]在衰弱前期的個體中也發(fā)現(xiàn)F.prausnitzii豐度減少，而屬于Actinobacteria菌門的與炎癥有關(guān)的Eggerthelladifficile豐度增加[18]。

在屬水平上，本研究發(fā)現(xiàn)，相比于對照組，衰弱組病人的Bifidobacterium和Lactobacillus的相對豐度有所增加。Bifidobacterium目前被認為是較為常見的有益菌。Wu等[19]發(fā)現(xiàn)，相較于年輕人(21～33歲)及低齡老年人(68～88歲)，Bifidobacterium在撒丁島百歲老人的腸道微生物群中的豐度是增加的；Biagi等[20]也發(fā)現(xiàn)，意大利百歲老人(99～109歲)的腸道菌群Bifidobacterium的豐度高于65～75歲及22～48歲人群。但是，這些研究并沒有對這些長壽老人的健康狀態(tài)進行評估，因此，腸道菌群富含Bifidobacterium的長壽老人是否存在衰弱不得而知，Bifidobacterium在維持老年健康和長壽中的作用還有待進一步的研究和探索。Lactobacillus是腸道中另一常見的菌屬，約有170種，其中部分菌株能夠參與刺激免疫功能，幫助食物和礦物質(zhì)的消化和(或)吸收，并抑制外源性或有害細菌的生長[21]。van Tongeren等[17]發(fā)現(xiàn),衰弱評分越高,志愿者的腸道菌群Lactobacillus數(shù)量越少，本研究結(jié)果與其正好相反，即衰弱組的Lactobacillus相對豐度顯著高于衰弱前期組。這是因為Lactobacillus并不是一直都扮演著促進健康的角色，也有研究發(fā)現(xiàn)，在精神分裂癥病人中，Lactobacillus的豐度顯著高于正常者，并且與癥狀的嚴重程度呈正相關(guān)[22]。Margiotta等[14]發(fā)現(xiàn),在慢性腎臟病病人中，Lactobacillus的豐度較非慢性腎臟病病人增加。這可能與不同的Lactobacillus菌種在健康中所起的作用不同有關(guān)。Wang等[23]研究發(fā)現(xiàn)，相較于健康者，終末期腎臟病病人只有Lactobacillusplantarum和Lactobacillusparacasei的豐度降低。因此，進一步鑒別出有益于健康和有害于健康的菌種及其變化趨勢更有利于指導臨床。

本研究結(jié)果顯示，相比于對照組，衰弱組病人的Adlercreutzia、Clostridium、Coprococcus、Faecalibacterium、Phascolarctobacterium、Roseburia、Turicibacter相對豐度存在不同程度的下降。Clostridium和Coprococcus也被認為是腸道的有益菌群，具有產(chǎn)生丁酸鹽、發(fā)揮抗炎的作用。在本研究中，衰弱組Clostridium和Coprococcus的豐度比對照組和衰弱前期組低。Haran等[24]也發(fā)現(xiàn)，隨著軀體衰弱程度增加，Clostridium屬，特別是其中的ClostridiumclusterXIVa豐度逐漸降低。目前已經(jīng)證實，Coprococcus的相對豐度與反應性疾病、抑郁癥和腸易激綜合征呈負相關(guān)。Lim等[25]對176名韓國老年人的腸道微生物分析發(fā)現(xiàn)，衰弱老人的Coprococcuseutactus豐度顯著低于非衰弱者。此外，該研究還發(fā)現(xiàn)不同的Clostridium和Coprococcus菌種可能在衰弱發(fā)生中的作用不同，未來的研究應該精確到菌種和菌株。Faecalibacterium是產(chǎn)生具有抗炎作用的丁酸鹽的另一菌屬[26]，本研究發(fā)現(xiàn)該菌屬在衰弱組腸道微生物中的含量顯著減少，與van Tongeren等[17]的研究結(jié)果一致。目前還未見他人研究Roseburia、Turicibacter、Adlercreutzia、Phascolarctobacterium在衰弱人群中的變化特征。研究顯示，Roseburia是一種厭氧菌，屬于ClostridiumclusterXIVa[27]，已被證明在維持腸道屏障功能和免疫防御方面發(fā)揮重要作用。Xu等[28]研究發(fā)現(xiàn)，Roseburia的豐度與慢性炎癥因子IL-6呈負相關(guān)，可能與衰弱的發(fā)生有關(guān)。Turicibacter是一種與脂質(zhì)代謝紊亂相關(guān)的菌屬，具有抗肥胖作用[29]。Turicibacter的豐度降低可能導致老年代謝相關(guān)性疾病如肥胖，并促進衰弱的發(fā)生。Adlercreutzia是一個與精神疾病相關(guān)的菌屬，在精神分裂癥病人中，該菌屬的豐度較低[22]。該菌屬還與老年人的活躍程度有關(guān)，在活躍程度較高的老年人中，Adlercreutzia的相對豐度較低[30]。一項衰弱干預研究發(fā)現(xiàn)，衰弱老人補充益生元可增加Phascolarctobacterium的豐度，降低趨化因子CXCL11水平，改善老年人的衰弱狀態(tài)[31]，間接說明了Phascolarctobacterium與衰弱呈負相關(guān)，本研究結(jié)果也印證了此論點。

Eggerthella被認為是衰弱的一個腸道微生物標志物。Margiotta等[14]研究發(fā)現(xiàn)，相較于非衰弱者，慢性腎臟病衰弱病人的Eggerthellaspp含量更為豐富。Ponziani等[32]研究發(fā)現(xiàn)，與非肌少癥者相比，合并肌少癥的肝硬化病人的Eggerthella豐度更高。Jackson等[15]也發(fā)現(xiàn)衰弱前期個體的Eggerthelladifficile豐度較非衰弱者增加。而本研究發(fā)現(xiàn)，相較于非衰弱組，Eggerthella的相對豐度在衰弱前期組中較高，但在衰弱組中卻是下降的，這一變化在既往的研究中尚未見報道。這一現(xiàn)象是否與衰弱病人的多重用藥有關(guān)，尚需進一步研究。

總之，衰弱在老年高血壓合并T2DM病人中非常常見。年齡、糖尿病病程、多病共存、多重用藥、營養(yǎng)不良、認知功能下降、生活能力下降、跌倒風險增加與衰弱相關(guān)。衰弱病人的腸道微生物組成不同于非衰弱者，存在多個菌屬的變化，提示腸道微生物在衰弱的發(fā)生發(fā)展過程中的作用和機制復雜，有望成為衰弱干預的新途徑，但需要進一步的研究。