蔡旭龍 尹同進(jìn) 徐巧嵐

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是兒童常見的慢性呼吸道疾病，目前發(fā)病機(jī)制尚不明確，主要由環(huán)境因素和遺傳因素共同作用引起，其病理特點(diǎn)為慢性氣道炎癥[1]。研究發(fā)現(xiàn)哮喘主要由Th2細(xì)胞因子IL-4、IL-5和IL-13驅(qū)動(dòng)，導(dǎo)致氣道嗜酸性粒細(xì)胞炎癥[2]。NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3(NOD-like receptor containing pyrin domain 3，NLRP3)是模式識(shí)別受體家族NOD樣受體中的一員，參與Th2細(xì)胞的分化[3]。NLRP3是組成NLRP3炎癥小體的重要部分，使哮喘兒童外周血中，下游因子IL-1β和IL-18水平升高，與哮喘疾病進(jìn)程關(guān)系密切[4]。目前，NLRP3基因多態(tài)性是否影響哮喘的易感性及其表型的研究鮮有報(bào)道。本研究分析NLRP3基因位點(diǎn)多態(tài)性在哮喘患兒和健康兒童中的分布差異，探討基因多態(tài)性在哮喘發(fā)病中的意義。

資料與方法

一、研究對象

2020年8月至2021年6月期間在鹽城市第三人民醫(yī)院就診治療的哮喘兒童，收集急性發(fā)作期的患兒130例，其中女性57例，男性73例，年齡3～14歲，診斷哮喘符合《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南(2016年版)》[5]。同期收集80例健康兒童，其中女性36例，男性44例，年齡3～14歲，無哮喘、過敏性鼻炎、特應(yīng)性皮炎史，無遺傳免疫缺陷病史，無過敏史，家族中三代以內(nèi)無哮喘史。與納入研究兒童家長簽訂知情同意書，同時(shí)本次研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號(hào)：2020-55)。

二、標(biāo)本采集及DNA提取

空腹抽取外周靜脈血2mL于EDTA抗凝管中。DNA的提取嚴(yán)格按照人血DNA提取試劑盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)說明操作。提取的DNA標(biāo)本存放-80℃冰箱。

三、基因目標(biāo)位點(diǎn)篩選

從“千人基因組計(jì)劃”項(xiàng)目數(shù)據(jù)庫中下載中國漢族健康人群NLRP3基因多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)據(jù)(http://grch37.ensembl.org/index.html)。將獲得的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Haploview，設(shè)計(jì)分析的最小等位基因頻率大于20%，依據(jù)連鎖不平衡獲得5個(gè)Block區(qū)，每個(gè)區(qū)篩選1個(gè)位點(diǎn)，共5個(gè)目標(biāo)位點(diǎn)(rs12137901、rs4998423、rs12048215、rs1539019、rs12130711)(見表1)。

表1 NLRP3多態(tài)性位點(diǎn)在不同block區(qū)分布情況

四、多重?cái)U(kuò)增及高通量測序基因分型

設(shè)計(jì)并合成好一個(gè)包含5個(gè)SNP位點(diǎn)的引物池(見表2)，然后通過兩步PCR的方法完成目標(biāo)SNP位點(diǎn)的擴(kuò)增和兼容illumina測序文庫的制備。第一輪PCR體系如下：DNA模板(10 ng/μL)2μL；上游引物池(10μM)1μL；下游引物池(10μM)1μL；2×PCR Ready Mix 15μl (總體積 25μL)(Kapa HiFi Ready Mix)。配制好反應(yīng)體系后，在PCR儀(BIO-RAD，T100TM)執(zhí)行反應(yīng)程序：98℃預(yù)變性3分鐘，然后執(zhí)行8個(gè)循環(huán)(條件：98℃變性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸30秒)。緊接著執(zhí)行25個(gè)循環(huán)(條件：98℃變性30秒，66℃退火30秒，72℃延伸30秒)。最后72℃延伸5分鐘。反應(yīng)完成后，維持4℃。

表2 NLRP3多態(tài)性位點(diǎn)的引物

然后以第一輪PCR產(chǎn)物為模板執(zhí)行第二輪PCR反應(yīng)，以獲得測序帶分子標(biāo)簽的文庫。反應(yīng)體系如下：DNA模板(10ng/μL)2μL，通用P7引物(含分子標(biāo)簽，10μM)1μL; 通用P5引物(10μM)1μL; 2×PCR Ready Mix15μL (總體積30μL)。配制好反應(yīng)體系后，執(zhí)行如下PCR程序：98℃預(yù)變性5分鐘，然后執(zhí)行5個(gè)循環(huán)程序(變性94℃30秒，55℃退火20秒，72℃延伸30秒)。最終72℃延伸5分鐘。完成后維持4℃。最終PCR產(chǎn)物使用AMPure XP磁珠純化回收。各個(gè)PCR產(chǎn)物等量混合后，使用HiSeq XTen測序儀(Illumina, San Diego, CA)進(jìn)行測序。

使用BWA(v 0.7.13-r1126)軟件將質(zhì)控合格的序列比對到參考基因組上，參數(shù)為默認(rèn)參數(shù)。根據(jù)比對結(jié)果，通過samtools軟件(版本0.1.18)計(jì)算目標(biāo)位點(diǎn)的基因型結(jié)果基因分型。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、研究對象的一般特征

本次研究納入哮喘兒童130例，健康兒童80例，通過病例對照研究進(jìn)行分析。年齡、性別構(gòu)成在兩組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。總IgE、白細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞百分比在哮喘組中均明顯高于健康組，P<0.001。哮喘組中有過敏史的占60.7%，過敏性鼻炎占42.3%，特應(yīng)性皮炎的占29.2%，有哮喘家族史的占18.4%(見表3)。

表3 研究對象一般資料

二、多態(tài)性位點(diǎn)基因型及等位基因在哮喘和健康兒童中的分布情況

通過Haploview分析獲得NLRP3基因Tag位點(diǎn)rs12137901、rs4998423、rs12048215、rs1539019、rs12130711，并進(jìn)行基因分型(見表4)。5個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的基因型及等位基因在哮喘和健康兒童中分布無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表4 NLRP3基因位點(diǎn)多態(tài)性在哮喘和健康兒童中的分布[n(%)]

三、不同基因型在嗜酸粒細(xì)胞表型中的分布情況

取嗜酸粒細(xì)胞比例3%為分界，將哮喘兒童分兩組：嗜酸粒細(xì)胞%>3%(n1=63)，嗜酸粒細(xì)胞%≤3%(n2=67)，并進(jìn)行基因型分布統(tǒng)計(jì)分析(見表5)。rs12048215位點(diǎn)有AA、AG、GG三種基因型。嗜酸粒細(xì)胞%>3%組中構(gòu)成比為AA(60.3%)、AG(33.3%)、GG(6.4%)。嗜酸粒細(xì)胞%≤3%組中構(gòu)成比為AA(38.8%)、AG(53.7%)、GG(7.5%)。rs12048215位點(diǎn)基因型在兩組不同比例嗜酸粒細(xì)胞中分布有差異，P=0.045。共顯性模型AA vs (AG+GG)在兩組中的分布比較(P=0.014，OR [95%CI]=2.397[1.185～4.848])。rs12048215位點(diǎn)等位基因A、G在兩組中有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.044，OR [95%CI]=1.748[1.012～3.021])。

表5 NLRP3基因位點(diǎn)多態(tài)性在哮喘兒童不同嗜酸粒細(xì)胞比例中的分布[n(%)]

四、rs12048215位點(diǎn)多態(tài)性的功能預(yù)測

通過3DSNP v2.0預(yù)測NLRP3基因rs12048215位點(diǎn)的功能[6](見表6)。分析出rs12048215位點(diǎn)可能影響FOS和STAT3。FOS是AP-1轉(zhuǎn)錄因子的亞單位，存在于細(xì)胞核質(zhì)內(nèi)，參與調(diào)節(jié)嗜酸粒細(xì)胞[7]。STAT3是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子，存在于細(xì)胞核質(zhì)和胞漿中，參與調(diào)節(jié)嗜酸粒細(xì)胞[8]。

表6 與rs12048215位點(diǎn)相關(guān)的蛋白因子

討 論

遺傳因素在哮喘發(fā)病中起著重要作用，遺傳率在35%到95%之間，研究確認(rèn)存在數(shù)百種與哮喘風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)的基因變異[9]。遺傳密碼翻譯方式的表觀遺傳變異也被證明在哮喘的發(fā)展中起作用[10]。目前對哮喘的理解涉及到大量的遺傳多樣性，這些遺傳多樣性通過表觀遺傳和轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行可變的翻譯和環(huán)境影響，導(dǎo)致慢性氣道炎癥的組織病理學(xué)特征，從而表現(xiàn)出主要的哮喘癥狀[9]。

病原體和過敏原能夠活化NLRP3[11]?；罨腘LRP3能夠募集PYCARD和Caspase-1，形成NLRP3炎癥小體，參與Th2細(xì)胞的分化及Th2類型的過敏炎癥反應(yīng)[12-13]。一項(xiàng)在乳清蛋白誘導(dǎo)的過敏性氣道炎癥小鼠模型中的研究，發(fā)現(xiàn)NLRP3參與過敏性氣道炎癥的過程[14]。有研究證實(shí)NLRP3可通過上調(diào)IL-4的表達(dá)促進(jìn)M2巨噬細(xì)胞極化[15]。因此，NLRP3參與哮喘的發(fā)病機(jī)制。但本次研究NLRP3的位點(diǎn)的多態(tài)性在哮喘組和健康兒童中分布無差異，可能不是哮喘易感性的因素。

富含嗜酸性粒細(xì)胞的慢性氣道炎癥是哮喘的一個(gè)重要特征[16]。嗜酸性粒細(xì)胞是由CD34+前體細(xì)胞產(chǎn)生的終末分化粒細(xì)胞。IL-5、CCR3和CD34與受體結(jié)合可促進(jìn)前體細(xì)胞分化為嗜酸性粒細(xì)胞?；|(zhì)細(xì)胞、肥大細(xì)胞和活化T細(xì)胞產(chǎn)生IL-5、GM-CSF和IL-3是骨髓中嗜酸性粒細(xì)胞生長和成熟的重要組成部分[17]。在哮喘病程進(jìn)展過程中，嗜酸粒細(xì)胞引起氣道慢性炎癥發(fā)揮重要作用[18-19]。

有研究發(fā)現(xiàn)在NLRP3缺失的小鼠模型中，HDM誘導(dǎo)的過敏性肺部炎癥顯示出肺和肺泡灌洗液中嗜酸粒細(xì)胞明顯增加[20]，NLRP3的缺失對嗜酸粒細(xì)胞調(diào)節(jié)失控。本次研究中，NLRP3基因位點(diǎn)rs12048215的基因型AA、AG、GG在嗜酸粒細(xì)胞高比例組和低比例組中，分布有明顯差異。在哮喘兒童中，基因型AA與嗜酸粒細(xì)胞增高表型有相關(guān)性。通過基因位點(diǎn)功能的預(yù)測，rs12048215位點(diǎn)多態(tài)性與FOS和STAT3有關(guān)聯(lián)。而FOS和STAT3均能夠?qū)κ人崃＜?xì)胞產(chǎn)生影響。FOS和STAT3的表達(dá)可能受到rs12048215位點(diǎn)多態(tài)性的影響，進(jìn)而可能影響嗜酸粒細(xì)胞表型。

NLRP3基因rs12048215位點(diǎn)多態(tài)性可能是哮喘兒童嗜酸粒細(xì)胞增高表型的因素。但本次研究的樣本量、基因位點(diǎn)偏少，需要更廣泛系統(tǒng)的研究證實(shí)位點(diǎn)多態(tài)性對哮喘表型的影響。