徐義松 龔成林 王利華

肺炎鏈球菌是誘發(fā)肺炎的主要病原菌，其可引起肺泡上皮細胞凋亡及炎性損傷[1]。探究肺炎鏈球菌引起的肺泡上皮細胞凋亡及炎性損傷的機制，對肺炎的防治具有重要意義。性別決定區(qū)Y-框轉錄因子2重疊轉錄本(sex determining region Y-box 2 overlapping transcript，SOX2OT)是一種長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA，LncRNA)，基因位于3號染色體長臂26區(qū)33帶，其在多種疾病中異常表達，參與調控疾病的發(fā)展進程。研究顯示，LncRNA SOX2OT在氧糖剝奪/復氧處理的心肌細胞H9c2中表達增加，沉默LncRNA SOX2OT可通過靶向微小RNA(microRNA，miR)-215-5p/鋅指E盒結合同源盒蛋白2(zinc finger E-box binding homeobox 2，ZEB2)軸促進氧糖剝奪/復氧處理的H9c2細胞活力，并抑制細胞凋亡，其可作為心力衰竭治療的分子靶點[2]；LncRNA SOX2OT在脊髓損傷大鼠和脂多糖誘導的神經(jīng)細胞中表達升高，其通過激活Janus 通路促進脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)介導的神經(jīng)細胞凋亡、炎癥和氧化應激，促進大鼠脊髓損傷[3]。然而，LncRNA SOX2OT對肺炎發(fā)生發(fā)展的影響及調控機制還未知。DIANA Tools靶基因在線軟件預測顯示，LncRNA SOX2OT可能靶向結合miR-146a-5p。有報道稱，miR-146a-5p在急性期肺炎患者血清及LPS誘導的WI-38細胞中表達下調，上調其表達可通過靶向抑制趨化因子(C-C 基序)配體 5(chemokine (C-C motif) ligand 5，CCL5)的表達減少LPS誘導的WI-38細胞凋亡，并減輕細胞炎性損傷，miR-146a-5p為肺炎的治療提供了新靶點[4]。本研究建立肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞HEPApiC損傷模型，觀察了LncRNA SOX2OT對肺炎鏈球菌誘導的HEPApiC細胞凋亡和炎癥反應的影響及其能否靶向miR-146a-5p發(fā)揮作用，以期了解LncRNA SOX2OT/miR-146a-5p軸對肺炎鏈球菌誘發(fā)肺炎發(fā)生發(fā)展的影響，為肺炎治療提供分子靶點。

資料與方法

一、材料

選取2019年5月至2020年10月于本院確診的51例肺炎鏈球菌肺炎患者為研究對象，男29例，女22例，年齡(4.26±1.05)歲。肺炎鏈球菌肺炎診斷標準[5]如下：出現(xiàn)咳嗽、咳痰等肺炎臨床癥狀，肺部聽診異常，實驗室檢查外周血炎性指標升高，病原學檢查肺炎鏈球菌陽性。另選取同時期29例健康體檢者為對照，男16例，女13例，年齡(4.52±1.12)歲。兩組年齡、性別等一般資料無顯著差異(P<0.05；χ2=0.021，P=0.884)。研究符合《赫爾辛基宣言》原則。

HEPApiC細胞系，武漢普諾賽生命科技有限公司；胎牛血清，浙江天杭生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測試劑盒、Annexin V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒和雙熒光素酶活性檢測試劑盒，北京索萊寶；RNA抽提試劑盒、逆轉錄試劑盒和PCR試劑盒，大連寶生物；LipofectamineTM 2000試劑盒，美國Invitrogen公司；引物序列、LncRNA SOX2OT小干擾RNA(si-LncRNA SOX2OT)及陰性對照序列(si-NC)、LncRNA SOX2OT野生型和突變型熒光素酶報告基因載體(WT-LncRNA SOX2OT、MUT-LncRNA SOX2OT)、miR-146a-5p模擬物(mimics)和抑制劑(anti-miR-146a-5p)、抑制劑陰性序列(anti-miR-NC)及模擬對照序列(miR-NC)，上海生工；白細胞介素(interleukin，IL)-6、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)和IL-10試劑盒，南京建成；兔抗B淋巴細胞瘤-2相關蛋白(Bcl-2-associated X protein，Bax)、B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體，中國Abcam公司。

二、方法

1 qRT-PCR檢測LncRNA SOX2OT和miR-146a-5p表達:采集兩組受試者清晨空腹周靜脈血，用RNA抽提試劑盒提取總RNA，逆轉錄為cDNA后，行PCR反應。引物序列見表1。2-△△Ct法計算LncRNA SOX2OT相對GAPDH、miR-146a-5p相對U6的表達量。

表1 引物序列

2 細胞培養(yǎng):復蘇HEPApiC，加含10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。于6孔板中每孔接種5.0×105個HEPApiC細胞，培養(yǎng)12 h后，棄培養(yǎng)液，分為對照(con)組和model組。con組用常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)，model組用1×108CFU·mL-1[6]肺炎鏈球菌感染細胞。然后qRT-PCR檢測細胞中LncRNA SOX2OT和miR-146a-5p表達，方法同1.3.1。

3 雙熒光素酶報告基因實驗:于6孔板中每孔接種5.0×105個HEPApiC細胞，培養(yǎng)12 h后，棄培養(yǎng)液。用LipofectamineTM 2000脂質體法，分別共轉染W(wǎng)T-LncRNA SOX2OT與miR-NC(或miR-146a-5p mimic)、MUT-LncRNA SOX2OT與miR-NC(或miR-146a-5p mimic)。轉染12 h后，棄培養(yǎng)液，裂解細胞。3500 r·min-1離心10 min。取20 μL上清液，加100 μL 1×螢火蟲或海腎熒光素酶反應工作液，檢測螢火蟲和海腎的熒光強度。以螢火蟲與海腎熒光強度的比值，表示細胞熒光素酶活性。

4 細胞轉染和分組處理:于6孔板中每孔接種5.0×105個HEPApiC細胞，培養(yǎng)12 h后，棄培養(yǎng)液。用LipofectamineTM 2000脂質體法，分別轉染si-NC、si-LncRNA SOX2OT、共轉染si-LncRNA SOX2OT與anti-miR-NC、si-LncRNA SOX2OT與anti-miR-146a-5p。轉染12 h后，棄培養(yǎng)液。加新鮮培養(yǎng)液，在培養(yǎng)24 h。然后收集轉染后的細胞重新制為單細胞懸液，接種至6孔板中(5.0×105個/孔)，培養(yǎng)12 h后，均按照model組進行處理，并分別記為model+si-NC組、model+si-LncRNA SOX2OT組、model+si-LncRNA SOX2OT+anti-miR-NC組、model+si-LncRNA SOX2OT+anti-miR-146a-5p組。同時設置con組和model組，同1.3.2。處理結束后，收集各組細胞和細胞培養(yǎng)上清液，進行后續(xù)指標檢測。

5 流式細胞儀檢測細胞凋亡:利用Annexin V-FITC/PI試劑盒，檢測各組細胞凋亡。

6 蛋白質印跡法檢測Bax和Bcl-2蛋白表達：用RIPA試劑提取各組細胞中總蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白含量。行10 % SDS-PAGE電泳分離蛋白，經(jīng)轉膜和封閉處理后，于4℃冰箱中分別用Bax(1 ∶500)、Bcl-2(1 ∶500)和GAPDH(1 ∶1000)一抗孵育過夜，洗膜，再用山羊抗兔二抗(1 ∶2000)37℃孵育1 h。加顯影液，避光顯影，曝光拍照，Image J 軟件分析Bax、Bcl-2相對GAPDH的表達量。

7 酶聯(lián)免疫吸附法檢測細胞培養(yǎng)上清液中IL-6、TNF-α和IL-10含量：將收集的各組細胞培養(yǎng)上清液3500 r·min-1離心10 min，取上清，分別利用IL-6、TNF-α和IL-10試劑盒，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測上清中其含量。

三、 統(tǒng)計學處理

結 果

一、 LncRNA SOX2OT和miR-146a-5p在肺炎患者中的表達

肺炎患者外周血中LncRNA SOX2OT表達量為2.11±0.32，顯著高于健康對照組(0.75±0.17，t=21.209，P<0.05)；miR-146a-5p表達量為0.52±0.09，顯著低于健康對照組(1.25±0.17，t=25.157，P<0.05)。

二、 肺炎鏈球菌對肺泡上皮細胞中LncRNA SOX2OT和miR-146a-5p表達的影響

model組肺泡上皮細胞中LncRNA SOX2OT表達量為3.26±0.28，顯著高于con組(1.00±0.00，t=24.214，P<0.05)；miR-146a-5p表達量為0.23±0.02，顯著低于con組(1.00±0.00，t=115.500，P<0.05)。

三、LncRNA SOX2OT靶向負調控miR-146a-5p

轉染si-LncRNA SOX2OT的肺泡上皮細胞中LncRNA SOX2OT的表達量為0.26±0.04，顯著低于轉染si-NC的細胞(1.00±0.00，t=55.500，P<0.05)，說明轉染si-LncRNA SOX2OT的肺泡上皮細胞中LncRNA SOX2OT表達下調。LncRNA SOX2OT與miR-146a-5p核苷酸序列的結合位點(見圖1)。共轉染W(wǎng)T-LncRNA SOX2OT與miR-146a-5p mimics的細胞熒光素酶活性為0.33±0.04，顯著低于共轉染W(wǎng)T-LncRNA SOX2OT與miR-NC的細胞(0.99±0.08，t=22.137，P<0.05)；共轉染MUT-LncRNA SOX2OT與miR-146a-5p mimics的細胞熒光素酶活性為0.97±0.11，與共轉染MUT-LncRNA SOX2OT與miR-NC的細胞比較差異無統(tǒng)計學意義(1.00±0.07，t=0.690，P=0.500)。轉染si-LncRNA SOX2OT的肺泡上皮細胞中miR-146a-5p的表達量為4.23±0.12，顯著高于轉染si-NC的細胞(1.00±0.00，t=80.750，P<0.05)，說明下調LncRNA SOX2OT促進miR-146a-5p的表達。

圖1 LncRNA SOX2OT與miR-146a-5p核苷酸序列的結合位點

四、LncRNA SOX2OT靶向miR-146a-5p調控肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞凋亡

model組肺泡上皮細胞凋亡率和細胞中Bax蛋白表達高于con組(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達低于con組(P<0.05)。model+si-LncRNA SOX2OT組肺泡上皮細胞凋亡率和細胞中Bax蛋白表達低于model+si-NC組(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達高于model+si-NC組(P<0.05)。model+si-LncRNA SOX2OT+anti-miR-146a-5p組肺泡上皮細胞凋亡率和細胞中Bax蛋白表達高于model+si-LncRNA SOX2OT+anti-miR-NC組(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達低于model+si-LncRNA SOX2OT+anti-miR-NC組(P<0.05)。model組與model+si-NC組、model+si-LncRNA SOX2OT組與model+si-LncRNA SOX2OT+anti-miR-NC組各檢測測指標比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見圖2、表2)。

表2 LncRNA SOX2OT靶向miR-146a-5p對肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞凋亡的影響

圖2 LncRNA SOX2OT靶向miR-146a-5p對肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞凋亡的影響

五、LncRNA SOX2OT靶向miR-146a-5p對肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞炎癥因子表達的影響

model組肺泡上皮細胞培養(yǎng)上清液中，IL-6和TNF-α水平高于con組(P<0.05)，IL-10水平低于con組(P<0.05)。model+si-LncRNA SOX2OT組肺泡上皮細胞培養(yǎng)上清液中IL-6和TNF-α水平低于model+si-NC組(P<0.05)，IL-10水平高于model+si-NC組(P<0.05)。model+si-LncRNA SOX2OT+anti-miR-146a-5p組肺泡上皮細胞培養(yǎng)上清液中IL-6和TNF-α水平高于model+si-LncRNA SOX2OT+anti-miR-NC組(P<0.05)，IL-10水平低于model+si-LncRNA SOX2OT+anti-miR-NC組(P<0.05)。model組與model+si-NC組、model+si-LncRNA SOX2OT組與model+si-LncRNA SOX2OT+anti-miR-NC組各檢測測指標比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見表3)。

表3 LncRNA SOX2OT靶向miR-146a-5p對肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞炎癥因子表達的影響

討 論

肺炎是常見的炎癥性肺部疾病，具有較高的發(fā)病率。肺炎鏈球菌是一種革蘭氏陽性菌，其可感染肺泡上皮細胞導致其炎性損傷和凋亡，進而誘發(fā)肺炎。因此，減輕或抑制肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞凋亡和炎癥反應，對肺炎治療尤為重要。lncRNA是一類長鏈非編碼RNA，其參與調控細胞增殖、凋亡、炎癥反應等生理或病理過程[7-9]。研究顯示，肺炎患者體內存在大量異常表達的lncRNA，這些lncRNA參與調控肺泡上皮細胞凋亡及炎性損傷，為肺炎的治療提供了潛在分子靶點。例如，明是非等[10]研究顯示，lncRNA PVT1在肺炎鏈球菌壞死性肺炎肺組織和肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞A549中，表達上調，敲減其表達抑制了肺炎鏈球菌誘導的A549細胞凋亡及炎性因子IL-6和轉化生長因子β(transforming growth factor β，TGF-β)的表達。

作為一種LncRNA，LncRNA SOX2OT參與腫瘤[11]、心力衰竭[12]和腹主動脈瘤[13]等疾病的發(fā)生發(fā)展，然而其對肺炎發(fā)生發(fā)展的影響還未知。本研究結果顯示，LncRNA SOX2OT在肺炎患者外周血及肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞HEPApiC中表達增加，這提示其可能促進肺炎的發(fā)展進程；通過下調HEPApiC細胞中LncRNA SOX2OT的表達發(fā)現(xiàn)，下調LncRNA SOX2OT有效減少了肺炎鏈球菌誘導的HEPApiC細胞凋亡率，提示LncRNA SOX2OT有可能成為肺炎治療的分子靶點。Bax是促凋亡分子，其表達增加促進細胞凋亡；Bcl-2是抗凋亡分子，其表達增加，則阻礙細胞凋亡[14]。本研究結果顯示，下調LncRNA SOX2OT降低了肺炎鏈球菌誘導的HEPApiC細胞中Bax蛋白表達，而促進了Bcl-2蛋白表達，進一步說明下調LncRNA SOX2OT抑制了肺炎鏈球菌誘導的HEPApiC細胞凋亡。

炎癥反應，在肺炎的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，抑制肺泡上皮細胞炎癥反應對肺炎的防治尤為重要。肺泡上皮細胞感染肺炎鏈球菌后，分泌TNF-α、IL-6和IL-10等大量炎性因子，其中TNF-α和IL-6未促炎因子，促進肺泡上皮細胞炎性損傷；而IL-10為抗炎因子，對細胞炎性損傷具有保護作用[5]。本研究結果顯示，下調LncRNA SOX2OT對肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞HEPApiC中IL-6和TNF-α的分泌具有顯著抑制作用，而對IL-10的分泌具有促進作用，說明下調LncRNA SOX2OT抑制肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞炎癥反應，LncRNA SOX2OT可作為減輕肺泡上皮細胞炎性損傷的分子靶點。

LncRNA可發(fā)揮miRNA分子海綿作用調控miaRNA靶基因的表達，進而發(fā)揮生物學調控作用[15]。為了探究下調LncRNA SOX2OT抑制肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞HEPApiC凋亡和炎癥反應的分子機制，本研究證實了LncRNA SOX2OT可靶向結合并負調控miR-146a-5p。研究顯示，miR-146a-5p高表達的社區(qū)獲得性肺炎患者預后優(yōu)于低表達患者，miR-146a-5p可作為社區(qū)獲得性肺炎患者預后判斷的生物標志物[16]。本研究結果顯示，肺炎患者外周血及肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞HEPApiC中miR-146a-5p的表達均下調，上調miR-146a-5p對肺炎鏈球菌誘導的HEPApiC細胞凋亡及炎癥反應具有顯著抑制作用，說明miR-146a-5p對肺炎鏈球菌誘導的HEPApiC細胞具有保護作用，提示miR-146a-5p可作為肺炎治療的分子靶點。此外，本研究還顯示，下調miR-146a-5p逆轉了下調LncRNA SOX2OT對肺炎鏈球菌誘導的HEPApiC細胞凋亡和炎癥反應的影響，進一步提示LncRNA SOX2OT通過靶向負調控miR-146a-5p來影響肺炎鏈球菌誘導的HEPApiC細胞凋亡和炎癥反應，但其具體調控的miR-146a-5p的靶基因還有待探究。

綜上，LncRNA SOX2OT在肺炎患者外周血及肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞HEPApiC中表達上調，而miR-146a-5p表達下調；下調LncRNA SOX2OT可能通過靶向上調miR-146a-5p抑制肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞HEPApiC凋亡和炎癥反應，LncRNA SOX2OT/miR-146a-5p軸可能為肺炎的治療提供了新靶點。