楊新宇 趙琰楓 易俊莉 陳昊 陳雙雙 代小偉 丁北川 孫閃華 李傳友

非結(jié)核分枝桿菌(nontuberculous mycobacteria, NTM)是指除結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和麻風(fēng)分枝桿菌以外的分枝桿菌。由非結(jié)核分枝桿菌引起的疾病稱為非結(jié)核分枝桿菌病。目前，已報(bào)道的分枝桿菌菌種數(shù)量超過190種，但其中只有少部分為條件致病菌[1-2]。

近年來，隨著結(jié)核病的控制取得長足進(jìn)步，非結(jié)核分枝桿菌的問題越來越突出，非結(jié)核分枝桿菌病呈現(xiàn)快速增長的趨勢，我國結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，2010年NTM分離率為22.9%[3]，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于1990年(4.9%)和2000年(11.1%)。NTM主要引起肺部和皮膚的病變，臨床表現(xiàn)與結(jié)核引起的感染十分相似，如果沒有及時(shí)進(jìn)行菌型鑒定，極容易與結(jié)核感染相混淆，被誤認(rèn)為為耐藥結(jié)核而延誤病情。為了解北京市NTM流行情況，筆者收集2019年北京市各級結(jié)防系統(tǒng)NTM臨床分離株進(jìn)行菌種及藥敏鑒定，為科學(xué)制定北京市NTM診療策略提供依據(jù)。

資料與方法

一、 研究對象和實(shí)驗(yàn)材料

1 研究對象 本研究使用的臨床分離株均由北京市疾病預(yù)防控制中心提供，標(biāo)本來源于2019年1月1日至12月31日期間北京市14家結(jié)防機(jī)構(gòu)(北京結(jié)核病控制研究所、昌平區(qū)結(jié)核病防治所、朝陽區(qū)疾病預(yù)防控制中心結(jié)防所、大興區(qū)結(jié)核病預(yù)防控制中心、東城區(qū)疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病防制科、房山區(qū)疾病預(yù)防控制中心結(jié)防所、懷柔區(qū)疾病預(yù)防控制中心結(jié)防科、密云區(qū)結(jié)核病防治所、平谷區(qū)結(jié)核病預(yù)防控制中心、石景山區(qū)疾病預(yù)防控制中心結(jié)防所、順義區(qū)結(jié)核病防治中心、通州區(qū)疾病預(yù)防控制中心結(jié)防所、西城區(qū)疾病預(yù)防控制中心結(jié)防所、延慶區(qū)疾病預(yù)防控制中心結(jié)防所)和6家定點(diǎn)醫(yī)院[豐臺區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院、豐臺區(qū)鐵營醫(yī)院、中國航天科工集團(tuán)731醫(yī)院(豐臺區(qū))、航天總醫(yī)院(豐臺區(qū))、北京老年醫(yī)院(海淀區(qū))、北京京煤集團(tuán)總醫(yī)院(門頭溝區(qū))]分離出的NTM菌株，數(shù)據(jù)涵蓋北京地區(qū)的全部結(jié)防機(jī)構(gòu)(豐臺區(qū)、海淀區(qū)、門頭溝區(qū)結(jié)核病的臨床診療工作由各區(qū)定點(diǎn)醫(yī)院承擔(dān))。

本項(xiàng)目研究資料源于本市16個(gè)區(qū)縣及市結(jié)防系統(tǒng)所有分枝桿菌培養(yǎng)陽性臨床分離菌株，所有區(qū)縣及市結(jié)防機(jī)構(gòu)陽性菌株均交由北京結(jié)核病控制研究所中心實(shí)驗(yàn)室保存，研究已通過北京結(jié)核病控制研究所倫理委員會的審批(倫理批號：202005)。

2 儀器與試劑

(1)分枝桿菌中性羅氏培養(yǎng)基、初步菌種鑒定培養(yǎng)基[對硝基苯甲酸(PNB)500μg/mL]以及比例法所需藥敏培養(yǎng)基(異煙肼(INH)0.2 μg/mL，利福平(RFP)40 μg/mL,鏈霉素(Sm)4 μg/mL，乙胺丁醇(EMB)2 μg/mL，左氧氟沙星(Lfx)2 μg/mL，阿米卡星(Am)30 μg/mL，卷曲霉素(Cm)40 μg/mL，丙硫異煙胺(Pto)40 μg/mL，對氨基水楊酸(PAS)1 μg/mL)均由河南賽諾特生物技術(shù)有限公司提供。

(2)分枝桿菌菌種鑒定試劑盒(PCR-熒光探針法)、雜交儀、芯片洗片機(jī)、掃描儀均由成都博奧晶典生物科技有限公司提供，擴(kuò)增所需PCR儀由杭州博日科技有限公司提供。

(3)分枝桿菌菌種鑒定基因測序送至北京六合華大基因科技有限公司。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1 分枝桿菌菌種鑒定及初步菌群鑒定 實(shí)驗(yàn)方法采用實(shí)驗(yàn)室非結(jié)核分枝桿菌篩查推薦流程[4]，采用表型法進(jìn)行初步菌群鑒定，確定為非結(jié)核分枝桿菌者采用分子生物學(xué)中基因芯片的方法進(jìn)行菌種鑒定，初步菌群鑒定與基因芯片方法不一致的菌株，采用測序的方法進(jìn)行最終鑒定。每名患者只檢測一次，同一年份多次凍存的患者菌株按第一次統(tǒng)計(jì)。

(1)菌群檢測(表型法)：所有菌株鑒定均按照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[5]，使用含PNB羅氏培養(yǎng)管鑒定區(qū)分該菌株屬于結(jié)核分枝桿菌群(MBC)和非結(jié)核分枝桿菌群(NTM)。取初生長4周的分枝桿菌菌株，使用生理鹽水制備成麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)濁度為1mg/mL的菌懸液,經(jīng)稀釋后將終濃度為10-1mg/mL的菌懸液0.1mL接種到含PNB羅氏培養(yǎng)管及對照管(普通羅氏培養(yǎng)基)中，37℃恒溫培養(yǎng)4周，如對照管中分枝桿菌生長良好，則報(bào)告菌群初步鑒定實(shí)驗(yàn)結(jié)果；如果在對照管中沒有生長，則需重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。PNB陰性定為MBC；PNB陽性定為NTM。

(2)菌種檢測(分子生物學(xué)法):① 微陣列基因芯片：將PCR產(chǎn)物置于PCR儀中95℃變性5 min，隨后立即置于冰水混合物中驟冷冰浴3 min；按鑒定試劑盒操作說明書吸取14微升，雜交混合物經(jīng)加樣孔加入芯片點(diǎn)陣中，50℃ 5rpm雜交2h，用SDS、SSC洗液沖洗干凈，甩干后放入芯片掃描儀用專用軟件判讀芯片結(jié)果。②基因測序：兩種方法檢測結(jié)果不同的菌株，經(jīng)傳代分離純化后提取核酸送至北京六合華大基因科技有限公司，對16SrRNA基因測序，測序結(jié)果進(jìn)行 NCBI-BLAST 比對，NCBI 鏈接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/

2 藥物敏感性檢測 按照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[5]采用1%比例法對培養(yǎng)陽性的NTM臨床分離株進(jìn)行抗結(jié)核藥物的藥敏試驗(yàn)。藥物包括四種一線抗結(jié)核藥物和四種二線抗結(jié)核藥物：異煙肼(INH)、利福平(RFP)、鏈霉素(SM)、乙胺丁醇(EMB)、左氧氟沙星(LFX)、阿米卡星(AK)、卷曲霉素(CPM)、對氨基水楊酸(PAS)；若耐藥比例≥1%，則判斷為受試菌對該抗結(jié)核藥耐藥(耐藥百分比=含藥培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)/對照培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)×100%)。

3 質(zhì)量控制

(1)菌種鑒定質(zhì)量控制：①每批菌種鑒定均采用試劑盒自帶陽性對照及陰性對照質(zhì)控品檢測微陣列基因芯片菌種鑒定結(jié)果。②菌群鑒定每年參加國家疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室的室間質(zhì)評，考核成績均為優(yōu)秀。

(2)藥敏試驗(yàn)質(zhì)量控制：①每批試驗(yàn)以結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv 10-3mg檢測含藥培養(yǎng)基質(zhì)量。②若高稀釋度菌液(10-4mg/mL)在對照培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)少于20個(gè)，則重復(fù)試驗(yàn)。③比例法藥敏試驗(yàn)每年參加國家疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室的室間質(zhì)評，考核成績均為優(yōu)秀。

三、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法

應(yīng)用SPSS19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和統(tǒng)計(jì)分析，對NTM組與結(jié)核分枝桿菌(TB)組的暴露因素進(jìn)行單因素分析，計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，并將單因素分析中所有影響因素納入多因素logistic回歸分析模型進(jìn)行分析，計(jì)算對應(yīng)的OR值(95%CI)。P<0.05時(shí)判斷為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、非結(jié)核分枝桿菌分離率及菌種分布

2019年分枝桿菌培養(yǎng)陽性菌株1254株，通過PNB鑒別培養(yǎng)基生長實(shí)驗(yàn)檢出NTM85株，經(jīng)微陣列基因芯片檢測技術(shù)進(jìn)行菌種檢測共鑒定出非結(jié)核分枝桿菌81株(其中1株為“無法判讀”)，4株為結(jié)核分枝桿菌;“無法判讀”菌株經(jīng)基因測序檢測技術(shù)鑒定為慢黃分枝桿菌，4株不一致菌株經(jīng)基因測序檢測技術(shù)鑒定2株為結(jié)核分枝桿菌，1株為測序雜合，1株為鹽單胞菌，共檢出NTM81株，NTM分離率為6.5%(81/1254，95%CI：0.051～0.078)，緩慢生長型占59.26%，快速生長型占40.74%。檢出率前四位的NTM分別為：胞內(nèi)分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、偶然分枝桿菌。81株NTM分布情況如下(見表1)。

表1 2019年非結(jié)核分枝桿菌菌種分布

二、2019年非結(jié)核分枝桿菌流行病學(xué)資料及危險(xiǎn)因素分析

以分離出非結(jié)核分枝桿菌的菌株為因變量，單因素回歸分析中(見表2)，與分離出TB組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)：治療史(初治=0，復(fù)治=1)、年齡(計(jì)量資料)以及報(bào)告區(qū)縣(城區(qū)=0，郊區(qū)=1)采用logistic回歸方程分析非結(jié)核分枝桿菌菌株流行病學(xué)資料的高危因素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：復(fù)治病人、報(bào)告區(qū)縣為城區(qū)將增加對于NTM分離的風(fēng)險(xiǎn)，年齡越大分離出NTM的風(fēng)險(xiǎn)越高(見表3)；從(圖1)可見NTM臨床分離比例較多的區(qū)縣主要集中在城區(qū)。

表2 2019年NTM組和TB組暴露因素的單因素比較[n(%)]

表3 2019年非結(jié)核分枝桿菌臨床分離株的多因素logistic回歸分析

圖1 81例NTM臨床分離株分離率在16個(gè)區(qū)縣的分段設(shè)色圖

三、 NTM臨床分離株不同類型菌種在常用抗結(jié)核藥物中的耐藥情況

經(jīng)表型法進(jìn)行初步菌群鑒定，分子生物學(xué)方法進(jìn)行菌種鑒定后，分離出的81株NTM菌株用比例法對八種抗結(jié)核藥物(INH、RFP、SM、EMB、LFX、AK、CPM、PAS)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，81例NTM對上述八種藥物的耐藥率分別為97.53%、66.67%、91.36%、77.78%、61.73%、69.14%、74.07%、97.53%；其中對于異煙肼和對氨基水楊酸的耐藥率為最高；胞內(nèi)分枝桿菌、鳥分枝分枝桿菌、膿腫分枝桿菌以及偶然分枝桿菌對于四種一線抗結(jié)核藥物均表現(xiàn)出較高的耐藥率，堪薩斯分枝桿菌對于INH、SM以及PAS表現(xiàn)出較高的耐藥率(表4)。

表4 NTM臨床分離株不同菌種對常用藥物的耐藥率

討 論

隨著非結(jié)核分枝桿菌病的增多，NTM病已成為常見病[6]。由于NTM病臨床癥狀的不典型、影像學(xué)表現(xiàn)與結(jié)核分枝桿菌差異不大，容易造成誤診和漏診，又因其對傳統(tǒng)抗結(jié)核藥物耐藥性較高，如果使用抗結(jié)核藥品治療，不但效果不理想[7]，而且容易誤診為耐多藥結(jié)核病，給臨床診斷和治療帶來很大困擾，因此要重視分枝桿菌的菌種鑒定以及患者流行病學(xué)史的調(diào)查。目前，NTM的診斷仍以實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果作為診斷標(biāo)準(zhǔn)，本文NTM分離鑒定流程采用實(shí)驗(yàn)室非結(jié)核分枝桿菌篩查推薦流程[4]，保障了結(jié)果的準(zhǔn)確。

一、NTM分離率及菌種分布

近年來非結(jié)核分枝桿菌病呈現(xiàn)快速增長趨勢，引起了廣泛的關(guān)注。美國NTM肺病的發(fā)病率從2008年的3.13/10萬上升到2015年的4.73/10萬[8]。韓國NTM病的發(fā)病率從2008年的6.0/10萬上升到2016的19/10萬[9]，本次調(diào)查結(jié)果顯示，2019年北京16個(gè)區(qū)縣結(jié)防系統(tǒng)所提供的分枝桿菌臨床分離株中NTM分離率為6.5%，與北京地區(qū)此前報(bào)道的2009年的3.1%[10]相比有了顯著升高；從菌種分布看，本次研究鑒定出的81株NTM中涵蓋了9種菌種，排名前四位的分別為胞內(nèi)分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌和偶然分枝桿菌，此前報(bào)道的2009、2013年北京地區(qū)130株NTM鑒定結(jié)果為胞內(nèi)分枝桿菌的分離率最高(39.2%)，其次為堪薩斯分枝桿菌(37.7)、鳥分枝桿菌(6.9%)、膿腫分枝桿菌(5.4%)和偶然分枝桿菌(3.0%)[11]，本次結(jié)果與以往結(jié)果相比，緩慢生長型比例雖然仍然高于快速生長型，但是從比例分配上來講，快速生長型NTM的比例有了顯著升高，說明北京地區(qū)從以胞內(nèi)分枝桿菌為主，緩慢生長型占明顯優(yōu)勢的格局已經(jīng)發(fā)生改變，其中增長最快的NTM為膿腫分枝桿菌，以往多認(rèn)為NTM為機(jī)會致病菌，水和土壤是它的重要傳播途徑，近年來通過對膿腫分枝桿菌進(jìn)行全基因組測序后，發(fā)現(xiàn)一些肺纖維化患者感染的膿腫分枝桿菌菌株之間存在高度同源性，說明膿腫分枝桿菌可能存在人傳人的可能，應(yīng)引起高度關(guān)注[12]。

二、危險(xiǎn)因素分析

通過對2019年NTM分離株流行病學(xué)資料的危險(xiǎn)因素進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，治療史、報(bào)告區(qū)縣和年齡對于NTM的發(fā)生影響較大，本研究顯示NTM可以發(fā)生在各個(gè)年齡階段，且隨著年齡的增長而增加，一般認(rèn)為有肺部基礎(chǔ)疾病的人群更容易感染NTM[1]，隨著年齡的增長發(fā)生各種肺部疾病的概率會大幅度提高，從而更容易引起NTM的發(fā)生；從治療史上看，復(fù)治病人更容易引起NTM的發(fā)生，分析認(rèn)為NTM在臨床診療過程中容易誤診為TB，且對常規(guī)抗結(jié)核藥物表現(xiàn)出不同程度的耐藥，治療效果多不理想，因而更不容易完全治愈；從地域分布上看，北京市的中東部地區(qū)NTM分離率明顯高于其他地區(qū)，中部地區(qū)為北京市的中心城區(qū)，與郊區(qū)相比人員密度更大，人口數(shù)量更多，隨著NTM病的增多，對于高危險(xiǎn)地區(qū)更應(yīng)引起關(guān)注，但目前區(qū)縣級的結(jié)防機(jī)構(gòu)缺乏NTM的診斷手段，應(yīng)加速區(qū)縣級防治所檢測的普及力度，提高醫(yī)務(wù)人員診斷意識，在NTM高發(fā)地區(qū)加強(qiáng)檢測。

三、NTM的藥物敏感性

多數(shù)NTM對于抗結(jié)核藥物耐藥，本次研究結(jié)果顯示81株NTM對一線、二線抗結(jié)核均有較高的耐藥性，特別是對一線抗結(jié)核藥物耐藥性更高，這與秦中華等報(bào)道的天津地區(qū)339株臨床分離株報(bào)道的耐藥情況基本一致[13]。NTM的藥物敏感性試驗(yàn)?zāi)壳皼]有比較明確的推薦方法，雖然美國臨床與實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(CLSI)對于某些NTM菌種有推薦的藥物及臨界濃度，但這些方法仍有待臨床進(jìn)行評判[14]，大多數(shù)體外藥敏結(jié)果與臨床療效的關(guān)系尚不明確[1]。盡管如此，NTM在治療前仍需要進(jìn)行菌種鑒定，根據(jù)已經(jīng)明確的相關(guān)性，進(jìn)行個(gè)性化化療方案治療。另外，在臨床診療過程中，應(yīng)重視NTM與耐藥以及耐多藥結(jié)核病的鑒別診斷，對于久治不愈的耐藥結(jié)核病患者應(yīng)及時(shí)進(jìn)行菌種鑒定，防止病人漏診、誤診。

綜上所述，北京地區(qū)NTM分離率有顯著增高，隨著快速生長型NTM所占比例的增高，NTM菌種分布由緩慢生長型占絕對優(yōu)勢的格局已發(fā)生轉(zhuǎn)變；北京NTM分離率隨年齡的增長而增加，人口密集地區(qū)分離率較高；鑒于NTM對于絕大多數(shù)抗結(jié)核藥物都耐藥，臨床應(yīng)注意與耐藥結(jié)核病的鑒別診斷，對于耐多藥以及廣泛耐藥的結(jié)核病患者，應(yīng)及時(shí)進(jìn)行分枝桿菌菌種鑒定。